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Artigo de método

Ensaio in vitro para medir Fosfatidiletanolamina Metiltransferase Atividade

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DOI:

10.3791/53302

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5 de janeiro de 2016

1Department of Biological Sciences, St John's University

Neste artigo

Resumo

O presente relato descreve um ensaio enzimático in vitro para medir a atividade da fosfatidiletanolamina metiltransferase usando extratos de células de Leishmania. Este ensaio é baseado na transferência de um grupo metil radioativo de S-[Metil-3H]adenosil-L-metionina para fosfatidiletanolamina endógena.

Resumo

As metiltransferases de fosfatidiletanolamina são enzimas biossintéticas que catalisam a transferência de um ou mais grupos metil de S-adenosil-L-metionina para fosfatidiletanolamina, monometil-fosfatidiletanolamina ou dimetil-fosfatidiletanolamina para dar monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Essas enzimas são onipresentes em células animais, fungos e também são encontradas em aproximadamente 10% das bactérias. Eles cumprem várias funções importantes na fisiologia celular além de seu papel direto no metabolismo lipídico, como resistência à insulina, diabetes, aterosclerose, crescimento celular ou virulência. O presente manuscrito relata um ensaio enzimático simples livre de células que mede a transferência de grupo(s) metil(s) tritiado(s) de S-[Metil-3H]adenosil-L-metionina para fosfatidiletanolamina usando extratos de células inteiras como fonte enzimática. As formas metiladas resultantes da fosfatidiletanolamina são hidrofóbicas e, portanto, podem ser separadas da S-[Metil-3H]adenosil-L-metionina solúvel em água por extração orgânica. Este ensaio pode ser potencialmente aplicado a qualquer outro tipo de célula e usado para testar inibidores / drogas específicas para uma fosfatidiletanolamina metiltransferase de interesse sem a necessidade de purificar a enzima.

Introdução

Fosfatidiletanolamina metiltransferase (PEMT) As enzimas catalisam a ligação covalente de um ou mais grupos de metilo utilizando S -adenosylmethionine (SAM) como o doador grupo metilo em PE, PE-monometil ou dimetil-PE para dar monometil-PE, dimetil-PE e / ou fosfatidilcolina (PC). Estas enzimas são quase ubíquo em células animais e de fungos. Eles também podem ser encontrados em algumas plantas 1 e cerca de 10% das bactérias, particularmente aqueles que interagem com 2 eucariotas.

PEMTs são relevantes para a biologia da célula não só por contribuir para a produção de PC, que é a principal classe de lípidos em células animais, mas também por cumprir outras funções celulares importantes. Nos mamíferos, são principalmente PEMTs expressa no fígado, onde eles são necessários para a secreção normal de colesterol de lipoproteína de muito baixa densidade e que também contribuem para a obesidade induzida por dieta 3, 4 aterosclerose, e resistir à insulinaance 5. Além disso, PEMT de mamífero também são expressos em adipócitos, embora a níveis mais baixos, e participar em deposição de gordura 6, 7. PEMT papel no desenvolvimento do cancro 8, 9 a apoptose, e o crescimento celular 10 também foram demonstradas. Em bactérias, as enzimas PEMT têm sido mostrados como sendo importantes para o crescimento normal de células 2, 2 virulência, e a simbiose com a planta hospedeira 11.

O objetivo e razão de ser do presente protocolo é o de medir a atividade PEMT a partir de extratos de células inteiras sem a necessidade de purificar a enzima. Dois protocolos distintos foram desenvolvidos para medir a actividade PEMT. A primeira e mais comum mede-se a transferência do grupo metil tritiada de radioativo SAM em PE, que é o tema deste artigo. Este protocolo foi originalmente desenvolvido para medir a actividade de levedura PEMT 12 e células de mamíferos (fígado) 13 para obter uma understAND de biossíntese PC nestas células, bem como para determinar a especificidade destas enzimas. Mais tarde, esta técnica tem sido aplicada a outros tipos de células tais como bactérias 2 (utilizando um valor de pH de base para o ensaio embora 15) e parasitas protozoários 14. Esta técnica pode ser utilizada com extractos de células completas, bem como de enzima purificada, e, potencialmente, pode ser aplicado a qualquer sistema de extracto celular. Um ensaio não radioactivo também foi projetado que se baseia na quantificação enzimática de S -adenosylhomocysteine, o produto transmetilação de SAM 16. O último ensaio pode ser mais conveniente, uma vez que não envolvem radioactividade, mas é somente apropriado para enzimas purificadas.

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Protocolo

1. Preparação Extracto celular

  1. Crescer as células de Leishmania em um frasco de plástico estéril, selado com tampa estanque ao ar 26 ° C num meio feito de 1x M199 suplementado com HEPES 20 mM, pH 7,4, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 5 ug / ml de heme , 0,35 g / L NACo 2H, adenina 0,1 mM, e 2 ug / ml de biopterina sem agitação. Colher as células por centrifugação a 1500 g durante 5 min a 4 ° C quando atingem uma densidade celular de 1-2 x 10 7 / ml.
  2. Descartar o sobrenadante com uma pipeta e lava-se as células por ressuspensão do sedimento de células com uma pipeta serológica em metade do volume da cultura de solução salina de fosfato tamponada (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4). Descarte sobrenadantes de células de acordo com as diretrizes de segurança BL2.
  3. Centrifugar células novamente em 1500 g durante 5 min a 4 ºC. Descartar o sobrenadante com uma pipeta. Prossiga tO passo seguinte ou encaixe congelar o sedimento celular em azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo a -80 ° C (até três meses).
  4. Preparar tampão de lise 2x (0,5 M de sacarose, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, EDTA 2 mM, e 2x cocktail inibidor de protease) e mantê-lo a 4 ° C em gelo.
  5. Ressuspender o sedimento de células (frescas ou congeladas) em igual volume de tampão de lise 2x. Adicionar o volume 1x de contas de vidro. Vortex vigorosamente a 4 ºC durante 10 minutos.
  6. Adicionar 2 volumes de tampão de lise 1x e misturar. Extratos de células centrifugar a 1500 xg a 4 ºC durante 10 minutos para sedimentar as células intactas e núcleos.
  7. Transferir o sobrenadante com uma pipeta para um tubo de centrífuga de fresco e manter fresco extractos de células em gelo até à conclusão da experiência.

2. Determinar a concentração de proteína do extracto celular utilizando o kit de Estimativa proteína tal como ácido bicinconínico Ensaio

  1. Prepara-se o ácido bicinconínico solução (BCA) (1 ml / tubo) por mistura do BCA e cobre (II) sulfate numa proporção de 49: 1 (v / v).
  2. Prepare os padrões de proteína de 0, 10, 20, 30, 40, 50, e 60 ug / ml por diluição de um ml de solução concentrada a 10 mg / albumina de soro bovino (BSA) em aliquotas de 1 mL da solução de BCA.
  3. Adicionar 2 mL de extractos de células em 1 ml de solução de BCA em duplicado. Incubar as amostras e os padrões de proteína durante 10 minutos num banho de água a 60 ° C pré-aquecido.
  4. Amostras de transferência de gelo por 3 min. Medir a absorvância dos padrões e das amostras de proteína com um espectrofotómetro a um comprimento de onda de 562 nm.
  5. Calcula-se a concentração de proteína dos extractos celulares, usando o padrão de BSA, como uma referência, tal como descrito no protocolo do fabricante. Dilui-se extractos de células para uma concentração de proteína de 10 mg / ml com tampão de lise 1x.

3. Ensaio enzimático em 200 ul por tubo

NOTA: Siga os seguintes passos em uma capa química.

  1. Teste cada amostra em duplicado, a 15 mltubo cónico. Prepare 20 mL 1 M TrisHCl pH 7,5 por tubo e mantê-lo em gelo. Preparar 2 ml de clorofórmio / metanol (1: 1 (v / v); Solução de paragem) à temperatura ambiente para cada um dos tubos.
  2. Pipetar 20 ul de Tris-HCl 1 M pH 7,5 em cada tubo de 15 ml em gelo.
  3. Siga as orientações de segurança de radiação a partir daqui. Adicionar o equivalente a 0,06 uM (0,2 uCi) S - [metil-3H] adenosil-L-metionina e 50 uM frio SAM por tubo para um total de 50,06 uM de SAM. Adicionar x ul de água fria, onde x = 200- (20 (para buffer) + 20 (para extratos de células) + volume de frio e radioativo SAM) por tubo.
  4. Transferir cada tubo cónico para um banho de água a 30 ° C pré-aquecido. Adicionar a cada tubo 20 ul de extractos de células (equivalente a 200 ug de proteína) para iniciar a reacção. Incubar durante o tempo desejado (0 a 45 min).
  5. Parar a reacção por adição de 2 ml de clorofórmio / metanol (1: 1; v / v; Solução de paragem) para cada tubo. Transferir o tubo cónico para a TA (20-256; C).

4. Lipid Extração

NOTA: Siga os seguintes passos em uma capa química.

  1. Adicionar 700 uL de água a cada tubo contendo a amostra de reacção enzimática. Vortex vigorosamente por 30 segundos. Centrifugar a 1.500 xg durante 5 min à temperatura ambiente para separar a fase orgânica da fase aquosa.
  2. Transferir a fase orgânica inferior para um novo tubo cónico de 15 ml com uma pipeta. Adicionar 1 ml de água para cada "fase inferior" contendo tubo e agitar vigorosamente em vórtice durante 30 seg. Centrifugar novamente a 1500 xg durante 5 minutos para separar a fase orgânica da fase aquosa.
  3. Transferir a fase orgânica inferior para um tubo de cintilação com uma pipeta. As amostras secas sob uma corrente de N2. Elimine as fases de água contendo o SAM radioativo não-incorporados e os tubos cônicos radioativos conforme as diretrizes de radiação.
  4. Adicione 2 ml / tubo de líquido de cintilação. Medir a radioactividade incorporada com um par de cintilaçãonter acordo com o protocolo dos fabricantes e utilização do instrumento.
  5. Calcula-se a actividade enzimática em nmol / mg de proteína usando a seguinte equação geral:
    valor cpm x 10 x 3 [total (radioativo e frio) concentração de SAM (mM)] x 5 atividade específica de SAM radioativo (Ci / mmol) x [concentração de substâncias radioativas SAM (mM)]
    NOTA: o protocolo acima pode ser alterada para uma concentração SAM dependente ou um ensaio PEMT dependente proteína. Para a concentração de SAM ensaio enzimático dependente, o tempo é mantido constante (15 minutos, o que está na gama linear) e várias quantidades de frio SAM são adicionados ao ensaio enquanto que para o ensaio PEMT dependente de proteína, concentração de SAM (escolheu 0,05 mM) e a hora são mantida constante (15 minutos). Além disso, o pH do tampão pode ser alterado conforme necessário, se algumas enzimas PEMT tem um valor de pH óptimo diferente.

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Resultados

A Figura 1 mostra um ensaio PEMT dependente do tempo, o qual foi realizado com Leishmania extracto de célula completa como uma fonte de enzima utilizando PE endógeno como um substrato. A quantidade de radioactividade na fase orgânica foi quantificada por contagem de cintilação. Os números resultantes foram utilizados para calcular a quantidade de grupos metil tritiados transferidos para PE. A actividade PEMT foi linear durante, aproximadamente, 20 min. Em seguid...

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Discussão

Este ensaio PEMT simples, rápida permite a quantificação das formas metiladas de PE que resulta da transferência de grupos metilo radioactivas de SAM na PE utilizando o extracto de célula completa como uma fonte de proteína. É rápido, sensível, reprodutível e também adequado para enzimas purificadas 17. Monometil ou dimetil-PE pode ser adicionado ao ensaio se a metiltransferase de interesse é específico para estes substratos em vez de PE 12,13,18,19. Se PEMT enzima purificado é usado, PE pode ser a...

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Divulgações

Declaro não haver conflitos de interesse declarados

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelas concessões do NIH ARRA RO3 AI078145 e 1SC3GM113743 para RZ.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
S-[Metil-3H]adenosil-L-metionina (atividade específica de 5-15 Ci/mMole)Perkin ElmerNET155050UCAlíquota o reagente e congelar a -20 ° C; siga as diretrizes de segurança de radiação ao usar este
coquetel de inibidor de proteaseRoche Life Sciences11836170001dilua-o fresco 
Contas de vidro, lavadas com ácido, 425-600 mmSigma AldrichG8772
Solução de ácido bicinchonínicoSigma AldrichB9643
Sulfato de cobre (II)Sigma AldrichC2284
Contador de cintilação MicroBeta2 com 1 detectorPerkin Elmer Espectrofotômetro 2450-0010
Biomate 3Thermo Scientific840208300
Solução estoque BSA (10 mg/ml)New England BiolabsB9001S
Líquido de cintilação Research Product International Corp111198
cloreto de S-(5'-adenosil)-L-metionina (cloridrato) Cayman Chemicals13956dilui o reagente em HCl 20 mM e congela alíquotas a -80 ° C 
reagente

Referências

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