Introduction
대부분의 박테리아 세포는 모두 플랑크톤 (자유 생활)과 성장 (1)의 표면에 부착 (고착) 모드를 사용 할 수 있습니다. 성장면 부착 모드에서, 박테리아 세포는 분비 및 세포 외 폴리머 물질 (EPS) 바이오 필름을 형성하기 위해 다량으로 자신을 싸는. EPS는 주로 단백질, 엑소 폴리 사카 라이드, 세포 DNA로 구성되어 생물막 형성이 필수적이다. 그것은 박테리아가 공간적으로 구별하기 위해 사용하고 유해 환경 조건 및 호스트 응답에서 박테리아를 보호 할 수있는 물리적 발판 역할을한다. EPS의 다른 구성 요소는 크게 생물막 구조 4 개조 할 수 EPS 구성 요소의 표현에 biofilm 형성 (3) 변경에 별개의 역할이있다. EPS 구성 요소는 또한 5 시그널링 분자로서 기능 할 수 있으며, 최근의 연구는 이주 및 생물막 DIFF 안내하는 미생물 세포와 상호 작용하는 특정 EPS 성분을 보여 주었다erentiation 6-8.
EPS에 대한 연구는 크게 EPS 9, 10의 특정 구성 요소에 결함이있는 돌연변이에 의해 생성 된 바이오 필름의 형태 학적 분석을 기반으로 고급. 또한, EPS 보통 매크로 스케일 (벌크 특성) (11)을 특징으로한다. 형태 학적는 평균 값을 반환 생물막의 이질성 내에 존재 세부 사항을 잃고 양적 세부 사항 및 벌크 특성을 결여 할 수 있지만 분석한다. 마이크로 규모 EPS의 정비사 특성의 실시간 특성을 진행하는 경향이 증가하고 지금 있습니다. 이 프로토콜은 입자 추적 microrheology는 녹농균 생물막 (4)의 탄성률과 효과적인 가교에 매트릭스 성분 펠의 시공간 효과 PSL 엑소 폴리 사카 라이드를 결정하는 방법을 설명 할 수있다.
수동 microrheology는 간단하고 저렴한 RH입니다날짜 (12, 13)에 대한 물질의 공간 microrheological 샘플링의 가장 높은 처리량을 제공 eology 방법. 패시브 microrheology에서, 프로브가 샘플 분야에 배치되어 열 에너지 (K B 형 T)에 의해 구동들은 브라운 운동을 비디오 현미경으로 이어진다. 여러 입자를 동시에 추적 될 수 있고, 입자의 시간에 따른 좌표는 종래 랜덤 워크를 따른다. 따라서, 평균 입자가 동일한 위치에 남아있다. 그러나, 변위의 표준 편차 또는 평균은 입자의 변위 (MSD)를 제곱, 0이 아니다. 점성 액체의 흐름 때문에 시간이 진행됨에 따라, 점성 유체의 입자 MSD는 선형 적으로 증가한다. 대조적으로, 중합체 가교 점탄성 검색된 또는 탄성 물질들이 유동 저항 돕고, 입자 MSD 곡선 (도 1a)의 대지에 이어지는, 그 변위에 한정된다. 이러한 관찰은 다음 관계를 MSDαt
입자의 크기, 밀도 및 표면 화학 microrheological 실험 올바른 응용에 중요하다 (이 경우에 생물막의 매트릭스 폴리머는,도 1b 참조)를 조사 시스템에 대해 선택된다. 우선, 입자는 입자 자체보다 훨씬 작은 구조를 갖는 물질의 레올로지를 측정한다. 물질의 구조는 입자, 파의 움직임과 유사한 규모의 경우ticle는 개별 구조의 형상 및 방향에 의해 교란된다. 그러나 입자를 둘러싸는 구조가 매우 작은 경우,이 효과는 작고, 입자 (도 1b)에 균일 한 환경을 제시하고, 평균화. 둘째로, 입자의 밀도는 침강이 방지 및 관성력 무시할되도록 (수성 매체 1.05 g 용액 -1) 매체와 유사 할 것이다. 폴리스티렌 그릴 대부분의 입자는 위의 기준을 충족. 운동은 물질의 구조와 열 에너지와의 충돌에 의해 구동, 임의의 경우 입자 MSD의 유변학 적 해석에만 유효 이상적으로, 입자는 바이오 필름 매트릭스의 폴리머와 상호 작용하지 않습니다. 이것은 프로브 입자가 결합하거나 미리 성장한 생물막의 표면에서 반사하는 경향이 있는지 여부를 확인함으로써 관찰 될 수있다. 그러나, 바이오 필름에 인력의 부족에도 불구하고, 입자가 매트릭스에 혼입 될 수 있어야한다.또한, 바이오 필름의 물리 화학적 이질성은 다른 입자가 생물막의 다른 지역에서 프로브로서 더 적합하다 발생할 수 있습니다. 따라서, 다른 크기 및 표면 화학의 입자는 생물막에 적용되어야한다.
이와 같이, 입자는 MSD 성분 유 동학에 기여 생물막의 확산 방법에 관한 다른 유용한 정보를 제공 할 수있다. 또한, 다른 프로브의 사용은 하나의 생물막의 공간 물리 이질성에 대한 정보를 도출 할 수있다. 이 방법은 바이오 필름의 기계적 특성이 다른 종의 도입에서 변경되는 방법을 조사하기 위해 혼합 종 생물막으로 생물막의 기계적 특성에 영향 항균 처리를 테스트하는 데 사용되는, 또는 적용 할 수있다. 입자 근골격계 질환은 생물막 분산의 특성을 유용 할 수 있습니다. 이러한 연구는 잠재적으로 생물막 처리 개선, 바이오 필름에 대한 우리의 이해에 도움이 될 것입니다유용한 활동을위한 생물막의 차 엔지니어링.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 바이오 필름 재배
- 균주의 제조
- 일일 사전 생물막 재배, 냉동 세균성 문화에서 적절한 성장 배지 2 ㎖를 접종하여 플랑크톤 세균 문화를 준비합니다. 점액 P.에 대한 루리아 - 국물 매체 (10g의 L -1의 NaCl, 10g L -1 효모 추출물 및 10g의 L -1 트립 톤)를 사용하여 녹농균과 Δ의 화소와 Δ의 PSL 결함이있는 돌연변이. 37 ° C에서 200 rpm으로 진탕 조건에서 밤새 품어. 분광 광도계를 사용하여 OD 0.40 600 밤새 배양을 희석.
- 바람직하게는 분해하지 않고 플로우 셀을 이미징 현미경 실하게 될 수 이동국 또는 트롤리에 앞서 14 설명한 플로우 셀 설정을 조립한다.
- 2 L 또는 각 플로우 셀에 대한 5 L 병에 무균 성장 매체를 준비합니다. 최소 배지 (M9) (48 mM의 나 2 HPO 4, 22 mM의 사용KH 2 PO 4, 19 mM의 NH 4 CL, 9 밀리미터의 NaCl, 2 mM의 황산, 그리고 피에 대한 0.04 % 포도당 (중량 / 부피)와 0.2 % (중량 / 부피) 카사 미노산) 보충 0.1 mM의 염화칼슘 2) 녹농균 세포 생물막을 흐른다.
- 마이크로 원심 튜브로 나누어지는 형광 마이크로 스피어와는 9,391.2 g에서 원심 분리기에서 5 분 2 O 멸균 H에 스핀 다운. 이전에 2 L 5 L 매체 병의 성장 매체에 추가로 아 지드 화 나트륨 (소독제)를 제거하기 위해 1 ml의 성장 매체에 뜨는 및 재현 탁를 제거합니다.
참고 : 마이크로 스피어의 다른 크기가 서로 다른 농도로 와서 지침에 따라 희석되어야한다. 예를 들어, 2.18 × 106 미세 ml로 -1 각각의 입자 크기를 수득하기 위해 1.0 ㎛의 직경의 미립자의 120 μL, 0.5 μm의 직경 미립자의 15 ㎕의 성장 배지 2 L에 0.2 μm의 직경 미소 0.96 μL를 분산. - upst 중간 병에 연결흐름 셀의 묶음과 성장 매체 전체 설치를 통과 할 수 있습니다. 흐름을 중지하고 흐름 세포 챔버로 희석 하룻밤 문화를 주입. 박테리아는 약 5.5 × 10 -3 m 초 -1, 또는 연동 펌프 8 rpm의 유량으로 성장 매체의 흐름을 계속하기 전에 1 시간 동안 커버 슬립을 기질에 부착 할 수있다.
참고 : 바이오 필름은 일반적를 3-7 일 동안 실온 (25 ℃로)에서 재배되고 있습니다. - 대안으로, 정적 배양 셋업, 입자 1 ml의 성장 배지로 하룻밤 배양의 10 μl를 첨가하여 하룻밤 배양을 마이크로 원심 튜브에 100 배 희석. 유동 생물막 사용에 비해 약 500 배 정적 배양 용 성장 배지에서의 입자 농도를 증가 (예를 들어 세척 및 성장 배지 10ml에 1.0 μm의 직경 분야의 600 μl를 재현 탁) 지속적으로 보충되는 유동 셀 생물막로서 입자하지만 정적 인 문화가 아니다.
- 200 추가1 8 잘 슬라이드의 챔버에 입자로 희석 하룻밤 문화의 L. 정적 인 상태에서 37 ° C에서 품어. 바이오 필름은 일반적으로 1 일 동안 성장하고 있습니다. 바이오 필름이 하루 이상 재배하는 경우 입자 신선한 성장 매체 매일 소모 된 성장 매체를 교체합니다.
2. 현미경
- 3 일, 5 일, 연동 펌프에서 흐름을 끄고 현미경 방으로 흐름 전지 설치를 가져온다. 플로우 셀 챔버의 입구 및 출구 부근 클램프 튜브 드리프트 흐름 (환경 변화에 대한 체계적인 에러 원인)을 방지 할 수있다. 직립 현미경의 현미경 무대에 흐름 세포를 놓습니다.
참고 : 마이크로 웰의 이미징 거꾸로 현미경을 사용합니다. - 다양한 위치 (microcolonies 및 평면 미분화 층)에서 바이오 필름에 포함 된 미세 운동의 비디오와 다른 일 (3 일 및 5)에 대한 응시 40X 오일 목적으로 형광 현미경을 사용하여시간과 공간의 조사. 짧은 시간 규모 내에서 발생하는 사건을 조사하기 위해 더 높은 프레임 속도로 짧은 비디오를 찍기 (예 : 25-50 빠른 역학에 대한 초당 프레임의 프레임 속도에서 1.5-3 분 동영상), 낮은 프레임 속도와 더 이상 비디오는 긴 시간에 걸쳐 사건을 조사하기 위해 저울 (2.5-5 프레임 / 느린 역학 삼성 전자의 프레임 속도로 예를 들어 15 ~ 30 분 동영상).
참고 : 비디오는 일반적으로 5-10 입자를 포함하고, 파일 크기가 일반적으로 1.0-2.5 기가 바이트입니다. 큰 microcolonies 더 많은 입자를 보유 할 수있다. 각 범주에 대한 5-10 동영상 (다른 microcolonies의 평면 미분화 층에서 서로 다른 위치의 예를 들어 5-10 비디오를) 가져 가라. 바이오 필름은 microcolonies, 채널, 빈 공간과 평면 미분화 층으로 구성 될 수있다 이종 구조를 가지고있다. - 피지 / ImageJ에 읽을 수있는 적절한 형식의 비디오 (예를 들어 czi, TIF)를 저장합니다.
- 완성 된 VID를 통해 스크롤하여 드리프트에 대한 동영상을 확인EO와 입자가 동시에 동일한 방향으로 이동하지 않는 것이 관찰. 드리프트 Z 스테이지 동작, 플로우 셀의 전류, 진동 방지 테이블, 공기 압력 또는 온도 변화의 불균형에 의해 야기 될 수있다. 올바른 마이너 보통 현미경 소프트웨어와 함께 제공되는 포스트 - 프로세싱 기술을 사용 표류. 드리프트가 해결 될 수없는 것을 특징 비디오를 폐기하십시오. 입자 추적 분석시 필요한 다음 매개 변수를 녹음 해상도 (PX / 음), 프레임 수, 시간.
- 현미경 단계에서 유동 세포를 제거하고 바이오 필름을 배양 계속 연동 펌프를 다시 시작합니다.
3. 입자 추적 분석
- 오픈 소스 소프트웨어 (ImageJ에)에 플러그인 TrackMate을 사용하여 입자의 궤적을 얻습니다. 피지 다운로드 http://fiji.sc/Fiji . 피지와 플러그인 메뉴에서 비디오를 열고, 추적 및 TrackMate을 선택합니다.
- 확인하거나 일에 설정을 조정단계 2.4에 기록 된 영상 파라미터와 일치하도록 보정 초기 설정을 제안하는 전자 창.
- ImageJ에를 사용하여 TrackMate에서 입자를 감지합니다.
- (예, 000) '로그 검출기', 입력 입경과 임계 값을 선택한다. 보라색 원이 비디오에 걸쳐 입자를 따르는 것이 확인 '미리보기'버튼을 클릭하는 동안 영상을 스크롤합니다. 필요에 따라 직경 및 임계 값 조정 : 퍼플 원이 빈 공간에 표시하는 경우의 임계 값을 증가시킨다. 충분한 입자가 검출되는 경우에 상기 임계 값을 감소시킨다. 검출을 입자를 완료하기 위해 다음 버튼을 클릭합니다.
- 추가 또는 '초기 임계'에서 검출 된 입자를 제거, '보기 선택'초기 입자 검출 만족 인 경우 창 조정하지 않고 계속 '필터 선택'을 할 수있는 옵션이 표시되면 다음 버튼을 클릭합니다.
- OPTI에서 '단순 LAP 추적기'를 선택입자가 거의 생물막에 초점이 이동하지 쉽게 추적으로의 줄에 창 '추적 방법을 선택합니다'. 제안 또는 낮은 연결과 격차 폐쇄 최대 거리 값을 사용하고 다음을 클릭합니다.
- 그 입자 추적 입자가 TrackMate에 의해 그려진 트랙을 따라야하고, 원치 않는 또는 누락 된 트랙이 없는지 확인하기 위해 비디오를 스크롤하여 만족 확인합니다. 다양한 필터링 단계를 건너 뜁니다. '작업 선택'마지막 창으로 이동합니다. 드롭 다운 메뉴에서 'XML 파일로 내보내기 트랙'을 선택하고 '실행'을 클릭합니다. 트랙을 저장할 폴더를 선택합니다.
참고 : 입자의 궤적과 microrheology의 사용 분석을위한 공공 영역에서 사용할 수있는 다양한 프로그램이 있습니다. msdanalyzer과 TrackArt는 매트랩 환경에서 실행 입자 추적 분석 프로그램의 예입니다.
- 의 메뉴에서 선택하여 XML 파일의 입자의 궤적을 가져 matlab에 준비MATLAB 파일> 설정 경로 ... 그리고는 스크립트가 피지 패키지와 함께 사용할 수 폴더를 추가 할 수 있습니다.
- msdanalyzer와 입자의 궤적을 분석하기 위해, 압축 파일 또는 tar.gz 파일에 대한 링크를 다운로드 at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- @msdanalyzer 폴더 (15)를 추출하고 matlab에 경로에 속하는 폴더에 드롭 (예 : C : Documents and Settings <사용자 이름> 내 문서 matlab에를 ). matlab에를 시작하고 입력하여 분석을 시작합니다 :
엄마 = msdanalyzer (2, '음', '초')
UM 및 초 비디오에서 현실 공간과 시간 단위한다.- 입력하여 입자의 궤적을 가져옵니다
[트랙, MD] =의 importTrackMateTracks ( 'FileName.xml', 'clipZ';, 'scaleT')
엄마 = ma.addAll (트랙);
여기서 'clipZ'는 Z의 2D 비디오의 차원, 그리고 'scaleT'을 제거합니다. - 그래프를 사용하여 위에 궤적을 그린다 :
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - 사용하여 입자의 MSDS (물질 안전 보건 자료)를 계산한다 :
엄마 = ma.computeMSD;
ma.msd - 각 입자의 MSDS (물질 안전 보건 자료)를 플롯 :
그림
ma.plotMSD - ) 3.5.1.4에 3.5.1.1를 반복하여 (3 일에서 야생형 microcolonies에 포함 된 예를 들어 입자) 다른 같은 categery의 비디오에서 입자의 궤적을 결합합니다.
- 앙상블 평균 또는 모든 곡선의 평균 플롯 :
ma.plotMeanMSD
로그 스케일로 선형에서 y 축과 x 축으로 변경합니다. 긴 지연 시간에, MSD 곡선으로 인해 더 이상 시간 척도에서의 불충분 한 통계에 잡음이된다. MSD 곡선는 또한 동적 오류로 가파르게 상승 할 수있다. 곡선의 이들 영역은 브러시 툴을 사용하여 제거 할 수있다> 곡선의 끝을 선택하고 선택 '칫솔질'도구 메뉴에서 'Unbrushed 제거'.
- 입력하여 입자의 궤적을 가져옵니다
- 에 Ezyfit 다운로드 http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ 및 matlab에 경로에 속하는 폴더에 Ezyfit를 추가 (예 : C : Documents and Settings <사용자 이름> 내 문서 matlab에를 ). efmenu 설치 matlab에 작업 공간에 입력하여 Ezyfit 메뉴를 설치합니다. 그림 창에서 Ezyfit 메뉴를 MATLAB를 다시 시작합니다. Ezyfit 메뉴 '쇼 맞추기'> '전원'> '* X ^ N'에서 선택하여 전원 법에 MSD 곡선에 맞는 n은 추정 확산 지수 (α)입니다했다.
참고 : msdanalyzer는 MSD 곡선 피팅을위한 매트랩 도구 상자를 피팅 곡선을 필요로한다. Ezyfit 커브 피팅을 수행 할 수있는 다른 무료 소프트웨어입니다. - 지우기 현재 입자의 궤적과 근골격계 질환은 다른 지역 또는 시간에 새로운 입자 MSDS (물질 안전 보건 자료)를 계산합니다 :
맑은 다양한 평균 MSD 매체 (제어) 입자의 곡선, 그리고 microcolonies 다양한 균주의 미분화 지역, 복사 비교를 위해 하나의 그래프에 곡선을 붙여 계산 한 후. 샘플 강성과 낮은 MSD 값으로 가교 증가. 평면 곡선은 낮은 α를 가지고 샘플은 높은 α와 가파른 곡선보다 더 탄성이다. - 커브를 선택 및 중간 및 범위 등의 데이터 통계를보고 "도구"로 이동합니다. 비드 MSD는 크리프 컴플라이언스에 비례, J 비드 관계에 따라서 매립 된 물질 (t),
여기서 J = 크리프 준수, D = 입자 직경, 케이 B = 볼츠만 상수, T = 온도 T = 시간.
- @msdanalyzer 폴더 (15)를 추출하고 matlab에 경로에 속하는 폴더에 드롭 (예 : C : Documents and Settings <사용자 이름> 내 문서 matlab에를 ). matlab에를 시작하고 입력하여 분석을 시작합니다 :
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
보이드 (바이오 필름 위의 매체), 평원 (세포의 미분화 평면 층) 및 microcolonies (그림 2A의 라벨 참조)에 포함 된 바이오 필름의 다른 지역에서 바이오 필름의 로컬 점탄성 특성을 조사 하였다. 일에서 성숙하는 동안 바이오 필름의 점탄성 특성의 시간적 변화는 3-5도를 측정 하였다. 보이드의 입자 MSD 순수한 매질 입자 MSD에 제어 및 비교로서 사용 하였다. 반면, 생물막에 갇혀 입자가 고정 된 위치에서 진동과 MSD 값은 점탄성 물질의 전형적인 그 강하게 탄성 젤에게 (그림 3)에서였다.
점액 P. aeruginosa의 야생 유형과 Δ 펠 돌연변이 균주 (그림 2A와 2B)는 자신의 바이오 필름에 3 일에 의해 얇은 일반에 흩어져 microcolonies을 개발했다. 3 일에 일반은 너무 얇았다유변학 적 특성의 조사. 점액 (P)에 의해 형성 모두 생물막에서 시간이 microcolonies 탄성했다 나타내는 10 초 (α = 0), 0.1 초 지연에 대한 aeruginosa의 야생형과 Δ의 화소 균주는 3 일 microcolonies에서 입자의 MSD (그림 4, 표 1) 시간의 독립이었다 . 해당 입자 근골격계 질환에서 계산 된 평균 크리프 컴플라이언스 -2 4.3 × 10 있었다 아빠 -1 3.6 × 10 -2 아빠는 각각 -1. 5 일 점액 (P)의 microcolonies의 크리프 준수하여 aeruginosa의 야생형 균주는 매트릭스 내에 효과적인 가교 결합의 감소를 나타내는 -1 파 2.5 × 10 -1로 증가 하였다. 5 일 microcolonies는 여전히 점액 P.에 일에서 유동성에 3 ~ 5 평야를 변경하지 않은 α = 0 Δ의 화소와 탄성했다 aeruginosa의 야생형 및 Δ 펠 균주 미이었다탄성 LAR (α = 0)과 성숙 (미분화 구조)의 반사 수 3 일 microcolonies, 효과적인 가교.
Δ PSL 돌연변이 균주 (그림 2C)에 의해 형성된 바이오 필름은 덜 차별화 된 개발이 지연되었다. 이 날 3. MSD 값 이후 microcolonies을 개발 두꺼운 평야와 생물막 결과 바이오 필름은 피보다 훨씬 효과적으로 가교 것으로 나타났다 aeruginosa의 야생형 및 Δ 펠 균주 (도 4, 표 1). 평야는 α로, 점탄성했다 = 0.12 및 0.26 일 3에서 5를 각각. 3 일, 5 평야의 중간 크리프 준수 1.0 아빠 -1. microcolonies는 5 일에서 개발했을 때, 크리프 준수 임계 가교가 microcolony 차별화 필요하다는 것을 나타내는, 2.8 × 10 -1 아빠 -1로 감소했다. HoweveR, 크리프 준수 젊은 3 일 점액 (P)의 크리프 준수보다 여전히 더 컸다 aeruginosa의 야생형과 Δpel의 microcolonies. 5 일 microcolonies는 α = 0.34와 점탄성했다. 따라서, P. aeruginosa의 생물막은 탄성과 펠의 부재에서 높은 가교이다. PSL의 부재 하에서, 생물막은 점탄성 덜 가교 결합되었다. 같은 microcolonies으로 성숙 생물막 구조에서, 펠과 PSL 엑소 폴리 사카 라이드 모두의 발현은 시간이 지남에 따라 별개의 유변학 적 차이의 결과. 가교의 감소는 성숙하는 동안 생물막 매트릭스 화소 엑소 폴리 사카 라이드에 PSL의 감소로 인해 수 있습니다.
그림 1 :. 바이오 필름의 입자 추적 microrheology (A) 그레이 원 입자 MSD는 시간에 따라 선형 적으로 증가하는 점성 물질에 묘사α = 1. 검은 삼각형은 바이오 필름의 EPS에 진동 프로브 입자의 시간 = 0 (B)의 독립적 인 탄성 물질의 입자 MSD 다이어그램을 묘사. 입자는 박테리아 세포처럼 모델링 직경 유사하다. 입자를 감싸 매트릭스 중합체 입자보다 훨씬 작다.
그림 2 : P의 erspecti의 V E와 D의 W 전자 VI 단면 Y 5 생물막 (녹색), B y를 사기 F OCAL의 microsco P는 Y 콘티 N uous 후 < 강한> (보라색) 1.0 μ M, 0.5 μ M (적색) 및 0.2 μ M로 eeding F (오렌지) PA의 R은 음으로 대전 카르 표면 ticles. 바이오 필름 (A) 점액 P. 형성 녹농균 및 돌연변이 체 (B)의 화소와 Δ (C) Δ PSL 균주. 입자는 바이오 필름의 모든 지역에 포함된다. microcolonies, 평원과 빈 공간의 예는 (A)에 표시되어 있습니다. 씹어의 등., mBio 2014에서 수정 된 4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
fig3.jpg "/>
그림 3 :. 성장 배지에서 브라운 운동을 실행하는 입자의 트랙의 입자 궤적 비교 (여러 가지 빛깔) 생물막 microcolonies (진한 파란색)에 진동 입자의 트랙에 비해. 분할 된 색상은 Z 평면에서 초점이 이동에 의한 입자에 추적에서 휴식을 나타냅니다.
그림 4 :. 생물막 1.0 μm의 입자의 근골격계 질환 점액 P. 녹농균은 탄성과 microcolonies은 5 일 3 일부터 시행 가교 감소된다 Δ의 화소는 신축성이 3 ~ 5 일에서 유동성에 변경되지 않습니다; Δ의 PSL은 점탄성이며 주로 3-5 일에서 유동성에 크게 변경하지 않는 평야로 구성되어 있습니다.
| 변형 | 일 | 지역 </ TD> | 중간 크리프 준수 (파 -1) |
| 야생형 | 삼일 | Microcolony | 4.3 × 10 -2 |
| 야생형 | 오일 | Microcolony | 2.5 × 10 -1 |
| 야생형 | 오일 | 평원 | 4.1 × 10 -2 |
| Δpel | 삼일 | Microcolony | 3.6 × 10 -2 |
| Δpel | 오일 | Microcolony | 3.6 × 10 -2 |
| Δpel | 오일 | 평원 | 3.2 × 10 -2 |
| Δpsl | 삼일 | 평원 | 1.0 × 10 0 |
| Δpsl | 오일 | 평원 | 1.0 × 10 0 |
| Δpsl | 오일 | Microcolony | 2.8 × 10 -1 |
표 1 : 중간 크리프 컴플라이언스 및 야생형의 추정 확산 지수와 생물막 연령과 지역에 따라 돌연변이 균주.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microrheology는 미생물 바이오 필름 등의 이기종 시스템, 로컬 유변학 적 측정을위한 유용한 도구입니다. 그것은 여러 시간 지점 위에 동일한 생물학적 샘플 내의 유동 학적 변화를 실시간으로 모니터링 할 수 있도록, 비파괴 기술이다. 이 프로토콜에서, 입자 추적 microrheology 그들이 탄성 생물막 매트릭스의 가교 효과에 미치는 영향을 조사하기 위해 펠 PSL 엑소 폴리 사카 라이드 및 돌연변이에 적용 하였다. 펠 점탄성 및 패자 생물막을 선호하는 반면 PSL 높은 효과적인 가교 탄성 생물막의 개발을 선호. 모두 엑소 폴리 사카 라이드가 생성되는 경우, 생물막 microcolonies 덜 효과적으로 펠 이상 PSL의 감소와 일치, 생물막이 성숙 가교된다.
다른 종의 박테리아에 의해 형성된 생물막은 별개의 EPS 조성이 있습니다. 점액 (P)의 EPS 주로 consi 본 연구에 사용 된 aeruginosa의 균주 엑소 폴리 사카 라이드 (16)의 STS. 다른 종은 큰 세포 접착 단백질 EPS 자신의 주요 구성 요소로 (17)와 DNA (18)를 사용할 수 있습니다. 여기에 기재된 방법은 다른 유동 학적 EPS 성분의 기여도 및 성장에 미치는 영향을 결정하기 위해 사용될 수있다. 또 다른 셋업에서 성장 생물막은 리올 로지에 영향을 완전히 다른 물리적 특성을 가질 수있다. 예를 들어, P.를 점액 녹농균은 포도당 정적 조건에 비해 흐름에 따라 차별화 된 구조와 더 생물막을 형성 보충. 연구는 또한 흐름이 생물막 더 응집력과 19, 20 탄성 만드는 등 바이오 필름이 전단 응력에 노출 된 것으로 나타났습니다. 다음과 같이 중요한 단계 및 요인은 성공적인 바이오 필름 입자 추적 microrheology 연구에 대한 고려 :
시간과 공간에 대해 조사 나 관심 스케일 시스템 규격
콘텐츠 "공간 규모를 고려할 때>, 하나의 시스템의 점탄성 특성을 야기 할 구조물의 크기 고려해야 (우리의 경우는, 생물막 행렬의 중합체). 프로브 입자를 둘러싸는 중합체 훨씬 작아야 입자보다 구조 및 고해상도 영상은 작은 입자 운동 또는 진동을 포착 할 필요가있다. 입자에 등방성 환경을 제시하지만, 느린 나타낸다. 시간적인 스케일을 고려하여, 탄성 생물막 등가 파일 크기 묘화 영역의 양을 줄일 역학 적절한 사용. 더 높은 프레임 속도 (초를 millisec) 긴 시간 규모 (예 : 시간)에 걸쳐 비디오 촬영 및 프레임 속도를 사용하여 (예 : 분). 짧은 동영상이 빠른 역학과 점탄성 생물막 (분)에 대해 수행 할 수 있지만, 필요 필요 파일을 유지할 해상도, 프레임 레이트, 각 실험을위한 비디오 기간은 취급 용이 한 분석을 위해 낮은 크기.바이오 필름의 점탄성, 그는terogeneity 및 치수
입자의 움직임은 매우 탄성 생물막 (MSD <10-4)에서 발견 할 수있다. 이러한 경우에, 입자를 변위시키는 힘을 활성 microrheological 기법이 바람직하다. 바이오 필름의 다른 지역의 유변학 적 샘플링은 바이오 필름의 기계적 이질이 캡처 수 있도록해야한다. 이종 형태는, 그러나, 균일 한 외관에도 불구 생물막이 레올 복잡한 수있는 바와 같이, 반드시 기계적 이질의 좋은 지표 아니다 : Δpsl 생물막 더 형태에서 균일하고 분화 지연이지만 복잡한 이종 유변학 적 프로파일을 가지고있다. 반면, Δpel의 바이오 필름은 잘 분화 된 microcolonies와 이종 외관하지만 바이오 필름을 통해 일정한 유동성을 가지고있다. 큰 microcolony 크기 (예 :> (50)의 직경과 높이 μm의)가있을 수 있습니다 의미의와 바이오 필름의 경우tudy microcolony 가장자리에서 높이 (상단 및 microcolonies의 바닥), 또는 거리에 따라 유동 학적 차이.
프로브 입자의 선정
전술 한 바와 같이, 입자의 크기는 그것의 점탄성 특성을 야기 할 물질의 구조보다 커야한다. 또한, 다른 표면 화학을 가진 입자는 바이오 필름 내에서 다른 지역과 EPS 구성 요소에 결합 될 수 있습니다. 그 생물막 이질성이 고려 될 수 있으므로, 따라서 다른 표면 화학을 가진 입자의 효과를 탐구한다. 모든 프로브 입자의 응집을 최소화하기 위해 높은 제타 전위를 가져야한다. 함께 결합 된 입자는 정확한 프로브로서 사용될 수 없으며 분석에서 제외한다.
드리프트의 최소화
드리프트는 온도 나 기압 변화 (일반적으로 Z 방향) 현미경 스테이지 이동, 안티 V에 의해 야기 될 수있다ibration 테이블 불균형 및 시스템의 내부 흐름. 품으로는 일반적으로 입자와 α의 장애물 슈퍼 방산에서> 1. α> 1 열 에너지보다 활성 프로세스가 참여 움직이는 입자 및 수동 microrheology은 다른 적용 할 수없는 것을 나타냅니다 결과.
적절한 생물막 문화의 유지 보수
유동 세포가 제대로 누출을 방지하고 조립해야 생물막 오염으로부터 자유로운 유지되어야한다. 바이오 필름은 또한 정적 배양 조건 슬라이드와 같은 마이크로 웰, 플로우 셀에 다른 설정 대안으로 성장시킬 수있다. 도립 현미경은 마이크로 웰의 촬상을 위해 사용되어야한다.
요약하면, 입자 추적 microrheology는 생물 실험실 표준 현미경을 사용하여 사용될 수있는 유용한 기술이다. 또한, 계산 및 입자 근골격계의 분석에 관련된 프로그램은 공공 영역에서 쉽게 사용할 수 있습니다.예를 들어, msdanalyzer 및 TrackArt 21 (들어 http://www2.sbs.ntu.edu.sg/staff/rskraut/index.php/trackart ) 매트랩 환경에서 실행되는 프로그램입니다. 기술은 입자를 이동 열 에너지에만 의존하기 때문에, 더 높은 탄성 샘플 사이 확인할 수 없습니다. 자기 협 지부 활성 기술은, 행동 및 샘플 내에서 이동하는 입자에 힘을인가하고 고탄성 샘플 점탄성을 결정할 수있을 것이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 연구는 우수 프로그램의 연구 센터에서 교육 싱가포르 국립 연구 재단과 교육부에 의해 지원, 스타트 업 보조금 난양 기술 대학 (M4330002.C70), 및 AcRF 계층 2 (MOE2014-T2-2-172) 교육부, 싱가포르. 저자는이 프로토콜의 데모에 참여 조이 참마 Kuok Hoong 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 ml | Terumo | ||
| 27 G Needle | Terumo | ||
| 2 L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Flemming, H. C., Wingender, J.
- Yang, L., et al. Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).
- Chew, S. C., et al. Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides. mBio. 5 (4), (2014).
- Irie, Y., et al. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).
- Zhao, K., et al. Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 497, 388-391 (2013).
- Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).
- Yang, L., et al. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).
- Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract. J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).
- Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).
- Waigh, T. A.
- Wirtz, D. Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells. J Vis Exp. , e2383 (2011).
- Tarantino, N., et al. TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures. Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).
- Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms. Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).
- Qin, Z., et al. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Stoodley, P., et al. The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms. Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).
- Jäger-Zürn, I., Grubert, M. Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls. International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).
