Artigo de método

Um ELISA baseada Encadernação e Método de competição de determinar rapidamente interacções ligando-receptor

DOI:

10.3791/53575

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14 de março de 2016

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1Applied Microbiology Research, Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, and Swiss Institute of Bioinformatics, 3Swiss Institute of Bioinformatics, 4Li Ka Shing Institute for Virology, University of Alberta, 5Regional Infectious Diseases Unit, University of Edinburgh, 6Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Alberta, 7Infection Biology, Department of Biomedicine, University of Basel, 8Clinical Microbiology, University Hospital Basel

Neste artigo

Resumo

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Os protocolos apresentados descrevem duas técnicas baseadas em ensaio imunossorbente ligado a enzima (ELISA) para a investigação rápida de interações ligante-receptor: O primeiro ensaio permite a determinação da constante de dissociação entre ligante e receptor. O segundo ensaio permite uma triagem rápida de peptídeos bloqueadores para interações ligante-receptor.

Resumo

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Uma compreensão abrangente dos caminhos de sinalização requer conhecimento detalhado sobre a interação ligando-receptor. Este artigo descreve dois protocolos rápidos e confiáveis, ponto a ponto, de ensaios imunossorventes ligados a enzimas (ELISAs) para a investigação de interações ligando-receptor: o ensaio de interação direta ligando-receptor (LRA) e o LRA de competição. Como estudo de caso, é apresentada a análise baseada em ELISA da interação entre diferentes interferons lambda (IFNLs) e a subunidade alfa de seu receptor (IL28RA): o LRA direto é usado para a determinação de constantes de dissociação (valores de KD) entre o receptor e os ligandos IFN, e o LRA de competição para a determinação da capacidade inibitória de um oligopeptídeo, que foi projetado para competir com os IFNLs em seu local de ligação ao receptor. Passos analíticos para estimar os valores de KD e concentração inibitória média (IC50) são descritos. Por fim, a discussão destaca vantagens e desvantagens do método apresentado e como os resultados permitem uma melhor compreensão molecular das interações ligando-receptor.

Introdução

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Uma compreensão abrangente de vias de sinalização requer conhecimento detalhado sobre a interação ligando-receptor. A maioria dos métodos para avaliar a interacção de um ligando particular com o seu receptor específico são caros, consomem tempo, trabalho intensivo e exige equipamentos e conhecimentos específicos 1.

Este artigo descreve dois protocolos rápidos e fiáveis ​​ponto-a-ponto para investigar a interacção ligando-receptor baseado em um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA): o ensaio de interacção ligando-receptor directa (ERS) e o LRA competição. ELISA é uma técnica altamente sensível, específico e facilmente dispo....

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Protocolo

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1. Preparação de Reagentes

  1. Para preparar tampão de revestimento de carbonato, dissolve-se 0,36 g de Na 2 CO 3 e 0,84 g de NaHCO3 em 100 ml de água destilada; filtro estéril o buffer usando um vácuo impulsionado 0,22 polietersulfona (PES) filtro de membrana e armazenar a temperatura ambiente, até o uso.
  2. Preparar a solução de lavagem através da adição de 0,05% v / v de Tween 20 em tampão fosfato salino (PBS).
  3. Prepara-se uma 5% Albumina de Soro Bovino (BSA) (solução de bloqueio) em solução de PBS por dissolução de 5 g de BSA (≥98%) em 100 ml de PBS e armazenar a 4 ° C.
  4. Recombinante do receptor, os....

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Resultados

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As constantes de dissociação entre INFL1-3 e sua subunidade alfa do receptor de IL28RA foram determinados utilizando o LRA directa. Os resultados são apresentados na Figura 3: A fracção de sítios de ligação ocupados é representada graficamente contra o logaritmo da concentração de IFN respectivo. O gráfico de Scatchard dos dados é mostrado no canto inferior direito. Os resultados mostram que o LRA directa produz uma curva de ligação, o qual pode ser ainda analisada para .......

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Discussão

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ELISA é um método padrão e bem estabelecido para muitos laboratórios. Temos ainda mais modificado e melhorado a 5,7 método previamente publicado. O protocolo passo-a-passo demonstrou mostra como ela pode ser usada de uma maneira simples para determinar os valores de KD de interacções ligando-receptor. Além disso, pode ser determinado o IC50 de um péptido de bloqueio que interfere com a interacção ligando-receptor.

As principais vantagens são a rápida instalação, uma fác.......

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Divulgações

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A.E. foi apoiado por subsídios de pesquisa do programa "SNSF Ambizione Score" (PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" da Universidade de Basileia, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel e Bangeter Rhyner Stiftung. J.L. reconhece o apoio de uma bolsa iPhD da iniciativa SystemsX.ch no programa de biologia de sistemas (9ª chamada).

Agradecimentos

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Agradecemos ao Prof. J. Stelling (Departamento de Ciência e Engenharia de Biossistemas, ETH Zurich e Instituto Suíço de Bioinformática, Basel, Suíça) por sua revisão crítica do manuscrito.

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Materiais

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Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)Thermo Scientific442404ELISA plate
Sodium carbonate (Na2CO3)Merck497-19-8Para o tampão de revestimento da placa ELISA
Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3)Merck144-55-8Para o tampão de revestimento da placa ELISA
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA7030-100G5% BSA em PBS para Bloqueio
rhIL-28Rα/IFNλR1R&D systems5260-MRReceptor alfa recombinante humano interleucina-28
rhIL-29/IFNλ1R&D systems1598-IL/CFRecombinant human interleucina-29/Sem portador/C-terminal 10-His tag
rhIL-28A/IFNλ2R&D systems1587-IL/CFRecombinant human interleucina-28A/Sem portador/C-terminal 6-His tag
rhIL-28B/IFNλ3R&D systems5259-IL/CFRecombinant human interleucina-28B/Sem portador/C-terminal 6-His tag
6x His Monoclonal antibody (Mouse)Clontech631212Anticorpo primário para capturar Ligantes com tag His
Goat anti-Mouse igG (H+L)Jackson Immuno Research115-035-166Anticorpo secundário conjugado a Peroxidase de Rábano
BDoptEIA TMB reagent setBD Biosciences555214ELISA - Solução do substrato TMB
Sulfuric acid (H2SO4)Fulka847205 N H2SO4 (Solução de parada de reação enzimática)
Synergy/H1 - Microplate readerBioTeKLeitor de placa ELISA
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Referências

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  1. Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
  2. Rossi, G., et al.

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Etiquetas

Intera o Ligante ReceptorAfinidade de Liga oEnsaio de Competi oReceptor de CitocinaConstante de Dissocia oValor de IC50Interferon LambdaSubunidade Alfa do ReceptorPept deo de Bloqueio

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