Os microRNAs humanos se translocam dos eritrócitos hospedeiros para os parasitas Plasmodium falciparum. Aqui, as técnicas usadas para transfectar microRNAs sintéticos em eritrócitos hospedeiros e isolar todos os RNAs de P. falciparum são descritas. Além disso, este artigo detalhará um método de isolamento de polissomos em P. falciparum para determinar a ocupação ribossômica e o potencial translacional de transcritos do parasita.
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Artigo de método
Métodos para investigar o papel de Regulamentação dos Pequenos RNAs e Ribosomal Ocupação de
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A variação genética responsável pelo alelo falciforme (HbS) permite eritrócitos para resistir à infecção pelo parasita da malária, P. falciparum. A base molecular da resistência a este, que é conhecida por ser multifactorial, permanece incompletamente compreendida. Estudos recentes descobriram que a expressão diferencial de microRNAs de eritrócitos, uma vez translocados em parasitas da malária, afetar tanto a regulação gênica e crescimento do parasita. Estes miARNs foram posteriormente mostrados para inibir a tradução do ARNm através da formação de um transcrito de ARN quimérico através de 5 'do RNA de fusão com subconjuntos discretos de mRNAs do parasita. Aqui, as técnicas que foram usadas para estudar o papel funcional e putativos mecanismo microRNAs eritrócitos subjacentes na regulação gênica e potencial translacional de P. falciparum, incluindo a transfecção de microRNAs sintéticos modificados em eritrócitos de acolhimento, serão detalhados. Por fim, um método de gradiente de polissoma é usado para determinar a extensão da TRAnslation destes transcritos. Juntas, essas técnicas nos permitiu demonstrar que os níveis desregulados de microRNAs eritrócitos contribuir para a célula-intrínseca resistência da malária dos eritrócitos falciformes.
Introdução
A malária, causada por parasitas apicomplexan do gênero Plasmodium, é a doença parasitária humana mais comum, infectando mundialmente cerca de 200 milhões de pessoas por ano e causando cerca de 600.000 mortes 1. Dos cinco espécies de Plasmodium que infectam os humanos, o mais relevante para a doença humana são P. falciparum e P. vivax, devido às suas distribuições generalizadas e potencial para complicações graves de malária. O ciclo de vida do parasita da malária requer infecção de ambos os mosquitos e seres humanos. Quando um mosquito infectado pica um humano, os parasitas viajar através da corrente sanguínea para o fí....
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Protocolo
1: Isolamento de RNAs de pequeno porte de P. falciparum Durante o IDC
- Obter parasitas da malária na cultura assexuada 29.
NOTA: O tamanho cultura requerida irá variar de acordo com a aplicação desejada; No entanto, uma cultura de 10 ml em 3-5% de parasitemia e 5% de hematócrito fornece amplo para ARN-PCR em tempo real (RT-PCR). A técnica foi inicialmente otimizado para culturas assíncronas, mas quando são desejados momentos específicos durante o ciclo de infecção, os parasitas anel de carreira podem ser sincronizados pela sincronização sorbitol, o mais tardar 10-12 horas pós-invasão. Sincronização deve ser repetido após um ciclo ....
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Resultados
Perfil global de microARN humana em P. falciparum
As técnicas aqui apresentadas foram usadas para extrair microARNs de parasitas em uma variedade de condições. Uma coisa a notar é que extrações de RNA para glóbulos vermelhos não infectados foram realizados como indicado na 32, que muitas vezes serviu como um ponto de referência para os dados de microRNA apresentadas tanto este artigo e do estudo original 29. Esses estudos também demonstraram que os eri.......
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Discussão
HbS é uma das variantes da hemoglobina mais comuns em áreas endêmicas de malária, em grande parte porque ele fornece proteção contra a malária grave causada por P. falciparum. As técnicas necessárias para caracterizar o papel do microRNA humana na regulação de genes de P. falciparum são detalhadas ao longo deste manuscrito. Ao extrair o RNA total de modo a incluir todos os pequenos RNAs, e através da realização de um procedimento de lise parasita relativamente simples, estes ARN de fusão foram.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a declarar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pela Doris Duke Charitable Foundation, Burroughs Wellcome Fund, NIH R21DK080994, fundo de projeto piloto da Duke Chancellor, Roche Foundation for Anemia Research e The Bill and Melinda Gates Foundation. GL é apoiado pela UPGG da Duke e pelo NIH (Grant # 5R01AI090141-03) e KAW pelo Programa de Bolsas de Pesquisa de Pós-Graduação da NSF.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| REAGENTS-Todos os reagentes devem ser livres de RNAse. | |||
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | DEPC DEPC-água |
| tratada (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Yoyo-1 DNA corante fluorescente | Thermo Fisher | ||
| Gene Pulser II eletroporador Bio-Rad | |||
| 0,2 cm Cubetas | |||
| 4 M acetato de potássio | Mallinckrodt | 6700 | |
| 2 M HEPES de potássio | Sigma | H0527 | pH 7,2 |
| 1 M acetato de magnésio | Sigma | M-2545 | |
| 1 M ditiotreitol | Research Products International | D11000 | DTT |
| 100 mM fluoreto de fenilmetilsulfonato Sigma | P7626 | PMSF, dissolvido em isopropanol | |
| 10% (v/v) Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| 10% (p/v) desoxicolato de sódio | Sigma | D-6750 | DOC |
| Cicloheximida | Sigma | C-7698 | CHX |
| Sacarose | Mallinckrodt | 8360-04 | |
| RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840) | Invitrogen | ||
| RPMI-1640 c/ L-glutamina | Cellgro | 10-040-CV | |
| 10% AlbuMAX I | Invitrogen | 11020-039 | p/v em água estéril |
| Gentamicina | Gibco | 15750-060 | |
| HT suplemento (100x) (Invitrogen, cat. n.º 11067030) | |||
| 45% (p/v) sacarose (Sigma, cat. n.º G8769) | |||
| Tampão HEPES 1 M (Gibco, cat. no. 15630-080) | |||
| 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS; Cellgro, gato. n.º 2109310CV) | |||
| Balão de filtro de vácuo Corning de 500 ml (VWR, cat. n.º 430769) | |||
| Lâminas de vidro (VWR, cat. n.º 48311-702) | |||
| Coloração de Giemsa (50X) (VWR, cat. n.º m708-01) | |||
| Kit de isolamento de miRNA mirVana (Ambion, ThermoFisher Scientific). | |||
| 5 'MiRNA maduro conjugado com biotina (a sequência varia de acordo com o miRNA de interesse) (Dharmacon) | |||
| Biotina em pó (Sigma-Aldrich) | |||
| 1 M Cloreto de Potássio | |||
| Estreptavidina Sepharose Grânulos de Alto Desempenho (GE Healthcare) | |||
| Tampão de ressuspensão de ribossomo (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Tampão de lise (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Solução de gradiente de sacarose a 15% (p/v) (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Solução de gradiente de sacarose a 50% (p/v) (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Almofada de sacarose a 0,5 M (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Solução de busca de sacarose a 60% (p/v) (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Meios de cultura de células de Plasmodium (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Tampão de lavagem de captura de RNA (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| Tampão de eluição de RNA (ver CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE) | |||
| REAGENT SETUP | |||
| Solutions | |||
| Meio de cultura de células de Plasmodium | |||
| 500 ml RPMI-1640 c/ L-glutamina | |||
| 0,5 ml gentamicina | |||
| 5 ml suplemento | |||
| 2,5 ml 45% glicose | |||
| 25 ml 10% AlbuMAX I | |||
| 12,5 ml 1 M HEPES | |||
| Filtro estéril com balão filtrante a vácuo de 0,2 mm. | |||
| Meios de cultura de células de Plasmodium contendo 10x CHX | |||
| Mesma receita que os meios de cultura de | |||
| 2 mM de cicloheximida | |||
| 1x PBS contendo cicloheximida | |||
| A cicloheximida é adicionada fresca a 1x PBS até uma concentração final de 200 mM e mantida a 4 OC até o uso. | |||
| tampão de ressuspensão do ribossomo | |||
| 400 mM de acetato | |||
| 25 mM HEPES de potássio, pH 7,2 | |||
| 15 mM de acetato | |||
| 200 mM de cicloheximida (adicionar fresco) | |||
| 1 mM DTT (adicionar fresco) | |||
| 1 mM PMSF (adicionar fresco) | |||
| 40 U / ml RNaseOUT (adicionar fresco) | |||
| < forte > tampão de lise< / forte > | |||
| mesma receita do tampão de ressuspensão do ribossomo acima, com a adição de: | |||
| 1% (v / v) Igepal CA-630 | |||
| 0,5% (p / v) DOC | |||
| < soluções de sacarose > fortes < / fortes > | |||
| mesma receita do tampão de ressuspensão do ribossomo acima, com a adição de quantidades variadas de sacarose: | |||
| 15% (p / v) de sacarose para fazer uma solução | |||
| de gradiente de sacarose a 15%50% (p/v) de sacarose para fazer solução | |||
| a 50% 0,5 M de sacarose para fazer 0,5 M de almofada | |||
| Como acima, cicloheximida, DTT, PMSF e RNaseOUT devem ser adicionados frescos. | |||
| A solução de perseguição de sacarose a 60% requer apenas sacarose e água, nenhum outro componente | |||
| 60% (p/v) de sacarose em água tratada com DEPC para fazer uma solução | |||
| RNA Capture Wash Buffer | |||
| 20 mM KCl | |||
| 5 unidade/ml Rnase Out (Invitrogen) | |||
| RNA Capture Elution Buffer | |||
| Mesma receita do RNA Capture Wash Buffer, com a adição de: | |||
| 2 mM de biotina | |||
| EQUIPMENT | |||
| SW55 Rotor de ultracentrífuga Ti (Beckman, cat. nº 342194) | |||
| Rotor de ultracentrífuga SW41 Ti (Beckman, cat. no. 331362) | |||
| Ultra-ClearTM ½ x 2 pol (13 x 51 mm) tubos de ultracentrífuga para o SW55 (Beckman, cat. nº 344057) | |||
| Polialômero 9/16 x 3 ½ em tubos de ultracentrífuga (14 x 89 mm) para a ultracentrífuga SW41 (Beckman, cat. no. 331372) | |||
| L8-80M (Beckman) | |||
| Agulha de seringa romba de aço, 4 polegadas, 16 G (Aldrich, cat. no. Z261378) | |||
| Seringa de 1 ml com agulha de 27 G½ (Becton Dickinson, cat. no. 309623) | |||
| Seringa de 5 ml (Becton Dickinson, cat. no. 309646) | |||
| Rotador de tubo | |||
| Microcentrífuga, refrigerado | |||
| Sistema de fracionamento de gradiente de densidade (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179) | |||
| TracerDAQ (Computação de Medição) | |||
| Rotor Eppendorf A-4-81 (Eppendorf, cat. nº 022638807) |
Referências
- World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
- Livincstone, F. B. Malaria and human polymorphisms. Annu Rev Genet. 5, 33-64 (1971).
- Nagel, R. L., Roth, E. F. Malaria and red cell genetic defects. Blood. <....
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Reimpressões e permissões
