Os microRNAs humanos se translocam dos eritrócitos hospedeiros para os parasitas Plasmodium falciparum. Aqui, as técnicas usadas para transfectar microRNAs sintéticos em eritrócitos hospedeiros e isolar todos os RNAs de P. falciparum são descritas. Além disso, este artigo detalhará um método de isolamento de polissomos em P. falciparum para determinar a ocupação ribossômica e o potencial translacional de transcritos do parasita.
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Artigo de método
Métodos para investigar o papel de Regulamentação dos Pequenos RNAs e Ribosomal Ocupação de
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A variação genética responsável pelo alelo falciforme (HbS) permite eritrócitos para resistir à infecção pelo parasita da malária, P. falciparum. A base molecular da resistência a este, que é conhecida por ser multifactorial, permanece incompletamente compreendida. Estudos recentes descobriram que a expressão diferencial de microRNAs de eritrócitos, uma vez translocados em parasitas da malária, afetar tanto a regulação gênica e crescimento do parasita. Estes miARNs foram posteriormente mostrados para inibir a tradução do ARNm através da formação de um transcrito de ARN quimérico através de 5 'do RNA de fusão com subconjuntos discretos de mRNAs do parasita. Aqui, as técnicas que foram usadas para estudar o papel funcional e putativos mecanismo microRNAs eritrócitos subjacentes na regulação gênica e potencial translacional de P. falciparum, incluindo a transfecção de microRNAs sintéticos modificados em eritrócitos de acolhimento, serão detalhados. Por fim, um método de gradiente de polissoma é usado para determinar a extensão da TRAnslation destes transcritos. Juntas, essas técnicas nos permitiu demonstrar que os níveis desregulados de microRNAs eritrócitos contribuir para a célula-intrínseca resistência da malária dos eritrócitos falciformes.
Introdução
A malária, causada por parasitas apicomplexan do gênero Plasmodium, é a doença parasitária humana mais comum, infectando mundialmente cerca de 200 milhões de pessoas por ano e causando cerca de 600.000 mortes 1. Dos cinco espécies de Plasmodium que infectam os humanos, o mais relevante para a doença humana são P. falciparum e P. vivax, devido às suas distribuições generalizadas e potencial para complicações graves de malária. O ciclo de vida do parasita da malária requer infecção de ambos os mosquitos e seres humanos. Quando um mosquito infectado pica um humano, os parasitas viajar através da corrente sanguínea para o fígado, onde uma rodada inicial de replicação ocorre. Depois merozoites ruptura do hepatócito hospedeiro, infectam os glóbulos vermelhos próximos, quer iniciar a replicação assexuada ou sexual. A fase assexuada de replicação, que dura 48 horas em P. falciparum, é o foco deste estudo, uma vez que é a fonte da maior parte malsintomas Aria e é facilmente recapitulou in vitro.
Embora uma série de iniciativas de saúde pública, incluindo as terapias anti-malária melhoradas, ter um pouco reduzido o fardo do paludismo a nível mundial, o surgimento contínuo de parasitas resistentes aos medicamentos constitui um problema para os esforços de controle da malária. Uma área que pode sugerir novas abordagens terapêuticas é o estudo sobre como as várias variantes genéticas conferem resistência à malária. Em regiões endêmicas de malária, uma variedade de polimorfismos eritrocitários são bastante comuns 2,3. Estas mutações, com falciforme sendo talvez o mais importante, estão muitas vezes associados com substancial resistência ao aparecimento de infecção por malária sintomática 4. Os mecanismos subjacentes pelo qual eles causam eritrócitos para resistir à infecção da malária são completamente compreendidas. Eritrócitos parasitados com mutações da hemoglobina estão sujeitos a fagocitose aumentada através de uma maior rigidez celular e desidratação, queestá associada à diminuição invasão pelo P. falciparum 5. O alelo HbC também afecta a expressão da proteína na superfície do eritrócito e com a remodelação do citoesqueleto, inibindo a continuação do desenvolvimento do parasita 6,7. Finalmente, P. falciparum cresce pouco dentro de foice homozigoto (HbSS) 8,9 eritrócitos in vitro, sugerindo fatores eritrocitários intrínsecas de resistência da malária. No entanto, embora todos esses mecanismos parecem desempenhar um papel, eles não explicar completamente os mecanismos de resistência das células falciformes trás para a malária.
Um conjunto de fatores eritrocitários potencial que continuam a ser mal compreendido é a grande piscina de miRNA presentes dentro de eritrócitos maduros. MicroRNAs são pequenos RNAs não-codificantes, 19-25 nt de tamanho, que medeiam a tradução e / ou estabilidade de mRNAs alvo por emparelhamento de bases dentro da UTR 3 '. Eles têm sido implicados no controlo de respostas imunitárias de mamíferos, incluindo a supressão óf replicação do vírus 10, e foram exibidas para conferir resistência a vírus em plantas Eles também têm sido mostrados para regular vários processos, incluindo a eritropoiese eritrocitárias 11,12 e metabolismo do ferro 13. Estudos anteriores identificaram uma população abundante e diversificada de miRNAs eritrocitários, cuja expressão foi alterada drasticamente nos HbSS eritrócitos 14,15. Desde eritrócitos maduros falta de transcrição e tradução activo, o papel funcional destas miARNs eritrocitárias permanece obscura. Como material de troca significativa ocorre entre a célula hospedeira e P. falciparum durante o ciclo de desenvolvimento intraerythrocytic (IDC) 16, especulou-se que o perfil de miARN alterado dentro eritrócitos HbS podem contribuir directamente para a célula-resistência intrínseca a malária.
Estes estudos culminaram no desenvolvimento de um gasoduto para isolar, identificar e funcionalmente estudar o papel de miARN humana dentro do mAlaria parasita, P. falciparum, que indicou que esses hospedeiros / miRNAs humanos em última análise, de forma covalente fusível e, em seguida, traducionalmente reprimir transcritos de ARNm parasita 17. Isto proporcionou um exemplo dos primeiros cruzada entre espécies transcritos quiméricos formados por trans-splicing e implica que esta fusão ARNm-miARN pode estar a ocorrer em outras espécies, incluindo outros parasitas. Todos os mRNAs de tripanossomas são trans-emendado com uma tala-líder (SL) para regular a separação de transcrições policistrónicos 18. Desde P. falciparum carece orthologs para Dicer / Ago 19,20, é possível que miRNAs eritrócitos seqüestrar máquinas SL semelhante em P. falciparum para integrar genes-alvo. Estudos recentes em P. falciparum têm, de facto, indica a presença de sequências líder 5 'da tala 21. Este estudo detalha os métodos que levaram à descoberta de humanos-parasita miRNA-RNAm transcrições de fusão, incluindo tanto transcriptomic e translatécnicas de regulação adicionais. Os objetivos gerais destes métodos são a investigar os efeitos de pequenos RNAs na regulação gênica, fenótipos e tradução potencial de P. transcrições falciparum.
A identificação inicial de transcritos quiméricos humano-parasita invocado a utilização de técnicas de análise de RNA, tais como PCR em tempo real, o seqüenciamento do transcriptoma e EST captura biblioteca, que incluía tanto totais e pequenos RNAs, em vez de usar as técnicas que só isoladas pequenos RNAs. Isolamento de ARN todos juntos em um tanque grande, em vez de separadamente, permitiu a identificação de ambos os pequenos RNAs humanos translocados do parasita, assim como a presença destas sequências de ARN pequenos, como parte de uma sequência maior. Este então necessária uma análise do estado tradução destes ARNms de fusão para determinar as consequências funcionais destas fusões.
Enquanto esforços extensivos sobre a caracterização do genoma do parasita umad transcriptoma contribuíram para a compreensão da biologia do parasita 22-25, muito menos se sabe sobre a regulação da tradução do mRNA transcriptoma em todo o ciclo de vida de P. falciparum 26. Esta compreensão limitada do proteoma do parasita tem dificultado tanto a compreensão da biologia do parasita ea capacidade de identificar novos alvos para a próxima geração de terapias anti-malária. Esta lacuna na compreensão da biologia celular do parasita persiste em grande parte devido à falta de técnicas adequadas para investigar regulação traducional em P. falciparum. Um estudo recente descreveu o uso de pegada ribossomal de P. falciparum para determinar o status de tradução global 21. Uma medição bem estabelecido de potencial de translação dos transcritos corresponde ao número de ribossomas associados determinados pelo perfil polissoma. No entanto, quando esta técnica é aplicada a P. falciparum </ em>, é incapaz de recuperar a maioria polissomos e captura predominantemente monosomes. Recentemente, vários grupos 27,28 otimizaram P. técnicas polissomas falciparum por lise do eritrócito e parasita simultaneamente para preservar os polissomos e caracterizar a ocupação ribossômica e potencial translacional desses parasitas da malária durante o seu desenvolvimento assexuado em hospedeiras células vermelhas 28.
Coletivamente, esses métodos demonstram que a fusão observado de miRNA e parasitas mRNAs humanos modula a tradução da proteína do parasita desses mRNAs de fusão, que foi demonstrada utilizando métodos previamente relatados 27, e é um importante determinante da resistência da malária em HbAS e 17 HbSS eritrócitos. Estes métodos seriam úteis em qualquer sistema de procura para identificar e explorar funcionalmente eventos de splicing de ARN, ARN de fusão se estas estão dentro P. falciparum ou outros sistemas eucariotas.
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Protocolo
1: Isolamento de RNAs de pequeno porte de P. falciparum Durante o IDC
- Obter parasitas da malária na cultura assexuada 29.
NOTA: O tamanho cultura requerida irá variar de acordo com a aplicação desejada; No entanto, uma cultura de 10 ml em 3-5% de parasitemia e 5% de hematócrito fornece amplo para ARN-PCR em tempo real (RT-PCR). A técnica foi inicialmente otimizado para culturas assíncronas, mas quando são desejados momentos específicos durante o ciclo de infecção, os parasitas anel de carreira podem ser sincronizados pela sincronização sorbitol, o mais tardar 10-12 horas pós-invasão. Sincronização deve ser repetido após um ciclo (aproximadamente 48 horas) 29. - Piscina células infectadas em conjunto (5 x 10 ~ 9 GVs na parasitemia 3-5%) e PBS frio encher a parte superior do tubo e centrifugar a 800 xg durante 5 minutos, sem travão para sedimentar as células vermelhas.
- Após centrifugação, o sobrenadante cuidadosamente remover usando uma pipeta de aspiração, ligadopara um vácuo, uma vez que o pellet eritrocítica é fácil de deslocar. Lava-se a pelete mais uma vez com PBS 1x frio.
- Ressuspender o sedimento de células em 0,15% de saponina frio (em PBS 1x) e colocar em gelo durante 30 min.
- Centrifugar as células a 1.500 xg durante 12 min a 4 ° C, remover o sobrenadante (que será vermelho escuro em cor) e ressuspender o pellet em PBS frio. Repita este passo mais uma vez.
NOTA: De modo a assegurar que os microARNs presentes eram reflectora de microARNs dentro parasitas, e não contaminação eritrocítica, um número de condições de isolamento do parasita foram testados: 1) de saponina de lise, 2) saponina de lise combinada com tratamento com ARNase A de miARNs célula hospedeira e 3 ) metil-beta-ciclodextrina de tratamento para remover o parasita do eritrócito hospedeiro. Todos os tratamentos deu resultados semelhantes. - Lisar as parasita sedimento isolado usando as recomendadas 600 ul de tampão de lise. Este volume de tampão de lise é suficiente para culturas até ~ 30 ml em 2% de hematócrito e 5% de parasitemia.
NOTA: Para as culturas de parasitas de maiores dimensões, este volume pode ser aumentado. É importante garantir uma lise completa do pelete parasita em vórtice completa durante pelo menos 1 min. Além disso, para facilitar a extracção, as amostras submetidas a lise pode ser transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. - Adicionar 60 ul, ou 1/10 do volume do tampão de lise usado no passo 6, de aditivo homogeneizado (acetato de sódio 2 M, pH 4).
- Deixar as amostras em gelo durante 10 min.
- Adicionar 600 ul, ou um volume igual ao volume de tampão de lise adicionado no passo 6, de choloroform fenol ácido para cada amostra e vortex durante 1 min.
- Separaram-se as fases aquosa e orgânica por centrifugação das amostras a 10000 xg durante 5 min. Esta rotação é maior do que a sugerida pelo kit para garantir que toda a hemoglobina / hemozoína está na fase orgânica.
- Recolhe-se o (aquosa) da camada superior e transferi-lo para um tubo fresco. Repetir os passos 9 e 10, se a fase aquosa é branca ou (mais provavelmente) de cor castanha, que sugere prócontaminação tein.
- Determinar o volume do sobrenadante resultante por pipeta e, em seguida, adicionar 1,25 volumes de etanol a 100% (~ 800 mL) e misturar por inversão do tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de 5 vezes.
- Passar cada amostra através de um cartucho de filtro de ligação de ARN fornecida (vários diferente dos quais estão disponíveis comercialmente), quer por centrifugação a 14.000 xg durante 1 min, ou usando um colector de vácuo.
- Lavar o cartucho de filtro com 700 ul de tampão de lavagem a miARN 1 usando uma microcentrífuga, girando a 14.000 xg durante 1 min.
- Lavar o cartucho de filtro com 500 ul de tampão de lavagem 2/3 duas vezes por centrifugação a 14.000 xg durante 1 min cada.
- Eluir com 100 ul de ARN DEPC-água, que foi pré-aquecido a 95 ° C, em duas lavagens de 50 mL, a centrifugação a 14000 xg durante 1 min cada. Medir a concentração de ARN através de absorvência de UV a 260 nm.
NOTA: O gel de ARN (quer de acrilamida TBE-ureia ou gel desnaturante de formaldeído agarose a) pode be utilizada para avaliar a distribuição de tamanho dos ARN isolados.
NOTA: Este RNA é adequado para análise por microarray, RNA-sequenciamento, norte blot e ensaio de protecção de ribonuclease.
2: Quantificação de RNAs de pequeno porte de P. falciparum Durante o IDC
- Determinar a concentração de amostras individuais isolados no passo 1, utilizando espectrofotometria de UV a 260 nm.
- Gerar iniciadores de PCR em tempo real para as espécies de ARN desejado. Para miRNA sozinho, usamos premade ensaios miRNA qPCR, enquanto que para mRNAs ou fusão miRNA-RNAm nós projetamos primers para o verde SYBR. Para os ARN de fusão, o iniciador directo foi a própria sequência miARN (miR-451: AAACCGTTACCATTACTGAGTT), ao passo que o inverso era um iniciador específico do gene ~ 100 pb a jusante da miARN na sequência de ARNm (PKA-R: ATCGAACATGCTGTGAACAT).
- Faça cDNA a partir das amostras de RNA usando um iniciador hairpin para miRNAs (20-40 ng de usar RNA) sozinho ou hexâmeros aleatórios para mRNA e / ou miRNAespécies de fusão -mRNA (usando 1 ug de ARN). Misture e iniciadores de ARN durante 5 minutos a 65 ° C, depois arrefece-se até à temperatura ambiente. Em seguida, adicionar mistura de transcriptase reversa (0,5 ul de transcriptase reversa, 0,5 ul de inibidor de RNase, 1 ul de dNTPs (2,5 mM cada), 4 pi de tampão 5x, 2 ul de DTT 0,1 M, 1 mL de H2O).
- Amostras executado em um termociclador capaz de detectar qualquer SYBR verde ou sondas TaqMan. SYBR Green PCR quantitativa em 30 para genes específicos foi executado como um 3-passo do PCR, 95 ° C durante 15 seg, menor temperatura de hibridação do iniciador de menos de 5 ° C durante 30 seg, e 68 ° C durante 30 s, durante 40 ciclos, utilizando um SYBR comercial master mix verde. miARN-PCR em tempo real foi executada como uma PCR de dois passos, 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min, durante 40 ciclos.
- Quantificar os ensaios utilizando o método ΔΔCt e normalizá-los contra qualquer Rab GTPase (PF08_0110) ou 18S rRNA 31.
3: Introduçãodos Pequenos RNAs em Malária Parasitas
- Agregar a 300 ul de células vermelhas do sangue por transfecção (250 ul de hemácias, cerca de 1,5 x 10 9 células, em última análise, ser utilizado) em meio completo a malária por centrifugação a 800 xg durante 5 min a 1 freio.
- Lavar os eritrócitos duas vezes com meio RPMI e ressuspender em cytomix completo (KCl 120 mM, 0,15 mM de CaCl2, 10 mM de K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4, pH 7,6; 25 mM de HEPES, pH 7,6; EGTA a 2 mM, pH 7,6; 5 mM de MgCl2, pH ajustado com KOH) a 50% de hematócrito após a centrifugação a 800 xg durante 5 min a 1 freio.
- Transferir as células para uma cuvete de electroporação 0,2 cm.
- Adiciona-se 10 ug, ou quantidade apropriada, de oligonucleótidos sintéticos costume às cuvetes e ressuspender as culturas.
- Ajustar o electroporador de 310 V / 950 uF e fornecer um impulso para cada cuvete.
- Ressuspender as 300 ul de hemácias dentro da tina em pré-aquecido Mal completameios Aria e placa-los em placas de 24 poços e incuba-se a 37 ° C num recipiente estanque ao ar com uma mistura de gases no sangue malária (3% de O2, 5% de CO 2).
- Após 4 horas, infectam os glóbulos vermelhos transfectadas com trofozoítos final sincronizado para uma parasitemia final, de cerca de 1%.
- Adicionar hemácias recém-transfectadas cada 4-6 dias para culturas infectadas e determinar a parasitemia% por FACS usando YoYo-1 coloração, conforme indicado na secção 4.
4: Determinação da Erythrocyte microRNAs efeito sobre Parasite Taxa de Infecção
- Tome 100 ul de cultura ressuspenso por micropipeta e coloque em um tubo de 1,7 ml de microcentrífuga. Lavar duas vezes com 1 ml de PBS 1x e centrifugar numa microcentrífuga mesa por centrifugação a 800 xg durante 5 min.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de glutaraldeído a 0,025%. Incubar as amostras durante 20 min à TA.
NOTA: As amostras podem ser armazenadas aqui durante várias semanas a 4 ° C. Depois, sedimentar os infectados RBCs por centrifugação a 800 xg durante 5 min. Lavar duas vezes com 1 ml de PBS 1x. - Ressuspender o sedimento em 1 mL de 0,015% de saponina. Incubar a 4 ° C durante 15 min. Pellet infectados eritrócitos por centrifugação a 800 xg durante 5 min. Lavar duas vezes com 1 ml de PBS 1x. Repeat.4.3. Ressuspender as células em 1 ml de PBS 1x contendo 1 ul (1.000X) corante de ADN.
- Determinar os graus de parasitemia num citómetro de fluxo, a 488 nm de excitação e 530 nm (FL-1) ~ emissão.
- Em primeiro lugar, o portão citômetro de fluxo com base em FSC e SSC para se concentrar em hemácias. Em seguida, medir os graus de parasitemia (hemácias infectadas) no RBC fechado por fluorescência no canal FL-1.
NOTA: depois parasitas estágio são 10X mais fluorescente de parasitas fase anterior, e ~ 100X acima hemácias não infectados. Além disso, a coleta em baixa velocidade tende a reduzir o ruído. Finalmente, esta abordagem tem sido comparada ao 3H-hipoxantina incorporação e Giemsa, tanto como relatado anteriormente 13, e todas as técnicas GAVum e resultados semelhantes.
5: Biotina-tagging e eluição de miRNA-RNAm Fusão produtos
- Directamente por ordem oligonucleótidos sintéticos costume de RNA com destiobiotina (DB) ligadas covalentemente à extremidade 5 '.
- Transfectar RBC infectados com destiobiotina-conjugado (DB) miARN e não modificado miARN (controlo negativo), como indicado no passo 3.
- Infectar hemácias transfectadas com P. falciparum parasitas para uma parasitemia de partida de 0,5% (passo 1.1).
- Extrair ARN parasita 4 dias (96 horas) mais tarde, como descrito acima no passo 1.
- Incubar 10 ug de ARN parasita com 50 ul embalados esferas de estreptavidina, adicionada através de micropipeta, e girar sobre um rotador tubo de microcentrífuga durante 1 hora a 4 ° C.
- Agregar as esferas a 800 xg durante 30 seg e lava-se com 20 mM de KCl e 1 / 1.000 de RNase inibidor.
- Eluir ARN a partir das pérolas por competição com biotina 2 mM e tampão com 200 ul de RNA de captura de eluição (20 mM de KCl, 1/1, 000 Inibidor de RNase e 2 mM de biotina) a 4 ° C durante a noite com rotação.
- Determinar o grau de enriquecimento de P. indicado transcrições falciparum utilizando SYBR Green qRT-PCR, e microARN enriquecimento (controlo positivo) por TaqMan qPCR como indicado no passo 2.
6: Separação polissoma determinar o Ribosomal Ocupação de P. falciparum
- Coloque solução de sacarose a 5 ml de 15% (400 mM de acetato de potássio, HEPES de potássio 25 mM, pH 7,2, acetato de magnésio 15 mM, 200 ^ M de ciclo-heximida, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, 40 U / ml de RNase inibidor, e 15% de sacarose ) para um tubo de ultracentrífuga SW41 (14 x 89 mm).
- Usando uma seringa de 5 ml, adicionar solução de sacarose a 5 ml de 50% (400 mM de acetato de potássio, HEPES de potássio 25 mM, pH 7,2, acetato de magnésio 15 mM, 200 ^ M de ciclo-heximida, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, 40 U / ml de ARNase inibidor, e 50% de sacarose) debaixo da sacarose 15% utilizando uma agulha de aço longo, em seguida, remover a agulha.
- Selar o topo do tubo do gradiente com parafilme, inclinar o tubo lentamente sobre o seu lado, numa posição estável que impeça o rolamento, de modo que é deitado na horizontal sobre a superfície da mesa. Manter o tubo no seu lado, pelo menos, 2 h. Enquanto espera, comece com o passo 6.5.
- Após 2 horas, incline lentamente o tubo de volta na posição vertical e transferir o tubo de gelo, permitindo-o esfriar por pelo menos 15 minutos antes da amostra de carregamento (passo 14).
- Recolha de sangue infectado com Plasmodium suficiente cultura estágio para gerar 100-500 ug de RNA total, ou cerca de 100 ml de cultura assíncrona em 3-5% parasitemia. Adicionar 1/10 volume de que o meio de cultura contendo 10x (2 mM) de ciclo-heximida (CHX) e incubar a 37 ° C durante 10 min.
- Culturas por centrifugação a 500 xg durante 7 minutos com a centrifugadora (freio 1), lavar duas vezes com, em seguida, temperatura ambiente 1x PBS contendo 200 uM CHX. Volte a suspender as culturas de parasitas em 1x PBS contendo 200 mM CHX e armazenar no gelo.
- Estimar o volume do pelete de RBC. Adicionar tampão de lise (400 acetato de potássio mM, HEPES de potássio 25 mM, pH 7,2, acetato de magnésio 15 mM, 200 uM de CHX, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, 40 U / ml de RNase Inhibitor, 1% (v / v) de IGEPAL CA -630, e 0,5% (w / v) DOC) à pelete de RBC a um volume final de 4,25 ml. Incubar o lisado a 4 ° C durante 10 min durante a rotação.
- Transferir o lisado para tubos de microcentrífuga, e depois centrifugar as amostras numa microcentrífuga a 16000 xg e 4 ° C durante 10 min.
- Prepare almofadas de sucrose por pipetagem de 1,25 ml de solução de almofada de sacarose a frio 0,5 M (400 mM de acetato de potássio, HEPES de potássio 25 mM, pH 7,2, acetato de magnésio 15 mM, 200 ^ M de ciclo-heximida, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, 40 U / ml de ARNase inibidor, e sacarose 0,5 M) para um tubo de ultracentrífuga SW55 (13 x 51 mm).
- Camada cuidadosamente 3,75 ml de sobrenadante lisado (a partir do passo 7) no topo da almofada de sacarose utilizando uma seringa e pequeno (~ 27) agulha de calibre. Store o lisado remanescente (~ 500 mL) a -80 ° C para extrair os níveis de ARN total, como indicado no ponto 1.
- Coloque as amostras num rotor de ultracentrífuga, pré-refrigerada a 4 ° C, a qual pode conter tubos de 13,2 ml. Centrifugar as amostras a 366.000 xg e 4 ° C durante 146 min.
- Usando uma pipeta, transferir o sobrenadante para um tubo cónico de 15 ml. Armazene o sobrenadante a -80 ° C para o isolamento de RNA livre (não ligada por ribossomos) RNAs.
- Ressuspender o sedimento ribossoma em 500 ul de tampão de ressuspensão ribossoma (400 mM de acetato de potássio, HEPES de potássio 25 mM, pH 7,2, acetato de magnésio 15 mM, 200 ^ M de ciclo-heximida, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, e 40 U / ml de RNase inibidor) pipetando durante 5 min.
- Centrifugar as amostras numa microcentrífuga a 16000 xg e 4 ° C durante 10 min.
- Mantendo o gradiente do passo 4 em gelo, remover o Parafilm, em seguida, a camada cuidadosamente a suspensão ribossoma no topo do gradiente using uma seringa e pequena (~ 27) agulha de calibre.
- Carregar o tubo num rotor de ultracentrífuga pré-gelada e centrifugar os gradientes carregados em 200.000 xg e 4 ° C durante 180 min. Quando a rotação estiver concluída, loja centrifugado gradientes a 4 ° C até estar pronto para carregar no fraccionador.
- Coloque um tubo de ultracentrífuga vazio no fraccionador do gradiente (este pode ser um tubo usado em uma execução anterior), depois lave com água RNase por 5 min a 100 x 10 velocidade.
- Durante o passo de lavagem em 6,16, ajustar a sensibilidade do detector de absorvância no UV. Uma boa sensibilidade de partida é de 0,2, mas este pode ter de ser ajustado em mais tarde corre dependendo do sinal A 254 (que varia com base no número de parasitas, etc.).
- Uma vez que a sensibilidade do detector é definido, defina o sinal de linha de base para zero, enquanto a água está fluindo através do detector.
- Depois de se lavar o colector de fracções, inverter o fluxo de fluido até que as linhas estão vazios e, em seguida, REMove o tubo de ultracentrífuga vazio.
- Executar solução de 60% de sacarose através do fraccionador até que ele sai do aparelho de agulha.
- Insira o tubo que contém o primeiro gradiente na parte superior da câmara de carga e apertar o selo, tomando cuidado para não apertar demasiado. Em seguida, furar o fundo do tubo com a agulha.
- Repor a velocidade de fluxo de fluido a 12,5 x 10 (controlada pelo botão de controlo de velocidade do fluxo na parte da frente da bomba), em seguida, definir o colector de fracções automático para recolher fracções de 18 seg (~ 330 ul / fracção) em tubos de microcentrífuga.
- Comece a frente de fluxo da solução de sacarose a 60%.
- Quando a primeira gota da solução gradiente cai para dentro do tubo de microcentrífuga, começará imediatamente tanto a recolha de fracções e gravação ao vivo do sinal A 254.
- Uma vez que uma queda brusca é observada no sinal de A 254, que corresponde à interface entre as soluções de sacarose a 50% e 60%, parar o fluxo de fluido e uma 254 gravação.
- Armazenar as fracções de gradiente a -80 ° C para uso posterior.
- Inverter o fluxo de fluido a 100 x 10 velocidade até que a solução de sacarose 60% esvazia para fora do tubo de ultracentrífuga.
- Se houver gradientes adicionais para fracionar, remover o tubo de ultracentrífuga vazio da câmara de carga e reinicie a partir do passo 6.21. Se todas as amostras são completadas, lavar o aparelho como foi realizada em passos 6.16 e 6.19.
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Resultados
Perfil global de microARN humana em P. falciparum
As técnicas aqui apresentadas foram usadas para extrair microARNs de parasitas em uma variedade de condições. Uma coisa a notar é que extrações de RNA para glóbulos vermelhos não infectados foram realizados como indicado na 32, que muitas vezes serviu como um ponto de referência para os dados de microRNA apresentadas tanto este artigo e do estudo original 29. Esses estudos também demonstraram que os eri...
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Discussão
HbS é uma das variantes da hemoglobina mais comuns em áreas endêmicas de malária, em grande parte porque ele fornece proteção contra a malária grave causada por P. falciparum. As técnicas necessárias para caracterizar o papel do microRNA humana na regulação de genes de P. falciparum são detalhadas ao longo deste manuscrito. Ao extrair o RNA total de modo a incluir todos os pequenos RNAs, e através da realização de um procedimento de lise parasita relativamente simples, estes ARN de fusão foram...
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a declarar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pela Doris Duke Charitable Foundation, Burroughs Wellcome Fund, NIH R21DK080994, fundo de projeto piloto da Duke Chancellor, Roche Foundation for Anemia Research e The Bill and Melinda Gates Foundation. GL é apoiado pela UPGG da Duke e pelo NIH (Grant # 5R01AI090141-03) e KAW pelo Programa de Bolsas de Pesquisa de Pós-Graduação da NSF.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| REAGENTS-Todos os reagentes devem ser livres de RNAse. | |||
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | DEPC DEPC-água |
| tratada (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Yoyo-1 DNA corante fluorescente | Thermo Fisher | ||
| Gene Pulser II eletroporador Bio-Rad | |||
| 0,2 cm Cubetas | |||
| 4 M acetato de potássio | Mallinckrodt | 6700 | |
| 2 M HEPES de potássio | Sigma | H0527 | pH 7,2 |
| 1 M acetato de magnésio | Sigma | M-2545 | |
| 1 M ditiotreitol | Research Products International | D11000 | DTT |
| 100 mM fluoreto de fenilmetilsulfonato Sigma | P7626 | PMSF, dissolvido em isopropanol | |
| 10% (v/v) Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| 10% (p/v) desoxicolato de sódio | Sigma | D-6750 | DOC |
| Cicloheximida | Sigma | C-7698 | CHX |
| Sacarose | Mallinckrodt | 8360-04 | |
| RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840) | Invitrogen | ||
| RPMI-1640 c/ L-glutamina | Cellgro | 10-040-CV | |
| 10% AlbuMAX I | Invitrogen | 11020-039 | p/v em água estéril |
| Gentamicina | Gibco | 15750-060 | |
| HT suplemento (100x) (Invitrogen, cat. n.º 11067030) | |||
| 45% (p/v) sacarose (Sigma, cat. n.º G8769) | |||
| Tampão HEPES 1 M (Gibco, cat. no. 15630-080) | |||
| 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS; Cellgro, gato. n.º 2109310CV) | |||
| Balão de filtro de vácuo Corning de 500 ml (VWR, cat. n.º 430769) | |||
| Lâminas de vidro (VWR, cat. n.º 48311-702) | |||
| Coloração de Giemsa (50X) (VWR, cat. n.º m708-01) | |||
| Kit de isolamento de miRNA mirVana (Ambion, ThermoFisher Scientific). | |||
| 5 'MiRNA maduro conjugado com biotina (a sequência varia de acordo com o miRNA de interesse) (Dharmacon) | |||
| Biotina em pó (Sigma-Aldrich) | |||
| 1 M Cloreto de Potássio | |||
| Estreptavidina Sepharose Grânulos de Alto Desempenho (GE Healthcare) | |||
| Tampão de ressuspensão de ribossomo (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Tampão de lise (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Solução de gradiente de sacarose a 15% (p/v) (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Solução de gradiente de sacarose a 50% (p/v) (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Almofada de sacarose a 0,5 M (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Solução de busca de sacarose a 60% (p/v) (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Meios de cultura de células de Plasmodium (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Tampão de lavagem de captura de RNA (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Tampão de eluição de RNA (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| REAGENT SETUP | |||
| Solutions | |||
| Meio de cultura de células de Plasmodium | |||
| 500 ml RPMI-1640 c/ L-glutamina | |||
| 0,5 ml gentamicina | |||
| 5 ml suplemento | |||
| 2,5 ml 45% glicose | |||
| 25 ml 10% AlbuMAX I | |||
| 12,5 ml 1 M HEPES | |||
| Filtro estéril com balão filtrante a vácuo de 0,2 mm. | |||
| Meios de cultura de células de Plasmodium contendo 10x CHX | |||
| Mesma receita que os meios de cultura de | |||
| 2 mM de cicloheximida | |||
| 1x PBS contendo cicloheximida | |||
| A cicloheximida é adicionada fresca a 1x PBS até uma concentração final de 200 mM e mantida a 4 OC até o uso. | |||
| tampão de ressuspensão do ribossomo | |||
| 400 mM de acetato | |||
| 25 mM HEPES de potássio, pH 7,2 | |||
| 15 mM de acetato | |||
| 200 mM de cicloheximida (adicionar fresco) | |||
| 1 mM DTT (adicionar fresco) | |||
| 1 mM PMSF (adicionar fresco) | |||
| 40 U / ml RNaseOUT (adicionar fresco) | |||
| < forte > tampão de lise< / forte > | |||
| mesma receita do tampão de ressuspensão do ribossomo acima, com a adição de: | |||
| 1% (v / v) Igepal CA-630 | |||
| 0,5% (p / v) DOC | |||
| < soluções de sacarose > fortes < / fortes > | |||
| mesma receita do tampão de ressuspensão do ribossomo acima, com a adição de quantidades variadas de sacarose: | |||
| 15% (p / v) de sacarose para fazer uma solução | |||
| de gradiente de sacarose a 15%50% (p/v) de sacarose para fazer solução | |||
| a 50% 0,5 M de sacarose para fazer 0,5 M de almofada | |||
| Como acima, cicloheximida, DTT, PMSF e RNaseOUT devem ser adicionados frescos. | |||
| A solução de perseguição de sacarose a 60% requer apenas sacarose e água, nenhum outro componente | |||
| 60% (p/v) de sacarose em água tratada com DEPC para fazer uma solução | |||
| RNA Capture Wash Buffer | |||
| 20 mM KCl | |||
| 5 unidade/ml Rnase Out (Invitrogen) | |||
| RNA Capture Elution Buffer | |||
| Mesma receita do RNA Capture Wash Buffer, com a adição de: | |||
| 2 mM de biotina | |||
| EQUIPMENT | |||
| SW55 Rotor de ultracentrífuga Ti (Beckman, cat. nº 342194) | |||
| Rotor de ultracentrífuga SW41 Ti (Beckman, cat. no. 331362) | |||
| Ultra-ClearTM ½ x 2 pol (13 x 51 mm) tubos de ultracentrífuga para o SW55 (Beckman, cat. nº 344057) | |||
| Polialômero 9/16 x 3 ½ em tubos de ultracentrífuga (14 x 89 mm) para a ultracentrífuga SW41 (Beckman, cat. no. 331372) | |||
| L8-80M (Beckman) | |||
| Agulha de seringa romba de aço, 4 polegadas, 16 G (Aldrich, cat. no. Z261378) | |||
| Seringa de 1 ml com agulha de 27 G½ (Becton Dickinson, cat. no. 309623) | |||
| Seringa de 5 ml (Becton Dickinson, cat. no. 309646) | |||
| Rotador de tubo | |||
| Microcentrífuga, refrigerado | |||
| Sistema de fracionamento de gradiente de densidade (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179) | |||
| TracerDAQ (Computação de Medição) | |||
| Rotor Eppendorf A-4-81 (Eppendorf, cat. nº 022638807) |
Referências
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