Construção de-base celular Neurotransmissores fluorescentes Engineered Repórteres (CNiFERs) para detecção óptica de neurotransmissores In Vivo

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para criar baseada em células neurotransmissor fluorescentes repórteres modificadas (CNiFERs) para a detecção óptica de liberação do neurotransmissor volumétrica.

Resumo

Com base nas células repórteres fluorescentes neurotransmissor modificadas (CNiFERs) fornecer uma nova ferramenta para neurocientistas para detectar opticamente a libertação de neurotransmissores no cérebro in vivo. A CNiFER específica é criada a partir de uma célula de rim embrionário humano que expressa estavelmente um receptor específico G acoplado a proteína, que os casais a G _{q / 11} proteínas G, e uma baseada em FRET Ca ²⁺ -detector, TN-XXL. A activação do receptor conduz a um aumento no sinal de FRET. CNiFERs tem sensibilidade nM e uma resposta temporal do segundo porque um clone CNiFER utiliza o receptor nativo para um neurotransmissor particular, por exemplo, para D2R dopamina. CNiFERs são directamente implantadas no cérebro, permitindo-lhes sentir a libertação de neurotransmissores, com uma resolução espacial de menos de cem um, tornando-as ideais para medir a transmissão de volume in vivo. CNiFERs também podem ser utilizados para pesquisar outros fármacos para o potencial reactividade cruzada em VIvo. Nós recentemente expandiu a família de CNiFERs para incluir GPCRs que o casal a G _{i / o} G proteínas. CNiFERs estão disponíveis para a detecção de acetilcolina (ACh), dopamina (DA) e norepinefrina (NE). Dado que qualquer GPCR pode ser utilizado para criar um novo CNiFER e que há aproximadamente 800 GPCRs no genoma humano, descrevemos aqui o procedimento geral para conceber, realizar, e testar qualquer tipo de CNiFER.

Introdução

Para entender completamente como os neurônios se comunicam no cérebro, é necessário ter um método para medir a liberação de neurotransmissores in vivo. Existem várias técnicas bem estabelecidas para a medição in vivo neurotransmissores. Uma técnica utilizada é de microdiálise, em que uma cânula é inserida no cérebro e um pequeno volume de fluido cerebrospinal são recolhidas e analisadas por cromatografia líquida de elevado desempenho e detecção electroquímica ^1. Microdiálise tem uma resolução espacial na ordem de alguns diâmetros da sonda, por exemplo, ~ 0,5 mm para uma microssonda de 200 um de diâmetro. A resolução temporal desta técnica, no entanto, é lento devido a intervalos de amostragem que duram tipicamente ~ 5 minutos ou mais ^1. Além disso, as análises não são feitos em tempo real. Uma outra técnica é a pesquisa rápida voltametria cíclica (FSCV), que usa uma sonda de fibra de carbono que é introduzido no cérebro. FSCV tem excelente Tempresolução oral (subsecond), de alta sensibilidade (nanomolar), e resolução espacial com o diâmetro da sonda de 5 a 30 um. No entanto, está limitado a FSCV transmissores, que produzem uma característica de oxidação e redução perfil com tensão em uma sonda potenciométrica de carbono ^2.

Uma terceira técnica para medir neurotransmissores é diretamente através de neurotransmissores geneticamente codificado (NT) biossensores ^3. Com este método, uma proteína de fusão é criada que contém um domínio de ligação ao ligando para um transmissor acoplado a uma transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) par com base na fluoróforos de ⁴ ou ⁵ permutado um GFP. Ao contrário dos dois métodos anteriores, estes biossensores são geneticamente codificado e expresso na superfície de uma célula hospedeira, tal como um neurónio, através da produção de animais transgénicos ou de forma aguda com a utilização de agentes virais para infectar as células. Até à data, biossensores geneticamente codificados só foram desenvolvidos para detecting glutamato e GABA ^3-5. Limitações com estas técnicas têm sido a baixa sensibilidade, na gama nM, e a incapacidade para expandir a detecção de um grande número de emissores, por exemplo, neurotransmissores clássicos, neuropéptidos e neuromoduladores, que sinalizam através de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). Na verdade, existem cerca de 800 GPCRs no genoma humano.

Para lidar com essas deficiências, desenvolvemos uma ferramenta inovadora para liberação medida opticamente de qualquer neurotransmissor que sinaliza através de um GPCR. CNiFERs (com base nas células repórteres fluorescentes modificadas neurotransmissor) são células HEK293 clonais manipuladas para expressar um GPCR específico que, quando estimulados, desencadeia um aumento na intracelular ^{[Ca2 +]} que é detectado por um sensor baseado em FRET de Ca ²⁺ geneticamente codificado, TN-XXL. Assim, obrigatório neurotransmissor CNiFERs transformar-se numa alteração na fluorescência, proporcionando uma óptica R em tempo real e directa do receptoread-out da actividade neurotransmissora local. Ao utilizar o receptor nativo para um determinado neurotransmissor, CNiFERs reter a especificidade química, afinidade e dinâmicas temporais dos receptores expresso endogenamente. Até à data, criámos três tipos de CNiFERs, um para detectar a acetilcolina utilizando o receptor M1, um para a detecção de dopamina utilizando o receptor D2, e um para detectar a norepinefrina usando o receptor de ^6,7 α1a. A tecnologia CNiFER é facilmente expansível e escalável, tornando-se passível de qualquer tipo de GPCR. Neste artigo Jove, que descrevem e ilustram a metodologia para conceber, realizar, e teste em CNiFERs vivo para qualquer aplicação.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo estão em conformidade com Institutional Animal Care e diretrizes Use Committee (IACUC), e tenham sido aprovados pelas IACUCs no Icahn Escola de Medicina Monte Sinai e da Universidade da Califórnia, San Diego.

1. Gerar GPCR-expressando Lentivírus para transformar células HEK293

1. Obter o ADNc para um GPCR específico a partir de uma fonte comercial, por exemplo, cdna.org. Alternativamente, amplificar o gene GPCR a partir de uma biblioteca de ADNc utilizando PCR. Obter um vector expressando-lentivírus, tais como pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (pCDH). Use este vector para propagar o ADN, bem como para gerar lentivírus.
2. Clonar o cDNA de GPCR para o vector que expressa lentivírus por PCR. Veja Lorenz ^8, para obter detalhes sobre subclonagem PCR.
3. Expandir e purificar o GPCR-pCDH DNA usando um 'maxi' kit de preparação livre de endotoxinas de acordo com as instruções do fabricante. Confirmar que o cDNA de GPCR subclonado pCDH é mutation-livre por sequenciação de ADN.
   Nota: Antes de submeter a DNA para produção de vírus, digerir uma aliquota com a enzima de restrição apropriada para confirmar o tamanho de inserção e pureza de DNA.
4. Gerar lentivírus usando uma instalação do núcleo do vírus, como um no Instituto Salk, da Universidade de Penn., Ou Universidade da Carolina do Norte, etc., ou gerar in-house ^9. Usar cerca de 25 ug (> 1 mg / mL) de ADN livre de endotoxina para a transfecção de células HEK em um frasco T75. Certifique-se de que o ADN seja de elevada pureza, com uma razão de absorvância _(A260 / _A280) de ~ 1,8.
   Nota: Os títulos de vírus ~ 10 ¹¹ -10 ¹² GC / ml são ideais para a transdução de células HEK293.

2. Escolher HEK293 / TN-XXL Tipo Backbone celular para a cultura in vitro

Nota: determinar a especificidade de acoplamento à proteína G, por exemplo, G _{i / o,} G _{q / 11,} ou proteínas G G _S, do GPCR, como esta dicstados se uma quimera da proteína G é necessária para a CNiFER. Para G _q receptores -coupled, por exemplo, receptor muscarínico M1, escolha HEK293 / TN-XXL (# 3G8) como a espinha dorsal tipo de célula HEK293. Para G _{i / o} -coupled receptores, o quimérico G proteína G _qi5 é necessária ^10. Para receptor -coupled G _s, a quimera _QS5 L ¹⁰ é necessária. Neste protocolo, a construção de um D2R CNiFER é utilizado como um exemplo. Sinais D2R através de G _{/ S} G proteínas e requer células HEK293 que expressam de forma estável a proteína G quimérica, _qi5 G, por exemplo, _qi5 HEK293 / TN-XXL / G _ # qi5.6.

1. Obter os _qi5 HEK293 / TN-XXL / G _ # qi5.6 células clonais de um laboratório de pesquisa. Nota: Os seguintes células clonais, HEK293 / TN-XXL (# 3G8) para os receptores _q -coupled G, HEK293 / TN-XXL / G _qi5 (# qi5.6) para G _{i / o} -coupled receptores, e HEK293 / TN -XXL / G _QS5 (# qs5.47) para G _s re -coupledceptores, estão disponíveis gratuitamente, mediante solicitação ^6,7.
2. Crescer e expandir _qi5 HEK293 / TN-XXL / G _ # qi5.6 para ~ 90% de confluência num frasco T25 com 5 ml de meio de crescimento de células HEK293 (Tabela 1). Crescer as células numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% (v / v) _{de CO2.}
   Nota: Todos os trabalhos com a cultura de células HEK293 que deve ser levada a cabo usando técnicas de cultura de tecidos estéreis padrão.
3. Colher as células HEK293 pela primeira aspiração de mídia a partir de frasco T25. Lavar as células com cuidado pela adição de 5 ml de PBS e de balanço balão.
4. Remover o PBS e adicionar 1 ml de 0,05% (w / v) de tripsina / EDTA (Tabela 2). Incubar durante 1 a 2 minutos a 37 ° C com 5% (v / v) _{de CO2.}
5. Coletar células e transferir para estéril tubo de 15 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 1.000 xg numa centrifugadora de cultura de células. Aspirar o sobrenadante.
6. Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio de crescimento de células HEK293. Contar as células num hemocitómetro utilizandoazul de tripano. Calcular a densidade celular e vá para a etapa 3.

3. Transdução Lentivirus de HEK293 / TN-XXL células / Gqi5

1. Semear um frasco T25 com 0,7 x 10 ⁶ células _qi5 HEK293 / TN-XXL / g. Crescer as células numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% (v / v) _{de CO2} até ~ 50% confluentes, após cerca de 1 dia. Congelar as células restantes (passos 8,2-8,3). Estas células servirá como controlo CNiFER, isto é, um que não possui o CNiFER GPCR.
2. No dia da infecção, diluir a lentivírus que expressa GPCR (passo 1.4) para uma concentração final de 10 ~ ⁹ GC / ml num volume total de 2 ml de meio de crescimento de células HEK293 (Tabela 1). Por exemplo, adicionar 20 ul de 10 ¹¹ GC vírus / ml a 2 ml de meio em um frasco T25.
   Nota: A informação título do vírus devem ser fornecidos pela instalação do núcleo do vírus. Combine lentivírus e mídia em um tubo de centrífuga e triturar suavemente. Altos títulos de lentivIrus são de nível de biossegurança 2 (BSL-2).
3. Aspirar a mídia do frasco T25. Adicione as 2 ml de vírus / mistura de mídia a partir do passo 3.2. Incubar o balão T25 O / N a 37 ° C com 5% (v / v) _{de CO2.}
4. Depois de um dia da infecção, aspirar o / mistura meios de vírus e substitui-lo com HEK293 meio de crescimento contendo puromicina (2 pg / ml; Tabela 1). Puromicina selecciona para que as células transduzidas. Incubar o balão a 37 ° C com 5% (v / v) _{de CO2} até cerca de 90% confluentes, após o ~ 1-2 dias.
5. Prepara-se uma placa de 96 poços (preto com fundo claro) revestidos com fibronectina, para gerar uma curva de agonista / activação 10-ponto no passo 4.1. Numa hote estéril, adicionar 50 ul de fibronectina (5 ug / ml) por poço nas linhas A e B da placa de 96 poços. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 1 h. Lavar duas vezes durante 5 min por lavagem com PBS. Adicionar 50 ul de meio de crescimento e incubar HEK293 O / N a 37 ° C com 5% (v / v) _{de CO2.}
   Nota: Fibronplacas tratadas com ectin estão comercialmente disponíveis.
6. Colher as células no frasco T25, tal como descrito nos passos 2,3-2,6 (Tabela 2).
7. Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio de crescimento de células HEK293. Semente um frasco T25 com 1,5 ml de células para análise de FACS. Além disso, semear um frasco T75 com 1 ml de células para congelação e armazenamento (consulte os passos 8,2-8,3)
8. Para a curva de agonista de 10-ponto, semear as primeiras duas filas (A e B) de uma placa de 96 poços revestidas com fibronectina (a partir do passo 3,5) com 100 ul da suspensão de células por poço.
9. Incubar as células HEK293 que crescem em um frasco T25, um frasco T75 e uma placa de 96 poços até cerca de ~ 90% confluentes a 37 ° C com 5% (v / v) de CO _2, depois de ~ 1-2 dias.

4. FACS e isolamento de solteiro CNiFER Clones

1. Utilizar a placa de 96 poços para gerar uma curva de activação agonista de 10 pontos.
   Nota: antes de iniciar a triagem de células activadas por fluorescência (FACS), é importante para confirmar aexpressão do GPCR, testando células transduzidas para uma resposta agonista (10-ponto da curva agonista). Este ensaio é realizado utilizando um leitor de placas fluorométrico.
   1. Prepara-se uma placa de fármaco para a curva de activação agonista de 10 pontos. Escolha 10 diferentes concentrações de agonista que encerrem o previsto EC _50, que podem ser determinados a partir da literatura.
      Nota: A placa de droga contém de 3 vezes de cada concentração (em duplicado) para ajustar para a diluição de 1: 3 na placa CNiFER. Por exemplo, a placa de droga para testar um D2 CNiFER contém 10 diferentes concentrações de dopamina a concentrações 3 vezes; 0,2, 0,5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50 e 1000 nM. Na placa CNiFER, por conseguinte, as concentrações finais de dopamina são de 0,067, 0,167, 0,333, 1,00, 1,67, 3,33, 6,67, 10,0, 16,7, e 333 nM.
   2. Preparar as soluções usando agonistas de fluido espinal cerebral artificial (ACSF) (Tabela 1). Usar dois poços para 'ACSF', por exemplo, A1 e A2,e dois poços para 'nenhuma célula', por exemplo, B1 e B2.
      Nota: Preparar diferentes concentrações de medicamentos utilizando um método de diluição em série. Criar um modelo para manter o controle de clones CNiFER e as concentrações da droga (Figura 3).
   3. Usar o software para programar o leitor de placas de 96 poços fluorométrico para a medição de FRET e executar as transferências de solução.
      1. Ajustar a temperatura leitor de placas a 37 ° C.
      2. Para a medição de FRET com TN-XXL, definir o comprimento de onda de excitação a 436 ± 4,5 nm (centro ± HWHM). Defina os filtros de emissão para 485 ± 7,5 nm para eCFP e para 527 ± 7,5 nm para Citrino. Definir o filtro de corte a 475 e 515 nm para eCFP e citrino, respectivamente.
      3. Programar o leitor de placas para medir a emissão a 485 nm e 527 nm a cada 4 segundos para um total de 180 seg. Escolha a opção de administrar 50 uL da placa de fármaco de 3 vezes para os 100 ul na placa CNiFER, após a recolha de 30 segfluorescência basal.
   4. Aspirar a mídia de linhas A e B e adicione 100 ml de ACSF à placa de 96 poços CNiFER que é ~ 90% confluentes (passo 3.9).
   5. Carregar a placa de 96 poços e a CNiFER '3-dobra "placa de droga no leitor de placas. Permitir ~ 30 min para equilibrar as placas a 37 ° C. Em seguida, iniciar o programa.
   6. Para analisar os dados leitor de placas, exportar os valores de fluorescência para uma planilha. Criar uma fórmula para subtrair as medições de fundo (tomadas para cada sinal de poços sem células) de poços com CNiFERs. Normalizar intensidades de fluorescência para as linhas de base de estímulo pré, F _Citrino (t) / F _Citrino (baseline), e calcular a relação FRET (ΔR / R;. Eqn 1) com as respostas de pico em 527 nm e 485 emissões nm (veja o passo 11 ).
      Nota: Se houver uma alteração significativa na ΔR / R com o agonista, então isso indica expressão do GPCR e pode-se proceder à análise por SCAF (passo 4.2). Se there há resposta de FRET com agonista, solucionar usando um ionóforo de ^{Ca2 +,} por exemplo, A21387, para testar a resposta de Ca ²⁺ e confirmar que o sensor baseado em FRET está a trabalhar. Se o ionóforo funciona, então, o receptor foi expresso não é provável.
2. No dia antes de FACS, preparar a quatro placas de 96 poços revestidas com fibronectina (ver passo 3.5) para recolher as células separadas. Adicionar 50 ul de meio de crescimento e incubar HEK293 O / N a 37 ° C com 5% (v / v) _{de CO2.}
3. Prepare a 5% (w / v) de BSA em PBS (5 g / 100 ml) e filtra-se (0,2 um) para um frasco estéril.
4. Colher as células cultivadas no frasco T25 (ver passos 2,3-2,5, Tabela 2). Ressuspender o sedimento de células em 4 ml de 5% (w / v) de BSA em PBS. Centrifugar as células a 1000 xg durante 5 min.
5. Aspirar os meios de comunicação e ressuspender o sedimento de células em ~ 5 ml de 5% (w / v) de BSA em PBS para dar uma concentração final de 5 x 10 ~ ⁶ células / ml.
   Nota: Verifique com a FACS instalação do núcleo de requisitos específicos sobre a densidade de células e condições de classificação.
6. Filtrar as células ressuspensas com um filtro celular de 40 um para eliminar os aglomerados. Transferir as células para um polipropileno de 5 ml de tubo redondo de fundo. Colocar o tubo em gelo durante o transporte para a instalação de FACS.
7. Organizar os HEK293 células transduzidas em uma instalação FACS. Programa os parâmetros com um citómetro de fluxo FACS como se segue: definir 4 ° C para o suporte de amostras, de 100 um para o bocal e 20 psi. Com base na análise pré-tipo, selecione as células, isto é, escolher um 'gate', que tem uma grande fluorescência eCFP (eCFP de excitação, emissão eCFP) e grandes FRET (excitação eCFP, emissão Citrino) de fluorescência (ver resultado abaixo, Figura 2 ).
8. Depósito indivíduo, as células classificadas em uma placa de 96 poços preparado na etapa 4.2, com um clone por poços contendo 50 uL de meio de crescimento HEK293 com puromicina. Adicionar 50 ul de meio de crescimento HEK293 com puromicina (Table 1) para um total de 100 ul por poço. Manter as células O / N a 37 ° C com 5% (v / v) _{de CO2.}
   Nota: o meio de crescimento HEK293 contém puromicina para selecção de células transduzidas.

5. Cultivar e expansão do Ordenado, CNiFERs clonais

1. Manter as CNiFERs nas placas de 96 poços, removendo 50 ul de meios de idade de cada poço e substitui com 50 ul de meio de crescimento fresco contendo puromicina HEK293 (Tabela 1). Repetir este a cada 5 a 7 dias até ~ 90% confluentes, após 2-3 semanas.
2. células colheita CNiFER aspirando delicadamente os meios de comunicação e enxaguar uma vez suavemente com PBS. Remover o PBS e adicionar 20 ul de 0,05% (w / v) de tripsina / EDTA. Incubar durante 1 a 2 minutos a 37 ° C com 5% (v / v) _{de CO2.}
3. Adicionar 100 ul de meio de crescimento para células HEK293 tratadas com tripsina e ressuspender as células. conteúdos de transferência para uma placa de 24 poços contendo 400 ul fresco HEK293 meios de crescimento da sagacidadeh puromicina. Na placa de 24 poços, a manter as células através da substituição de 250 ul de meio de crescimento HEK293 cada 5-7 dias até os poços são ~ 90% confluentes.

6. Identificar CNiFERs candidato com base em FRET Response Usando Plate Reader Fluorométrica

Nota: Com quatro placas de 96 poços seguindo FACS, não devem ser> 100 clones testáveis ​​que sobrevivem e se expandem para a etapa de placas de 24 poços, uma vez que muitos dos clones originais não conseguem crescer. Para identificar CNiFERs candidatos potenciais, use uma análise de 3 pontos para a resposta traste com agonista cognato, por exemplo, a dopamina para D2R.

1. Quando as células estão 90% confluentes ~ na placa de 24 poços, aspirar cuidadosamente os meios de comunicação. Adicionar 100 uL de ~ 0,05% (w / v) de tripsina / EDTA e incubar durante 1-2 min a 37 ° C com 5% (v / v) _{de CO2.} Adicionar 400 ul de meio de crescimento para células HEK293 tratados com tripsina e misturar as células por trituração suave.
2. Configurar a curva de agonista de 3 pontos para a triagem inicial do clones. Para cada clone CNiFER, ou seja, um dos poços da placa de 24 poços, alíquota de 100 ul da suspensão de células (~ 4 x 10 ³ células / poço) em cada um de três poços, por exemplo, A1, A2, A3, de uma placa de 96 poços revestidos com fibronectina (preto com fundo transparente) (veja o passo 3.5).
3. Transferir os restantes ~ 200 uL da suspensão de células para uma placa de 12 poços contendo 1000 mL de meio de crescimento de células HEK293 (1,2 ml de volume final). Incubar ambas as placas a 37 ° C com 5% (v / v) _{de CO2,} até ~ 90% confluentes. A placa de 96 poços é para o ensaio fluorimétrico e a placa de 12 poços é para o crescimento e expansão dos clones.
4. Para a análise de 3 pontos, determinar três diferentes concentrações de agonista que são 0,1-, 1.0-, e 10 vezes a EC ₅₀ para o GPCR específico. Preparar as concentrações agonistas em uma placa de fármaco, tal como descrito nos passos 4.1.1-4.1.2. Realizar um ensaio de leitor de placas fluorométrico como descrito nos passos 4.1.3-4.1.5.
5. Calcule o FRproporção ET (ΔR / R), tal como descrito no passo 4.1.6. Escolha CNiFERs que têm sensibilidade adequada e maior resposta FRET para a expansão, o congelamento de volta, e análises mais abrangentes (Passo 7).
6. Para os clones que foram seleccionados na etapa 6.5 e estão crescendo na placa de 12 poços, remover e substituir os 600 ul de meio de crescimento HEK293 a cada 5 a 7 dias, até que ~ 90% confluentes.
7. Gradualmente expandir os clones a partir de uma placa de 12 poços para uma placa de 6 poços, e, em seguida, para um frasco T25 (passos 2,3-2,6 e Tabela 2). Quando o frasco T25 é ~ 90% confluentes, as células de colheita, tal como descrito (passos 2,3-2,5). Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio de crescimento de células HEK293.
8. Adicionar 1 ml de suspensão de células para um frasco T75 com 9 ml de meio de crescimento de células HEK293. Usar os restantes 4 ml da suspensão de células para crioprotecção e armazenamento em _N2 líquido (passos 8,2-8,3). Prepare oito 1,5 ml criotubos e colocar no gelo.
9. No frasco T75, manter as células, substituindo a W meiosom meios de crescimento HEK293 fresco, por exemplo, 10 ml a cada 3-5 dias até 70-80% confluentes, após ~ 1-2 semanas.

7. A selecção final do CNiFER Clones Usando Plate Reader Fluorométrica

1. No dia antes do ensaio leitor de placas:
   1. Células colheita de um frasco confluente T75 ~ 90% (ver passos 2,3-2,6, Tabela 2). Propagar uma placa revestida com fibronectina de 96 poços (preto com fundo claro) a 5 x 10 ⁴ / cavidade com ~ 100 ul de suspensão de células. Nota: Um clone é distribuído numa única placa de 96 poços.
2. Prepara-se uma placa de fármaco para o rastreio abrangente de clones CNiFER, distinguindo respostas agonistas específicos de respostas CNiFER não-específicos.
   1. Para gerar uma curva de dose-resposta completa, 10 escolher diferentes concentrações de agonista em torno da CE ₅₀ previsto. Use dois poços para 'nenhuma célula' e dois poços para 'ACSF'.
   2. Para determinar as respostas não específicas, escolha thrAs concentrações de ee de 12 neurotransmissores diferentes ou moduladores (72 poços) (Figura 3). Como o agonista, a placa de fármaco contém concentrações de 3 vezes em duplicado. Por exemplo, a 100 ul de três diferentes concentrações de acetilcolina, o glutamato, orexina, VIP, adenosina, serotonina, norepinefrina, o GABA, a substância P, a melatonina, a somatostatina e histamina, cada um a uma concentração de 3 vezes de 50, 1000, e 3000 nM são carregados para a placa de 96 poços de drogas.
3. Defina os parâmetros no leitor de placas fluorom�rica para medir FRET e realizando transferências de solução como descrito nos passos 4.1.3-4.1.5.
4. Para análise da curva de resposta à dose completa, o cálculo da relação de pico de FRET (ΔR / R) (passo 4.1.6), lote como uma função da concentração do agonista de registo e se encaixam com a equação de Hill (passo 11.4). Determinar a EC _50, o coeficiente de Hill, e relação de FRET máxima. Para o 12 outros neurotransmissores / moduladores, pico trama ΔR / R como função oconcentração da droga f.
5. Escolha clones de ~ 10 CNiFER que têm uma grande proporção de FRET, uma CE ₅₀ apropriado para o agonista de cognato, e respostas pouca ou nenhuma experiência para outros agonistas de neurotransmissores (resposta não específica).

Clones CNiFER 8. Freeze-volta seleccionados

1. Usar um frasco confluente T75 ~ 90% de um clone CNiFER indivíduo. Células colheita como descrito (passos 2,3-2,5, Tabela 2). Para as células congelação, ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio de crescimento de células HEK293. Rotular dez 1,5 ml criotubos e definir em gelo.
2. Para crioprotecção, misturar células de 1: 1 com 20% (v / v) de DMSO em meio de crescimento de HEK293, por exemplo, 5 ml de 20% (v / v) de mistura de DMSO / meio é suavemente misturada com 5 ml de suspensão de células (Final concentração de DMSO é de 10%).
3. Aliquota de 1 ml em cada um dos tubos criogénicos. Congelar tubos com células em uma -80 ° C congelador O / N, em uma caixa com isolamento de espuma (veja Materiais). Transferência criotubos para LIQUID de azoto para armazenamento a longo prazo.

9. CNiFER implantação no rato Cortex

1. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em uma autoclave antes da cirurgia. Prepare um campo semi-estéril para a cirurgia, limpando com 70% de etanol e estabelece uma fralda laboratório limpo.
2. Prepare a pipeta de injeção CNiFER puxando um capilar de vidro (id de 0,53 mm) em um extrator eletrodo vertical. Use um par de nenhum. 5 uma pinça de ponta fina para quebrar a ponta do eléctrodo para um diâmetro de ~ 40? M.
   Nota: Este é melhor realizado sob um microscópio estéreo zoom com uma retícula.
3. Anestesiar um adulto (dia pós-natal 60-90) C57BL / 6 mouse com isoflurano: 4% (v / v) para a indução e 1,5 a 2,0% (v / v) para manutenção. Use cauda ou pitada dedo do pé para se certificar de que o rato está totalmente anestesiado.
   Nota: Re-pitada e avaliar periodicamente suiça contrair-se durante toda a cirurgia para reavaliar profundidade da anestesia.
4. Cobrir os olhos com pomada oftálmica para psecagem revent. Monte o mouse em um quadro estereotáxico com barras de ouvido. Manter a temperatura do corpo do rato a 37 ° C utilizando uma almofada de aquecimento regulada por uma sonda rectal.
5. Raspar uma área de aproximadamente 5 mm por 12 mm com um barbeador elétrico animal. Aplicar Betadine seguido por 70% (v / v) de isopropanol. Usar uma lâmina de bisturi para cortar e remover a pele sobre a superfície do crânio. Usar uma lâmina de bisturi para remover o periósteo da superfície do crânio. Expor e limpar a superfície do crânio, como descrito para a cirurgia estereotáxica ^11.
6. Abaixe uma pipeta de vidro vazio para bregma e registrar o antero-posterior (A / P) e médio-lateral (M / L) coordena. Referindo-se o atlas do cérebro do rato, calcular a posição do local de injecção. Deslocar a pipeta para o site de destino e marcar o crânio para a formação janela subsequente. Veja Cetin et al. Para obter detalhes sobre as injecções estereotáxicas com roedores ^11.
   Nota: O local da injecção e janela dependem do Região a ser estudado e a distribuição das projecções de neurotransmissores ou péptido libertando no córtex. Por exemplo, em uma recente publicação ^7, coordena o estereotáxico 1,0-2,0 mm A / P e +1,0 a 2,0 milímetro M / L foram usadas para injetar células CNiFER no córtex frontal para imagiologia in vivo da libertação de dopamina durante o condicionamento clássico .
7. Formar um 2 milímetros janela do crânio diluído x 3 mm, como descrito anteriormente ^12,13.
   Nota: O osso na janela deve ser de 15-20 mm de espessura. Os pontos brancos pequenos no osso não deve ser visível quando a superfície do crânio é humedecido, se o osso for suficientemente diluído ^12,13.
8. Coloque um ACSF embebido esponja sobre a janela para mantê-la úmida enquanto prepara as células para injetar.
9. Colheita do clone CNiFER que foi cultivado num balão T75 com ~ 80% de confluência. Aspirar a mídia e lavar as células com PBS estéril.
   Nota: A tripsina é omitido para estes passos.
10. Remover PBS e usar 10 ml de of ACSF para desalojar as células a partir do fundo do balão. Triturar células para dissociar aglomerados de células. Centrífuga e ressuspender o sedimento em 100 ul de ACSF. Centrifugar durante 30 segundos a 1400 x g e eliminar o sobrenadante, deixando um pelete coberto em ACSF. Esta etapa deixa um amontoado de células em suspensão.
11. Aterrar a pipeta de injeção preparada no passo 9.2 com óleo mineral, carregar a pipeta em um nanoinjector, e fazer avançar o êmbolo para ejetar uma pequena gota de óleo. Coloque 5 ul de suspensão de células CNiFER em uma tira de filme de parafina plástico perto a preparação mouse. Elaborar tanto os CNiFERs ou controlar células CNiFER para a pipeta puxado.
12. Mover a pipeta para o alvo coordenadas X e Y, ou seja, A / P e M / L anotou na etapa 9.5. Diminuir a pipeta, perfurando o crânio diluído, e continuar a 200-400 ~ ^ M abaixo da superfície do crânio, para depositar camadas de células CNiFER em 2/3 do córtex.
13. Injectar ~ 4,6 nl de células CNiFER no local mais profundo com o nanoinjector, movimento nota na interface do petróleo e celular e depois esperar por 5 min para as células para dispensar. Retirar a pipeta ~ 100 mm e injetar outra ~ 4,6 nl de células CNiFER, espere 5 minutos. Em seguida, retirar a pipeta devagar e com cuidado para evitar o refluxo dos CNiFERs. Repetir injecção em um ou mais sítios adjacentes.
14. Repita os passos de injecção 9,8-9,12 com controle HEK293 células (ou seja, _qi5 HEK293 / TN-XXL / G clone falta GPCR). Separa-se a CNiFER e controlar locais de injecção de células de ~ 200 pM.
15. Depois de concluir implantações de células, lavar a janela de caveira diluído com ACSF e esperar que o crânio para secar. Aplicar uma gota de cola de cianoacrilato (ver Materiais) ao longo da janela e rapidamente colocar uma tampa de vidro pré-cortado estéril em cima da cola. Com cuidado, empurre a tampa de vidro contra o crânio por alguns segundos. Deixe a cola secar por 2 min ^12,13.
16. Selar as bordas da tampa de vidro com cimento dental e forma awell em torno da janela de reter a água para que o objectivo de imersão.
17. Para imobilizar a cabeça do rato durante o exame, anexar uma custom-built cabeça-bar com uma pequena gota de cola de cianoacrilato por trás da janela (veja a ¹⁴ para obter detalhes sobre a dimensão e materiais). Deixe a cola secar completamente e depois adicionar cimento dental adicional para reforçar ainda mais a custom-built cabeça-bar.
18. Cobrir o resto da superfície do crânio, excepto para a janela, com uma camada de cimento dental. Verifique se as bordas da pele são cobertas por cimento e deixe secar por 20 min.
19. Após a cirurgia, pare administração de isoflurano e deixar o mouse sobre uma almofada de aquecimento em uma gaiola até que se recupere totalmente da anestesia. Injectar 5% (w / v) de glucose em solução salina (SC) para a reidratação e 0,05 a 0,1 mg / kg de buprenorfina (ip, de libertação instantânea) para analgesia pós-operatória.
    Nota: Para minimizar a potencial reação imunológica aos CNiFERs humanos, injetar o mouse diariamente com 20 l / 100 g de ciclosporine (ip), a partir do dia antes da injeção de CNiFERs.
20. Devolver o mouse para sua gaiola para comida e água.

10. In vivo de imagens de CNiFER Clones

Nota: Imagens ao vivo é realizado com camundongos, usando um microscópio de dois fotões e um aparelho de cabeça fixa. Sem anestesia é necessário durante as sessões de imagem. Quando imagiologia animais no estado desperto, limitar apoio de cabeça a apenas algumas horas de cada vez para reduzir os níveis de estresse. Devolver o animal para que gaiola entre as sessões de imagem para comida e água. potencial estresse é minimizado por escurecendo as luzes da sala e ao redor parte do mouse em um gabinete.

1. No dia após a cirurgia, montar o mouse sobre uma plataforma de imagem, enroscando o metal cabeça-bar implantados no crânio ao quadro cabeça-fixação.
   Nota: Quando imagiologia ratos acordados, a sessão de imagem não deve exceder algumas horas devido ao potencial de estresse induzido pelo dispositivo cabeça-contenção.
2. Coloque a plataforma de imagem com o mouse conteve-cabeça em um microscópio de imagem de dois fótons equipado com um 10X (0,30 NA) e 40X (0,80 NA) Objectivos de imersão em água.
3. Insira cubo de filtro para FRET imagem (eCFP e citrino) que tem um espelho dicróico de 505 nm e filtros passa-banda que se estendem por 460 nm a 500 nm para medir eCFP e 520 nm a 560 nm para medir a citrina.
4. Adicionar ACSF para a janela-crânio diluído bem conter e diminuir a objectiva de imersão em água na ACSF. Utilize a ocular em conjunto com a lâmpada de mercúrio e cubo de filtro GFP para localizar a superfície do córtex e da vasculatura abaixo da janela.
   Nota: O padrão da vasculatura e ajuda a localizar a imagem da mesma região ao longo de dias repetidos de imagiologia. Alterne para a objectiva de imersão em água 40X para localizar CNiFERs, concentrando-se manualmente na superfície do córtex sobre as células usando o cubo de filtro GFP e uma lâmpada de mercúrio.
5. Configurar para geração de imagens de dois fótons. Seleccione a apcaminho da luz propriate para geração de imagens de dois fótons. Para um sistema comercial típica, usar o software para mudar para o modo de imagem de dois fótons e redirecionar luz aos tubos fotomultiplicadores (PMTs) nos detectores não descanned. Ligue o próximo laser pulsado femtosecond infravermelho, selecione um comprimento de onda de 820 nm e uma potência de 5-15%. Nota: A potência de 5% normalmente fornece ~ 25 mW no espécime.
6. Definir a tensão PMT1 & PMT2 perto do valor máximo, tipicamente 700-1,000 V dependendo da PMT. Definir o ganho de 1 para cada canal e zero a posição z para o objectivo.
7. Abaixe o objetivo ~ 100 a 200 mm a partir da superfície cortical e começar a varredura xy. Ajustar a potência do laser, ganho e de voltagem PMT para cada canal, isto é, eCFP e citrino, para optimizar a relação sinal-ruído de fluorescência CNiFER.
8. Utilizar a função de zoom no software para restringir a imagem de uma região que contém as células CNiFER, bem como um backgrounregião d. Use uma taxa de varredura não mais lento do que um quadro a cada 2 segundos (0,5 Hz) em 4 mS por pixel. Ajuste da linha média para a proporção adequada de sinal-ruído, por exemplo, de Kalman 2 linha média.
9. Desenhe uma região de interesse (ROI) em torno de células CNiFER, em torno de cerca de 3 a 4 células por avião. Configurar análise em tempo real de ROI intensidades médias. Comece aquisição para monitorar CNiFER fluorescência ao longo do tempo.
10. Recolha de fluorescência a partir de CNiFERs antes e durante as manipulações experimentais, por exemplo, estimulação eléctrica, a estimulação ChR2, de comportamento, tal como determinado pelo utilizador.
11. Quando o experimento de imagem está completado, o rato retornar à sua gaiola. Repetir a imagiologia através dia, como desejado. Quando re-imagem das células consulte a imagem vasculatura de baixa ampliação previamente adquirido para orientar volta para o mesmo campo de imagem (passo 10.4).
    Nota: CNiFERs implantados podem ser visualizados por pelo menos 7 dias.

Análise 11. Dados

ficheiro de imagem Abrir e selecione ROI é para CNiFERs e um ROI para o fundo. Selecione 'análise de séries' para ambos os canais de cada ROI. Exportação intensidade de fluorescência média para cada ROI como um arquivo delimitado por tabulação.

Use um software de matemática (veja Materiais) programa para analisar valores de fluorescência. filtro passa-baixa (0,3 Hz) cada sinal e, em seguida, subtrair a fluorescência de fundo em cada ROI de ECFP e citrino intensidades de fluorescência.

Calcular a fluorescência média de linha de base e calcular rácios, como descrito na Equação 1 para medir o rácio de FRET ΔR (t) / R.

Para determinar a sensibilidade de CNiFERs, traçar a proporção de FRET como uma função da concentração do agonista de log. Se encaixam com a equação de Hill para determinar o coeficiente de CE ₅₀ e Hill (n), usando um software de estatística científica e da Colina Equation (Equação 2).

Resultados

Um CNiFER é derivada de uma célula de rim embrionário humano (HEK293) que é manipulada para expressar de forma estável pelo menos duas proteínas: uma proteína G específica acoplada do receptor (GPCR) e uma [Ca ^2+] Sensor geneticamente codificado, TN-XL. TN-XXL sofre de ressonância de fluorescência de transferência de energia (FRET) entre proteínas ciano e amarelo fluorescente, eCFP e citrino, respectivamente, em resposta ao Ca ^{2+ 6,15.} A activação de GPCR...

Discussão

A criação de CNiFERs proporciona uma estratégia inovadora e original para opticamente medição da libertação de neurotransmissores no cérebro in vivo. CNiFERs são idealmente adequados para a medição da libertação de extrasynaptic, ou seja, o volume de condução, para neurotransmissores. Importante, cada CNiFER possui as propriedades do GPCR nativo, proporcionando uma medição óptica fisiológica das alterações nos níveis de neurotransmissores no cérebro. Até à data, CNiFERs foram criados para a detecção de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro	System Biosciences	CD510B-1	Clonagem: para gerar lentivírus
12 x 75 *Tubo de Ensaio BD Falcon de Polipropileno de Alta Clareza Fundo Redondo	BD Biosciences	352063	FACS
BD 40 um Filtros de células Falcon	BD Biosciences	352340	FACS
0.05% Tripsina EDTA	Invitrogen	25200056	FACS
, fundo plano, transparente	Corning	3596	FACS
96 placas de cultura de células de poços	Corning	CLS3997	Flexstation
Optilux fundo preto transparente	Corning	3603	Flexstation
Flexstation pipet tips	Molecular Devices	9000-0911	Flexstation
Cloreto de Acetilcolina Flexstation	Sigma-Aldrich	A2661	Flexstation
Norepinefrina	Cloridrato de dopamina Sigma-Aldrich	A7256	Flexstation
	Sigma-Aldrich	PHR1090	Flexstation
GABA	Sigma-Aldrich	A2129	Flexstation
Histamine	Sigma-Aldrich	H7125	Flexstation
Glutamato	Sigma-Aldrich	49621	Flexstation
Epinefrina	Sigma-Aldrich	E4642	Flexstation
Somatostatina	Sigma-Aldrich	S1763	Flexstation
5HT	Sigma-Aldrich	H9523	Flexstation
VIP	Alpha Diagnostics Inc.	SP-69627	Flexstation
Orexin A	Alpha Diagnostics Inc.	12-p-01	Flexstation
Substância P	Sigma-Aldrich	S6883	Flexstation
Adenosina	Sigma-Aldrich	A4036	Flexstation
Melatonina	Sigma-Aldrich	M5250C	Flexstation
Leitor de Placa de Fluorescência & software	Molecular Devices	Flexstation 3	Flexstation
DMEM (glicose alta) com Glutamax	Life Technologies	10569-010	Cultura de tecidos
Soro fetal bovino	Life Technologies	10082-139	Cultura de tecidos
Pen/Strep  antibióticos	Life Technologies	15140-122	Cultura de tecidos
Puromicina	InvivoGen	ant-pr-1	Cultura de tecidos
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F0895	Cultura de tecidos
CoolCell LX Caixa de congelamento de células sem álcool com taxa controlada	Bioexpress	D-3508)	para cultura de
tecidos	Loctite	Loctite no. 495	cirurgia e injeção estereotáxica
filme plástico de parafina	VWR	Parafilm®	cirurgia e injeção estereotáxica
Nanoinjetor	Drummond	3-000-204	cirurgia e injeção estereotáxica
Eletrodos de vidro	Drummond	3-000-203G	cirurgia e injeção estereotáxica
broca manual	OSADA	Exl-M40	cirurgia e injeção estereotáxica
Rebarbas para broca	Fine Scientific	19007-05; 19007-07)	cirurgia e injeção
estereotáxicaBanho de esterilização	FST	18000-45, cirurgia de esterilizador de esferas quentes	e câmara/máscara de isoflurano de injeção estereotáxica
	Highland Medical Equipment	564-0427, máquina anestésica de mesa HME 109 com vaporizador de isoflurano, medidor de vazão de O2, válvula de gangue; 564-0852, Câmara de Indução 16X7X7,5cm	cirurgia e injeção estereotáxica
Escopo 3D com braço	Cirurgia Zeiss		e injeção estereotáxica
cirurgia de luz			e injeção estereotáxica
Betadine			cirurgia e injeção estereotáxica
70% (v/v) álcool			cirurgia e injeção estereotáxica
Almofadas de preparação de iodo-povidona	dynarex	1108	cirurgia e injeção estereotáxica
NaCl 0,9% (injeção, USP, 918610)			cirurgia e injeção estereotáxica
CICLOSPORINA (INJEÇÃO, USP)			cirurgia e injeção estereotáxica
Buprenex (injeção) buprenorfina (0,03 μ g por g roedor)	Cirurgia Sigma-Aldrich		e injeção estereotáxica
Pomada oftálmica	Akorn	NDC 17478-235-35	cirurgia e injeção estereotáxica
Cirurgia	Surgifoam Ethicon		e injeção estereotáxica
Cimento dental grip	Dentsply	#675571, cirurgia 675572	e injeção estereotáxica
SuperCola Instantânea	NDindustries		cirurgia e injeção estereotáxica
LOCTITE 4041			cirurgia e injeção estereotáxica
METABOND	C& B		cirurgia e injeção estereotáxica
nº 0 tampa de vidro	Fisher		cirurgia e injeção estereotáxica
quadro estereotáxico	Cirurgia Kopf		e injeção estereotáxica
Sonda retal e almofada de aquecimento	FHC	40-90-8D, controlador de temperatura DC, 40-90-2-06, almofada de aquecimento de 6,5X9,5 cm40-90-5D-02, cirurgia de sonda de termistor retal	de injeção estereotáxica
para imagem Cirurgia	Thorlabs		e injeção estereotáxica
Óleo mineral	Fisher	S55667	cirurgia e injeção estereotáxica
Kwik-Cast (Elastômero de silicone)		de Precisão Mundial	cirurgia e injeção estereotáxica
Sutura	Ethicon	18' ', 1667, 4-0	cirurgia e injeção estereotáxica
Tesoura	Fine Scientific Tools	91500-09, 15018-10	cirurgia e injeção estereotáxica
Forcepts	Fine Scientific Tools	11252-30; # 55, 11295-51; Grafe, 11050-10	cirurgia e injeção estereotáxica
Estudante Halsted-Mosquito Hemostats	Fine Scientific Tools	91308-12	cirurgia e injeção estereotáxica
Kit de cauterizador de pequenos vasos	Fine Scientific	Tools 18000-00	cirurgia e injeção estereotáxica
Esterilizadores de esferas quentes	Fine Scientific Tools	18000-45	cirurgia e injeção
estereotáxicaEstojo de instrumento com tapete de silicone	Fine Scientific Tools	20311-21	cirurgia e injeção estereotáxica
Recipientes de esterilização de plástico com tapete de silicone	Fine Scientific Tools	20810-01	cirurgia e injeção estereotáxica
2P escopo de fluorescência de estágio fixo para in vivo imagem	Olympus	FV1200 MPE	imagem in vivo
Laser	multifotônicoSpectraPhysics	Mai Tai DeepSee	imagem in vivo
Laser Verde Olympus		473 nm Laser	in vivo imagem
xy base translacional	Scientifica	MMBP	imagem in vivo
Cubo de filtro FRET para YFP e CFP	Olympus		imagem in vivo
10x e 40x objetivos de imersão em água	Olympus		imagem in vivo
mesa de ar	Newport		in vivo
imagem personalizada de gaiola à prova de luz	Thorlab		in vivo