Introduction
Le condizioni della pelle che vanno da dermatite da contatto, eczema, psoriasi, cellulite, infezioni fungine e ascessi a tumori cutanei non-melanoma sono risultati essere tra le 50 malattie più diffuse a livello mondiale, e la quarta causa globale di malattie non mortali nel 2010 1. Di conseguenza, l'indagine dei meccanismi molecolari e cellulari alla base diverse patologie della pelle è una zona necessaria e attiva di ricerca. Modelli di roditori sono stati notevolmente utili per la comprensione delle condizioni infiammatorie della pelle come la dermatite atopica 2, 3 psoriasi, o infezione da Staphylococcus aureus 4. Protocolli economici, efficienti e semplici per la digestione enzimatica del tessuto cutaneo mouse può fornire preparazioni di cellule che possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni a valle per comprendere meglio la fisiopatologia di malattie della pelle. Qui, un metodo semplice ed economico è descritto per digerito enzimatico di pelle topotessuto e l'isolamento di leucociti infiltranti pelle che può essere utilizzato per la coltura cellulare, in vivo trasferimento adottivo, analisi citofluorimetrica e smistamento o studi di espressione genica. L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare una sospensione singola cella di leucociti-pelle infiltrante con la vitalità delle cellule di alta minimizzando i costi tipicamente associati con kit di reagenti personalizzate e dissociatori meccanici.
Esistenti tessuto cutaneo metodi di dissociazione 5-7 può provocare vitalità delle cellule e la superficie di integrità basso marcatore, o richiedere i kit di enzimi personalizzate e costose macchine di dissociazione dei tessuti 8-11. Mentre la digestione del tessuto cutaneo orecchio del mouse è ragionevolmente diffusa 12-13, digerire il tessuto della pelle altamente cheratinizzato (ad esempio, dal fianco) può risultare in preparazioni di cellule contaminate con grandi quantità di detriti non cellulare. In un recente studio, Zaid e colleghi hanno digerito la pelle del fianco del mouse per 90 minuti a 2,5 mg / ml dispasi, follocon a capo 45 min a 3 mg / ml di collagenasi 7. In un altro studio, questi ricercatori hanno utilizzato più incubazioni con una digestione combinato di 2,5 ore, compreso l'uso di tripsina / EDTA, collagenasi III, e dispasi 5. L'uso di tripsina non è raccomandato per la digestione enzimatica della pelle, come il trattamento con tripsina da diversi costruttori ha mostrato di influenzare misurabile l'integrità delle proteine di superficie cellulare su cellule di mammifero 14-15. Inoltre, dispasi può avere effetti significativi sulla capacità proliferativa delle cellule CD4 e CD8α T e influenzare l'abbondanza superficie di almeno 20 molecole, tra cui comune T marcatori di attivazione delle cellule, quali CD62L 16. Altri protocolli utilizzano RPMI 1640 nel mezzo di digestione 6. Tuttavia, la presenza di Mg 2+ e Ca 2+ in RPMI può causare aggregazione vasta cella 17.
Un protocollo ideale per la dissociazione di tessuto dovrebbe puntare per la vitalità delle cellule in alto, bassolivelli di aggregazione delle cellule, e il minimo danno al cellulare proteine di superficie. Alta qualità preparazioni cellulari linfonodo stromali sono stati compiuti con protocolli che utilizzano enzimi incubazione più brevi, Ca 2+ e Mg 2+ media liberi, e di evitare tripsina e dispasi 18. Tuttavia, non sono state stabilite protocolli di questo tipo per la dissociazione di tutta la pelle del mouse.
Qui, un protocollo è descritto a dissociarsi, isolare, e arricchire leucociti-pelle infiltrazione dalla pelle del mouse fianco allergene-sfidati. In breve, la pelle asportata è pre-incubato in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con siero fetale bovino 10% per 1 ora per ammorbidire i tessuti per la digestione e rimuovere il tessuto adiposo della pelle o morti in eccesso. Questa è seguita da una fase 30 min di digestione enzimatica con 0,7 mg / ml di collagenasi D. collagenasi D ha effetti minimi sulla densità di marcatori di superficie cellulare, e nessun effetto sulla proliferazione delle cellule T in vitro 16,18, rendendoparticolarmente adatto per applicazioni che coinvolgono la caratterizzazione delle proteine di superficie. A seguito di digestione enzimatica, discontinua gradiente di densità centrifugazione è stato utilizzato per rimuovere le cellule epiteliali e detriti dalla cella singola sospensione e arricchire per le cellule ematopoietiche. È importante sottolineare che questo procedimento evita costosi cellulari magnetico reagenti separazione basati su colonne e macchine dissociazione tissutale 8-11, e può essere eseguita con attrezzature e materiali trovati in un laboratorio di base ricerca biomedica. Ecco questo protocollo è stato utilizzato per isolare leucociti dalla pelle fianco sfidato tre volte con il oxazolone aptene (bue) in precedenza sensibilizzati topi ND4 svizzeri (adattato da 19). Le cellule sono state analizzate utilizzando citometria a flusso multiparametrica. Questa tecnica ha prodotto una sospensione cellulare con detriti minima e> 95% vitalità dei linfociti isolati che sono state analizzate mediante flusso multi-parametrica citometria a misurare l'infiltrazione di linfociti T e neutrofili nella sk interessatoin.
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Protocol
Nota: i topi 8-12 settimane vecchia femmina ND4 svizzero Webster, convenzionalmente sono alloggiati con libero accesso a cibo e acqua, sono stati utilizzati per questi studi Il protocollo sperimentale utilizzato (B13S1) è stato approvato dal IACUC del Macalester College..
1. Sensibilizzazione e sfida con Oxazolone
- Giorno 0
- Preparare camera di anestesia con l'aggiunta di 3 ml di isoflurano per asciugamani assorbenti posizionati sotto rete in fondo a un 4 L con coperchio vaso di vetro. Per i topi ND4 femminile usato qui, il tempo nella camera è 30-60 secondi fino a quando il soggetto è adeguatamente anestetizzato; ottimizzare la somministrazione di anestetici per utilizzarlo ceppo di topi.
- Radere la schiena di ogni topo anestetizzato e affiancare con un trimmer peli di animali.
- Giorno 1
- Effettuare una soluzione al 2% di 4-ethoxymethylene-2-fenil-2-ossazolin-5-one (Ox) in etanolo assoluto, e incubare a 50 ° C per 15 minuti su un piatto rotante in un incubatore.
- Brevemente anestetizzaretopo, utilizzando anestesia isoflurano come descritto al punto 1.1.1 e applicare 100 ml di 2% bue alla schiena rasata in diverse applicazioni di serie di circa 20 ml ciascuno. Attendere 5-10 secondi tra le applicazioni di serie per la soluzione ad asciugare.
- Fare attenzione per evitare di versare la soluzione Bue 2% sulle regioni diverse dalla schiena, e aspettare che la soluzione ad asciugare tra le applicazioni.
- Giorni 5-7
- Fare una soluzione 1% di (Ox) in etanolo assoluto, e incubare a 50 ° C per 15 minuti su un piatto rotante in un incubatore.
- Delicatamente ma con fermezza immobilizzare il mouse alla collottola della base del collo e la coda con l'addome rivolto verso l'alto e il collo leggermente inclinata verso il basso (simile a una presa per un'iniezione intraperitoneale) e applicare 100 ml di 1% Bue al fianco rasato in diverse applicazioni di serie e il tempo per asciugare la pelle poi come descritto sopra.
- Per i topi di controllo, applicare 100 ml di veicoli etanolo assoluto per il flan rasatoK.
2. Fianco pelle Harvest
- Euthanize topi utilizzando anidride carbonica e l'inalazione accise accuratamente la zona desiderata della pelle del fianco (~ 25 mm x 25 mm della cute) con 10 cm forbici chirurgiche.
- Utilizzando una lama chirurgica tagliente pulito, raschiare via il grasso in eccesso e il tessuto connettivo della pelle del fianco.
- Posizionare 3 pezzi di pelle fianco da 3 topi in una provetta conica da 50 ml contenente 10 ml di HBSS RT [con rosso fenolo, senza calcio o magnesio, 5 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 10 mM 4- (2-idrossietil) -1- L'acido piperazineethanesulfonic (HEPES), e siero fetale bovino al 10% (FBS)].
3. Pre-digestione del tessuto di lavaggio
- Luogo tubo contenente frammenti di pelle su un piatto rotante per 30 minuti in un incubatore non gasati secco mantenuto a 37 ° C.
- Vortex vigorosamente per 10 secondi al termine del periodo di incubazione.
- Filtrare il contenuto del tubo attraverso un 70 microncolino per eliminare il tampone di lavaggio e raccogliere il tessuto. Un unico filtro può essere riutilizzato durante tutta la procedura in un gruppo di trattamento biologico.
- Utilizzando un paio di pinze, di trasferire la pelle del fianco dal filtro in un nuovo tubo conico da 50 ml contenente 10 ml di fresco, RT HBSS media (contenenti EDTA, HEPES, e FBS come descritto sopra).
- Con un paio di forbici chirurgiche sezionare immersi nel tubo 12,5 centimetri, tritare ogni pezzo di pelle del fianco in modo che il pezzo di tessuto media è di circa 2,2 mm x 2,2 millimetri nella zona.
- Luogo tubo contenente frammenti di pelle su un piatto rotante per 30 minuti in un incubatore non gasati secco mantenuto a 37 ° C.
- Vortex vigorosamente per 10 secondi alla fine dell'incubazione
4. Collagenase Digestione di pelle
- Filtrare il contenuto del tubo attraverso un filtro 70 micron, raccogliere e trasferire i pezzi della pelle del fianco in una nuova provetta conica da 50 ml contenente 10 ml fresh, RT HBSS multimediale integrato con 0,7 mg / ml collagenasi D.
- Tubo Luogo terreno contenente la digestione e frammenti di pelle su un piatto rotante per 30 minuti in un incubatore non gasati secco mantenuto a 37 ° C.
- Contenuti vortice di tubo vigorosamente per 10 secondi al termine dell'incubazione.
- Filtro contenuto della provetta attraverso un filtro 70 micron in una nuova provetta da 50 ml; mantenere il flusso continuo contenente il tessuto digerito e gettare il filtro e affiancare i residui della pelle.
- Lavare il flusso continuo in 50 ml di HBSS supporti, centrifugare per 5 minuti a 350 g, e decantare il surnatante.
5. Densità centrifugazione gradiente
- Usando una pipetta sierologica, aggiungere 3 ml di RT 67% gradiente di densità centrifugazione media in 1X tampone fosfato salino (PBS) in un nuovo tubo da 15 ml per ogni campione.
- Risospendere il pellet di cellule in 5 ml RT 44% di densità supporti centrifugazione in gradiente in HBSS con rosso fenolo.
- Gentiluomoly strato 5 ml di media centrifugazione in gradiente di densità 44% contenente le cellule sulla parte superiore del gradiente di densità centrifugazione campione supporti 67% utilizzando una pipetta sierologica. Assicurarsi di impostare la pipetta alla velocità più bassa, e posizionare la pipetta lungo la parete del tubo conico. Fare attenzione a non tremare, interrompere o invertire il gradiente.
- Impostare l'accelerazione sul valore più basso, disinserire il freno, e centrifugare il gradiente a 931 xg per 20 minuti a temperatura ambiente facendo in modo che la centrifuga è equilibrata.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il gradiente dalla centrifuga, e trasportare delicatamente per il banco di laboratorio tiene il tubo in posizione verticale. Utilizzando un 5 ml plastica trasferimento pipetta, rimuovere lo strato di cellule all'interfaccia dei mezzi di centrifugazione in gradiente di densità 44% e il 67% e il trasferimento in una nuova provetta conica da 15 ml. Se l'interfaccia non è visibile, è sufficiente rimuovere circa 2 ml di liquido al 67% -44% di confine.
- Riempire il tubo conico contenente cellule dal interfaccia con il 2% FBS in 1X PBS freddo, le cellule centrifugare per 5 minuti a 350 xg, e decantare il surnatante.
Nota: Questa è la prima volta che le cellule possono essere raffreddati / mantenuto freddo, in quanto mineralizzazione sono a 37 ° C e gradini multimediali gradiente di densità di centrifugazione sono a RT. Le celle possono essere risospese in 1: 1 Trypan blue diluizione e conteggi e informazioni redditività possono essere ottenute a questo punto.
6. Blocco e colorazione per analisi citofluorimetrica
- Blocco FcγRII / recettori III sulle cellule per prevenire non specifica colorazione anticorpi. Per gli esperimenti descritti, fare Master Mix anticorpo in PBS con il 2% FBS contenente diluizione 1: 100 di anticorpi non coniugato contro CD16 / 32 (2.4G2) per legare e recettori blocco FcγRII / III.
- Incubare le cellule bloccate con le opportune Master Mix di anticorpi contro CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), e Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), nonché Brilliant Violet 510 vivo macchia / morti per identificare le cellule morte. Utilizzare tutti gli anticorpi sia alla diluizione raccomandata dai produttori o precedentemente ottimizzata dai ricercatori. Per gli esperimenti qui descritti, utilizzare tutti gli anticorpi a diluizione 1: 100.
- Lavare le cellule e risospendere in 50 microlitri PBS 1X tampone colorazione con 2% FBS. Tenere in ghiaccio fino a quando i dati di fluorescenza possono essere acquisiti su un citofluorimetro.
Nota: è importante avere i parametri di compensazione pre-ottimizzati con un tessuto linfoide e un antigene di superficie cellulare comune (come CD4 o CD8) prima acquisizione dei dati di fluorescenza. - Per aumentare il numero di cellule per il flusso downstream citometria acquisire dati da campioni interi di cellule colorate.
7. Analisi Citometria a flusso di dati utilizzando metodi standard per realizzare il procedura descritta di seguito
- In primo luogo, porta sulla regione dei linfociti del forward scatter(area) da scatter laterale (area) trama.
- Quindi, selezionare singole cellule utilizzando la dispersione in avanti (larghezza) per scatter laterale (larghezza), al fine di evitare l'analisi doppiette. Questo può anche essere realizzato con un altezza scatter in avanti per l'altezza side scatter plot.
- Poi, cancello sulla stirpe (CD11b, CD11c, e CD45R / B220) -negativa e CD3 positivi eventi, di escludere i macrofagi, le cellule cellule dendritiche, e B, rispettivamente, e confine analizza al compartimento delle cellule T, se l'obiettivo è, come qui, per valutare infiltrante cellule T.
- Avanti, porta in cellule vive che escludono il live macchia / morti.
- Infine, cancello sulla popolazione di cellule (vedi rappresentante la sezione risultati).
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Representative Results
Collagenasi D trattata splenociti presentano livelli simili di CD4 e CD8 α sulle cellule T rispetto ai controlli multimediali trattati
In primo luogo, gli effetti potenziali di collagenasi D sulla frequenza e la superficie abbondanza di lignaggio e di attivazione marcatori su sottogruppi di cellule T sono stati valutati utilizzando tessuto linfoide secondario come controllo. Una sospensione di splenociti ottenuti da topi è stato ND4 e lavato per 1 ora con HBSS media. Quindi, metà delle cellule sottoposte a 0,7 mg / ml Collagenasi D (come descritto al punto 4 sopra). Le cellule rimanenti sono stati risospesi in controllo del mezzo HBSS. Successivamente, entrambe le frazioni splenocyte sono stati elaborati utilizzando una centrifugazione in gradiente di densità, come descritto nella Sezione 5 di cui sopra. Le cellule sono state poi colorate con anticorpi contro la superficie CD4 e CD8α, e analizzati sul citometro di flusso. Singolo, vivere, CD45 +, non T lignaggio - (B220 - CD11b -CD11c -), + cellule CD3ɛ stati recintato per l'analisi, per escludere le cellule B, macrofagi, cellule dendritiche. Proteine CD4 e CD8α erano ugualmente rilevate sulla superficie di splenociti che era stato sottoposto a collagenasi D digestione e quelli che non erano stati esposti a enzimatica con circa il 60% CD4 + CD8α - cellule e il 30% CD4 - + cellule CD8α rilevato sia del trattamento ( Figura 1A). Pertanto, collagenasi D digest non ha influenzato la frequenza relativa di CD4 e CD8α. Le intensità di superficie CD4 e CD8α unità fluorescenza media geometrica (gMFI) su questi sottoinsiemi sono stati anche comparabili tra i due trattamenti; I valori gMFI per CD4 sono stati 2271 per, rispettivamente, enzimi trattati e 2243 per splenociti di controllo, e valori gMFI per CD8α erano 536 per enzimi trattati e 520 per splenociti di controllo. Trattamento enzimatico ha avuto alcun effetto sulla densità superficiale di attivazione delle cellule T marcatori CD44 o CD62L sulle cellule T CD4 + (Figura 1B). Geometriche valori di intensità di fluorescenza medi per CD44 sono stati 669 per enzimi trattati e 654 per splenociti di controllo; I valori gMFI per CD62L erano 1523 enzima trattati e il 1517 per splenociti di controllo. Come Collagenasi D digestione preserva l'integrità delle proteine di superficie su cellule isolate, il protocollo qui descritto può essere utilizzato con sicurezza per il flusso a valle analisi di citometria.
Digestione enzimatica e purificazione pendenza di pelle fianco cellule si traduce in alta vitalità cellulare
Resa cellulare e cento vitalità della sospensione cellulare ottenuta sopra sono stati valutati utilizzando Trypan Blue colorante esclusione 20. Questo protocollo separazione digestione e gradiente ha prodotto circa 250 vitali le cellule immunitarie per mm 2 di tessuto fianco nei topi Ox-sfidati e circa 4 vitali le cellule immunitarie per mm 2 di tessuto nei topi veicoli sfidatoche sono stati precedentemente sensibilizzati con Ox (Tabella 1).
Digestione enzimatica e purificazione pendenza di pelle fianco cellule risultati in robusta ripresa delle cellule immunitarie
Avanti, il grado di infiltrazione immunitario della pelle è stata determinata analizzando l'abbondanza di proteine di superficie CD45 sulle cellule isolate dal fianco di Bue-sfidato e topi di controllo per valutare il recupero delle cellule immunitarie-pelle infiltrarsi con i metodi qui descritti. CD45 è un marker lignaggio pan-ematopoietiche 21. 95% di basso e con il lato-dispersione, singole cellule (gating non mostrato) in topi Ox-sfidati e il 71% di queste cellule nei controlli dei veicoli-sfidato erano CD45 + cellule dal vivo (Figura 2). A ~ 67 volte maggiore infiltranti cellule CD45 + immunitarie è stato rilevato nella pelle del fianco seguente 3 sfide Ox quotidiane utilizzando la procedura qui descritta (Tabella 1).
Tre sfide fianco Bue provocare infiltrazioni pronunciato delle cellule T e neutrofili
La nostra tecnica ha prodotto una popolazione di cellule dalla pelle del fianco che potrebbe essere usato per rilevare una varietà di cellule mieloidi e linfoidi sottoinsiemi come Gr-1 + 22 neutrofili, cellule CD4 T e le cellule T CD8α. Abbiamo osservato ~ 6 volte, ~ 7 volte, e ~ aumenta 73 volte nei neutrofili, cellule T CD4 e le cellule T CD8α, rispettivamente, a seguito di 3 sfide quotidiane Ox (Tabella 1). Abbiamo calcolato questi aumenti moltiplicando il numero totale di cellule vitali ottenute (contati usando trypan blu) per la percentuale di un dato frammento di cellule immunitarie dal cancello cellule vitali durante analisi citofluorimetrica. Abbiamo poi diviso il numero totale di cellule immunitarie vitali, Gr-1 +, CD4 +, o + cellule CD8α nei topi Ox-trattati con i numeri corrispondenti per i topi di controllo del veicolo, dandocipiegare aumenti di sottopopolazioni linfocitarie. Gr-1 + neutrofili hanno rappresentato il 42% del singolo, vivo CD45 + B220 - CD11b - CD11c - cellule nei topi trattati con Bue e il 10% di questa popolazione nei topi trattati con EtOH (Figura 2B). Nei topi Ox-trattati, ~ 52% delle cellule T CD3 + gated erano CD8α + e ~ 34% erano CD4 +, mentre in comandi del veicolo, ~ 9% delle cellule T erano CD8α + e il 57% erano CD4 + (Figura 2C) . Pertanto, con la tecnica qui descritta, pelle fianco allergica e non allergica può essere lavorato per produrre sospensioni di cellule singole adatte per alta risoluzione citofluorimetrica caratterizzazione di infiltrarsi sottopopolazioni di cellule immunitarie.
| Celle sottoinsiemi dalla pelle del mouse fianco | Ox / Ox (3) | Ox / EtOH (3) | Piegare Espansione (Ox / Ethanol) |
| per mm 2 di tessuto | |||
| Numero totale delle cellule | 262.7 | 5.3 | 49.3 |
| Le cellule CD45 + immunitarie | 250,7 | 3.8 | 66,7 |
| CD4 + CD8 - cellule | 6.5 | 0.9 | 7.2 |
| CD8 + - CD4 | 10.6 | 0.1 | 72.9 |
| I neutrofili | 8.6 | 1.5 | 5.6 |
Tabella 1. rendimenti cellulari da pelle fianco allergiche nei topi femmina ND4. Le cellule vitali isolati dalla pelle fianco stati contati utilizzando Trypan Blue esclusione, e normalizzato alle cellule / mm 2 di tessuto sulla base della zona di pelle isolato e il numero di topi in pool per tiscausa preparazione. Abbiamo calcolato il rendimento delle cellule immunitarie totale in base alla rilevazione del CD45 ematopoietiche antigeni sulla superficie cellulare, e le rese sottoinsieme di linfociti sulla base di marcatori di superficie specifici lignaggio. Abbiamo poi diviso il numero di cellule nei topi Ox-trattati con i numeri per topi di controllo del veicolo, dandoci pieghiamo aumenti di sottopopolazioni linfocitarie. I dati indicati rappresentano dati raccolti 2-3 topi per ogni trattamento, e sono rappresentative di due esperimenti indipendenti.
Figura 1. Enzima digestione e pendenza purificazione di splenociti preservare sottopopolazioni linfocitarie e marcatori di attivazione delle cellule. Splenociti lavati per 1 ora con HBSS media, incubate sia con collagenasi D o HBSS supporti da solo e purificato con un gradiente di densità per rimuovere i detriti e globuli rossi. Le cellule T sono stati identificati come dal vivo, CD45 +, lignaggio (B220, CD11b, CD11c) <sup> -, e CD3ɛ +. Frequenza di CD4 e cellule CD8α T non è cambiato dopo la digestione enzimatica (A). Densità di superficie di CD44 e CD62L sulle cellule T CD4 + non è cambiata dopo la digestione enzimatica (B). I dati riportati rappresentano dati combinati 2-3 topi per il trattamento da un singolo esperimento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Enzima digestione e purificazione pendenza delle cellule della pelle rivelano infiltrazione immunitario distinti nel controllo contro la pelle del mouse fianco allergene-sfidati. Tre sfide fianco Ox producono un ~ 67 volte maggiore nelle cellule immunitarie-pelle infiltrato in precedenza sensibilizzate topi ND4 svizzeri ( A). Tre sfide Ox prov ancheoked un ~ 6 volte maggiore di Gr-1 + neutrofili (B), e ~ 73- e ~ 7 volte maggiore di cellule CD8α + e CD4 + T, rispettivamente (C). Live CD45 + cellule del sistema immunitario sono gated da singole cellule, bassi in avanti e laterali dispersione; neutrofili e linfociti T gated da B220 - CD11b - CD11c - singole cellule vive. Conti sono stati eseguiti utilizzando un 1: 1 Trypan blu diluizione dopo la separazione gradiente di densità. I dati mostrati rappresenta dati combinati 2-3 topi in ciascun gruppo di trattamento, e sono rappresentative di due esperimenti indipendenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Caratterizzare cambiamenti nei leucociti pelle-residenti in modelli di roditori di malattie della pelle come la dermatite atopica o psoriasi è importante per capire i collegamenti meccanicistici tra afflusso di cellule infiammatorie e la patologia della malattia. Qui si descrive una tecnica economica per isolare leucociti dal tessuto della pelle con attrezzature di base trova nella maggior parte dei laboratori di ricerca biomedica. Questa tecnica relativamente rapida evita l'uso di macchine dissociazione tissue costosi e tubi personalizzati e reagenti, contribuendo a conservare le risorse minimizzando hands-on tempo al banco di laboratorio. Enzimatica Gentle digerire e separazione gradiente discontinuo di rimuovere la maggioranza delle cellule epiteliali e detriti, e le cellule isolate possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni a valle compresa l'analisi citofluorimetrica, separazione delle cellule, trasferimento, coltura cellulare e in saggi di stimolazione in vitro. Della digestione enzimatica con collagenasi D non ha alcun effetto sulla integrità marcatore di superficie delle cellule T, e preservitalità cellulare ves. Questo protocollo può essere facilmente modificato per elaborare pelle da regioni diverse del fianco.
Le fasi più critiche di questa procedura sono: 1) rimuovere accuratamente qualsiasi adiposo e tessuto connettivo, mentre la raccolta la pelle, 2) la gestione e il tessuto di trasformazione rapida per massimizzare infiltrazione resa cellulare, riducendo al minimo la morte delle cellule, 3) la stratificazione delicatamente la pendenza, e 4) con attenzione estrarre l'interfaccia del gradiente. Prima di iniziare un esperimento su larga scala è importante praticare gradiente di densità centrifugazione mezzi stratificazione e rimozione interfaccia. Si può praticare cellule raccolta da un gradiente di densità discontinua schiacciando un intero milza murina attraverso un colino 70 micron in tampone 1X PBS colorazione ed eseguendo il gradiente di densità come descritto sopra nel passo 5. È molto più facile vedere ed estrarre l'interfaccia tra la 44% Mezzi di gradiente di densità di centrifugazione e ai media il 67% gradiente di densità centrifugazione utilizzando splenocytes, a causa del gran numero di cellule immunitarie presenti.
Quando si lavora con gradienti di densità, le bolle devono essere evitati durante il pipettaggio, e interruzioni di pendenza devono essere ridotti al minimo. Il tubo conico contenente il gradiente deve essere maneggiato con delicatezza e mantenute verticalmente in ogni momento. Soluzioni multimediali centrifugazione in gradiente di densità deve essere sempre a temperatura ambiente, pipette sierologici impostati alla velocità più bassa possibile rilascio, la centrifuga mantenuta a RT, impostare a bassa accelerazione con il freno disinserito, e con attenzione equilibrato prima filatura. Quando si lavora con le preparazioni della pelle che producono un piccolo numero di leucociti infiltranti, le cellule non sono sempre visibili a livello di interfaccia gradiente. Pertanto, è importante rendere la densità mezzi centrifugazione in gradiente 44% con HBSS contenente rosso fenolo in modo che l'interfaccia può essere facilmente visualizzato anche quando uno strato di cellule non sarebbe rilevabile. Inoltre, è importante essere gentile ma rapido durante l'estrazione, lavaggioe l'elaborazione di tessuto cutaneo per evitare la morte delle cellule prima che la pelle è posto nei media HBSS.
Se la vitalità delle cellule o la purezza è basso, più corto (~ 20 min) tempi di digestione, leggermente inferiori concentrazioni di collagenasi D (~ 0,5 mg / ml), o di macinazione il tessuto più finemente potrebbero essere utili. Poiché over-digestione e la degradazione del tessuto può contribuire alla morte cellulare, investigatori necessario ottimizzare il tempo minimo di digestione che fornisce una grande dimensione campione di cellule sufficiente 17. Il processo richiederà probabilmente diversi cicli di ottimizzazione nelle mani di singoli ricercatori per standardizzare la tecnica. Collagenase livello di attività D può anche variare tra i lotti di produzione e rettifiche di tempo di digestione dovrà essere fatta per ogni lotto di enzima utilizzato. Durante l'ottimizzazione, è importante sospensioni cellulari di riferimento macchia (es milza) purificato con e senza enzimatica digerire passo con un affidabile vivo macchia / morti e cellule immunitarie linmarcatori EAGE (ad esempio CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, ecc) per fare in modo che le popolazioni di cellule e marcatori di superficie di interesse sono conservate attraverso il processo di digestione dei tessuti. Se possibile, è utile per eseguire ottimizzazioni un citometro di flusso in grado di misurare in avanti e la larghezza o altezza side scatter così come zona, escludere aggregati cellulari. Infine, le sospensioni cellulari devono essere esaminati al microscopio ottico per la valutazione visiva della vitalità e morfologia cellulare generale. Le cellule possono essere contate manualmente con Trypan Blue 0,4% di colorante esclusione sotto un microscopio ottico o su un citometro a flusso utilizzando il conteggio sfere. Per gli studi che richiedono quantificazione più rigorosi di tipi cellulari specifici nel tessuto asportato, i ricercatori possono pesare o misurare il volume di frammenti di tessuto prima e dopo la digestione, e utilizzare la misura della digestione per stimare più accuratamente numero di sottoinsiemi di cellule presenti nell'essere tessuti analizzato.
Una limitazione di questoprotocollo è che essa è specificamente adattato alla purificazione di cellule immunitarie. Se uno è interessato in isolamento, purificazione e analisi di un'altra popolazione cellulare (ad es pelle cellule epiteliali), il gradiente di densità di set-up e la enzimatico digerire protocollo saranno entrambi probabilmente bisogno di essere modificato e ottimizzato per meglio isolare le cellule di interesse. Tuttavia, questo protocollo permette di isolamento e purificazione di entrambi i sottoinsiemi di cellule linfoidi e mieloidi e può quindi essere adattata alle applicazioni più immunologici. Un'altra limitazione è che questo protocollo non può essere utilizzata per differenziare tra popolazioni cellulari infiltranti il derma contro l'epidermide della pelle. Per ottenere questo livello di differenziazione, questo protocollo dovrebbe essere ulteriormente adattato con ulteriori misure per separare enzimatica del derma e dell'epidermide prima o al posto dei passaggi descritti qui. Qui, i campioni sono raggruppati da ~ 3 topi per facilitare multi-parametro analisi citofluorimetrica rendendo difficilerilevare la variabilità tra le repliche biologiche. Tuttavia, a seconda dell'applicazione valle di scelta, questo protocollo può essere facilmente modificato per produrre campioni e uso da singoli soggetti. Infine, il protocollo presentato qui per i giovani, i topi femmina ND4 potrebbero dover essere modificati per i topi di diversa età, sesso o ceppi in base alle esigenze dei ricercatori.
In sintesi, questa combinazione di dolce enzimatica digerire e separazione gradiente discontinuo fornisce un metodo semplice, efficace ed economico di purificare cellule immunitarie di lesioni cutanee infiammatorie nei topi. Può essere utilizzato e adattato in generale attraverso una vasta gamma di modelli di roditori di patologie della pelle come un comodo strumento per valutare l'infiltrazione immunitario e isolare una pura, popolazione vitale di leucociti per applicazioni a valle.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari o di altro da dichiarare.
Acknowledgments
Il National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 a DC), la National Association Vulvodinia (premio a DC), e Macalester College di sostenuto questo lavoro. CB ha ricevuto una borsa di studio dalla Macalester College di Beckman Scholars Program, finanziato dal Arnold e Mabel Beckman Foundation. BTF e TM sono supportati da JDRF 2-2011-662. Ringraziamo il Dr. Jason Schenkel e il Dr. Giuliana Lewis per un parere tecnico, e tutti i membri attuali e precedenti del laboratorio Chatterjea per il loro aiuto e sostegno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8α-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
- Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T.
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R.
- Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
- Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
- Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
- Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
- Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
- Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
- Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
- Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
- Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
- Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).
