Summary
Il protocollo che segue descrive un nuovo metodo per la somministrazione cronica farmaco orale utilizzando una striscia oralmente dissoluzione (ODS) al posto del metodo gavage più utilizzata orale. Abbiamo dimostrato che preclinico, orale somministrazione di farmaci con il metodo ODS rappresenta un sicuro, conveniente, e umano alternativa alla sonda gastrica.
Abstract
È prima della prova nuove terapie negli esseri umani, a breve e lungo termine preclinico (cioè, animali), farmacologici ripetitivo e test tossicologici. Nella maggior parte dei casi, la via preferita di somministrazione è tramite somministrazione orale. Al momento attuale, la consegna orale è per lo più realizzata utilizzando una procedura gavage orale, in parte, perché può ottenere un dosaggio costante e preciso nel modello animale. Anche se questo metodo è ben consolidata che deve avere complicazioni che possono portare a un alto tasso di logoramento degli animali. A tal fine, la procedura introdotta qui descrive una alternativa al metodo gavage orale in cui il farmaco desiderato è integrato in una tastant, oralmente dissolvendo striscia (ODS) che possono semplicemente essere presentato agli animali di prova dove viene poi rapidamente ripreso con manipolazione minima del soggetto di prova. Qui, dimostriamo che preclinico, orale somministrazione di farmaci con il metodo ODS rappresenta un alte sicuro, conveniente, e umanarnative alla sonda gastrica.
Introduction
Affinché la definizione successo di un farmaco da preclinico (sperimentazione animale) a sviluppo clinico, una serie di ben definito, studi farmacologici e tossicologici acute e croniche devono essere eseguite nei modelli animali con il percorso clinico previsto di somministrazione (che è normalmente la via orale). Per raggiungere questo obiettivo, la maggior parte degli studi preclinici attualmente utilizzano un procedimento gavage orale dato che questo metodo comporta aspirazione costante e precisa del composto di prova per l'animale. Tuttavia, in molti casi, gavage orale non è ben tollerato da animali e prove accumulando suggerisce che il metodo è associato ad una notevole quantità di stress induzione 1.
Ciò è particolarmente vero per lo sviluppo di terapie per le condizioni di vita lungo croniche che richiedono studi preclinici a lungo termine, come ad esempio è il caso di, ma non limitato a, quasi tutti i disturbi neuropsichiatrici. per instanza, in un modello di topo transgenico della malattia di Alzheimer, è stato recentemente suggerito che il metodo gavage stesso potrebbe confondere i risultati sperimentali a causa della somministrazione di stress indotto 2. Allo stesso modo, in un modello murino di consumo di alcol, i risultati non pubblicati dal nostro laboratorio hanno scoperto che l'inserimento ripetitivo del tubo gavage - di per sé - può ridurre in modo significativo il livello di assunzione di alcol, fino al punto di mettere a repentaglio l'integrità del sperimentale paradigma (vedi Figura 1).
Date le limitazioni di cui sopra connessi con la procedura sonda gastrica, un notevole sforzo è stato messo verso lo sviluppo di nuovi metodi di preclinica somministrazione di farmaci per via orale. Approcci alternativi correnti comprendono incorporando il composto in esame in miscele di burro di arachidi 3, stampi gelatinosi 4-5, pellet cioccolato 6, 7 acqua, e crackers wafer 8 potabile, che sono tutti Associated con vari gradi di problemi compresa l'incapacità di essere utilizzato in modo affidabile nel modello animale, mancanza di adozione di assorbimento composto in esame dal soggetto di prova o preferenza individuale per sapore che rende il farmaco meno facilmente consumato 9.
La procedura introdotta qui descrive un metodo in cui il farmaco desiderato è integrato in una aromatizzata, oralmente sciogliendo striscia (ODS) che può essere facilmente e prontamente essere utilizzato per somministrare per via orale il composto di prova alla sperimentazione animale. Questo documento si concentra sul dimostrare l'efficacia del metodo ODS usando topi. Tuttavia, non vi è alcuna ragione di aspettarsi che lo stesso metodo non sarebbe utile anche in altri roditori nonché soggetti mammiferi più grandi. Clinicamente, l'uso di ODS sta iniziando a essere adottato in pazienti pediatrici e geriatrici, come un modo per superare le difficoltà di deglutizione 10. Proponiamo che ODS può anche essere utilizzato con successo nei programmi di scoperta di nuovi farmaci preclinici come un sicuro, conveniente, E umano alternativa alla sonda gastrica.
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Protocol
Tutti procedimento descritto sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) della University of Southern California.
1. Il trattamento degli animali e assuefazione
- Introduzione
- Consentire topi per acclimatarsi alle condizioni di allevamento e la tecnica di questo esperimento gestione per ridurre lo stress durante le procedure di amministrazione di droga che ne derivano. Durante questo tempo, registrare il peso corporeo e l'assunzione di cibo di ogni mouse; se desiderato, possono successivamente essere utilizzate come punto di confronto per valutare la tossicità del farmaco (opzionale) non invasivo. Il primo può anche essere usato per determinare in base al peso di dosaggio droga.
Nota: Aneddoticamente, la lunghezza del periodo di adattamento deve essere determinato in base al numero di sperimentatori che interagiscono con l'animale. Nella nostra esperienza, sono stati osservati i topi del ceppo / 6J C57BL ad avere problemi di abituare al trattamento da più di ~ 5 persone all'interno della nostra tipica periodo di adattamento di una settimana. Se possibile,sperimentatore (s) sono anche incoraggiati a non utilizzare lozioni profumate, saponi e profumi prima di maneggiare gli animali da precedenti relazioni indicano stimoli nuovi, come gli odori, può ostacolare il periodo di assuefazione 11.
- Consentire topi per acclimatarsi alle condizioni di allevamento e la tecnica di questo esperimento gestione per ridurre lo stress durante le procedure di amministrazione di droga che ne derivano. Durante questo tempo, registrare il peso corporeo e l'assunzione di cibo di ogni mouse; se desiderato, possono successivamente essere utilizzate come punto di confronto per valutare la tossicità del farmaco (opzionale) non invasivo. Il primo può anche essere usato per determinare in base al peso di dosaggio droga.
- passi
- Cominciando almeno 5 giorni prima dell'inizio dello studio, trasferire gli animali alla stanza in cui si verificano gli esperimenti successivi.
- Registrare il peso del mouse afferrando la metà della coda e sollevando delicatamente l'animale dalla gabbia e nella barca peso.
- Posizionare il mouse sulla scala appena viene sollevato dalla cagekeeping in mente di afferrare correttamente mediale / prossimale della coda, per evitare lesioni degloving, che possono verificarsi quando afferrando la porzione distale della coda 12.
- Registrare il valore di peso una volta che il mouse è stato in modo sicuro posto nella barca pesare.
- Registrare il peso del cibo per un raccoriparato 2 giorni consecutivi, al fine di stabilire i livelli di consumo alimentare di base che vi aiuteranno a catturare potenziali tossicità durante l'esperimento 13.
2. Preparazione di alimentazione Ago, saccarosio soluzione, e individuale ODS
- Utilizzare autoclave per sterilizzare gli aghi gavage acciaio inossidabile in preparazione per l'esperimento. Preparare 2 aghi / gruppo e 1 ago aggiuntivo da utilizzare come back-up in caso di necessità.
Nota: Questo studio ha utilizzato un 1,5 pollici, curvo, 18 G, acciaio alimentazione ago con una palla 2,25 millimetri all'estremità dell'ago. - Aggiungere 20 ml di acqua e 0,85 g di saccarosio per creare un 4,25% (w / v) di saccarosio.
Nota: A seconda dei parametri in esame altre basse dosi di saccarosio potrebbero potenzialmente essere utilizzato anche 14. - Preparare la striscia di dissoluzione orale (ODS) per ogni animale, tagliando la striscia rettangolare standard in un pezzo che è di 0,5 cm pollici di diametro noiing un disponibile in commercio singolo quarto di pollice buco-perforatore. La striscia rettangolare usato in questa dimostrazione è stato formulato per contenere 6 mg di ivermectina (IVM), e quando tagliare a questa dimensione, alloca un dosaggio 0,21 mg per ogni pezzo circolare singola approssimare una dose di 10 mg / kg per ciascun animale (nostro desiderata Dose / animale). Questa dose può essere regolata concentrando / diluendo la formulazione generale sulla striscia rettangolare e / o taglio del nastro in formato differente.
3. Drug - Consegna
- Registrare i valori di peso come precedentemente descritto nei passaggi 1,1-1,2.
- Dopo aver registrato il peso, spostare il mouse verso l'alto in metallo gabbia griglia. Una volta lì, utilizzando il pollice dominante, il dito indice, e 3 ° dito, tirare delicatamente indietro sulla coda. Questo farà sì che il mouse per afferrare inavvertitamente cima gabbietta e allungare la schiena, si estende il suo corpo lontano dal sperimentatore.
- Afferrare la collottola con la non-dopollice minant, dito indice, e 3 ° dito per frenare comodamente l'animale con una presa che è sicuro.
Nota: Uno sperimentatore con una mano più piccola può anche utilizzare il 4 ° dito della stessa mano, per tirare indietro la nuca del dorso e ottenere una presa più sicura del mouse. Inoltre, a seconda delle preferenze individuali, anulare, e / o mignolo può anche essere utilizzato per fissare la coda tuttavia questo non è necessario 12. - Tenere il mouse in posizione verticale.
- Attenzione: Osservare il colore delle membrane mucose del mouse. A / aspetto blu viola è un'indicazione che lo sperimentatore è cinching la collottola troppo stretto e il mouse non può respirare.
- In questo caso, subito messo il mouse verso il basso sulla parte superiore della gabbia di metallo e lasciarlo riposare per ~ 2-3 minuti prima di ritentare di trattenere l'animale.
- Immergere la punta lampadina dell'ago gavage in soluzione di saccarosio 4,25% a servire come un tastantadesivo alla ODS.
- Premere verso il basso su una pre-tagliati ODS con la punta lampadina dell'ago sonda gastrica per fissare la striscia per via orale dissoluzione.
- Presentare le ODS al mouse posizionandolo vicino alle narici e / o la bocca, e permettere all'animale di consumare il film. In alternativa le ODS possono essere consegnate localmente sulla cavità orale posizionando la sottile striscia direttamente sulla lingua per i topi di deglutire.
- Sostituire l'ago metà del gruppo durante la sessione di droga dosaggio per prevenire la diffusione dell'infezione.
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Representative Results
Nei seguenti indagini rappresentative, bere sociale è stato modellato con un due bottiglie scelta (TBC) paradigma 24 ore come descritto in precedenza 15. In breve, i topi avevano accesso a due bottiglie di soluzione, uno dei quali conteneva acqua e l'altra soluzione di etanolo 10% (v / v). I soggetti sono stati successivamente assegnati ai gruppi di trattamento della droga in modo che il (/ 90% di acqua v / v 10% di etanolo) assunzione media 10E è risultata simile tra i gruppi.
La Figura 1 illustra gli effetti di ivermectina (IVM) sulla preferenza bere quando somministrato per via orale utilizzando un veicolo sonda gastrica. Questo studio pilota ha 3 gruppi: N / A, placebo e IVM di n gavage, olio di mais (veicolo) gavage e IVM (10 mg / kg, diluito in olio di mais) gavage rispettivamente. I topi sono stati trattati per 10 giorni, 5 giorni consecutivi a settimana per 2 settimane. Come si può vedere di seguito, IVM è stata in grado di ridurre in modo significativo i 10ENtake attraverso lo studio rispetto al gruppo placebo. Rispetto a N / A, i valori di assunzione dell'etanolo del gruppo placebo (~ 5 g / kg), sono troppo bassi (48% rispetto al non-gavaged N / A gruppo), e quindi non può essere una rappresentazione accurata , o "modello", del comportamento bere sociale (~ 10-15 g / kg). Il che significa che un'incognita associati alla procedura gavage riuscito a compromettere l'integrità del paradigma bere.
La figura 2 illustra lo stesso esperimento successivamente eseguita utilizzando il sistema di erogazione ODS 15. Lo studio aveva 3 gruppi: 1) nessun film orale, 2) key lime pellicola orale aromatizzato senza IVM e 3) key lime aromatizzato pellicola orale con IVM (0,21 mg, che è equivalente a 10 mg / kg somministrata nello studio summenzionato ) indicato come il controllo, placebo e IVM, rispettivamente. I topi sono stati trattati per 20 giorni, 5 giorni consecutivi a settimana per 4 settimane. Non c'era diffe significativaRenče dell'assunzione di etanolo tra la N / A e topi trattati con placebo, indicando che il gruppo placebo ODS rappresentato un controllo valido che potrebbe quindi essere effettuato un confronto al gruppo IVM. In accordo con il lavoro precedente 13,15, IVM sensibilmente e costantemente ridotto apporto 10E.
Una rappresentazione grafica della tecnica è illustrata in figura 3.
I topi Figura 1. Gavaged di controllo sono in grado di mantenere i livelli di assunzione di etanolo Rappresentante della TBC Paradigma 24 ore. Maschi C57BL / 6J sono stati trattati per 10 giorni (5 giorni consecutivi a settimana per 2 settimane). Veicolo trattamento sonda gastrica del gruppo placebo significativamente alterata valori di assunzione di etanolo del 48% rispetto al non-gavage N / A gruppo. Anche se IVM ha ridotto significativamente l'assunzione 10E rispetto alplacebo, i bassi valori di aspirazione 10E del gruppo placebo aggiunto un secondo confound allo studio, che potrebbe avere l'effetto di compromettere l'utilità del gruppo come un adeguato controllo potabile per lo studio. grafici inserto illustrano l'assunzione media 10E il trattamento di 10 giorni. I valori rappresentano la media ± SEM per n = 6-8 topi / gruppo. +++ P <0.001 versus placebo, e *** P <0.001 rispetto a N / A, Turchia post-hoc test. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. ODS Trattamento di IVM. Femminile C57BL / 6J topi sono stati trattati per 20 giorni (5 giorni consecutivi a settimana per 4 settimane). Trattamento Placebo ODS non ha avuto effetto significativo sulla assunzione 10E, relative alla non-trattata N / A gruppo, mantenendo il Validity di placebo ODS come un adeguato controllo bere sociale. IVM ha ridotto significativamente l'assunzione 10E rispetto al placebo di controllo. grafici inserto illustrano l'assunzione media 10E il trattamento di 20 giorni. I valori rappresentano la media ± SEM per n = 6-8 topi / gruppo. *** P <0,001 versus placebo, Turchia post-hoc test .. Questo dato è stato modificato da Yardley et al. 15 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Rappresentazione pittorica di consegna ODS. Rappresentazione fotografica della procedura. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sonda gastrica è associata a numerose complicazioni che provocano potenzialmente compromessa la raccolta dei dati e alti tassi di logoramento degli animali 1. Qui un semplice metodo di somministrazione orale dei farmaci viene introdotto attraverso cui i topi (e potenzialmente altri animali) facile e affidabile possono consumare il farmaco di scelta attraverso una striscia oralmente dissoluzione (ODS). In particolare, l'uso di questo metodo rappresenta un sicuro, conveniente e umano alternativa alla sonda gastrica.
Altre alternative correnti verso sonda gastrica, anche se un po promettente, sono associati con varie limitazioni che li impediscono di coprire l'intera gamma di esigenze legate studi farmaco-dosaggio, come l'incapacità di essere utilizzato nei topi, o preferenza individuale per il sapore che rendono il farmaco meno facilmente consumato 9. Al contrario, ODS possono essere formulati in un'ampia varietà di sapori che è importante come singoli preferenze per sapore possono cambiare nel tempo e saporepreferenze possono differire tra vari ceppi e specie.
La corretta gestione degli animali è una componente essenziale di questa tecnica. Evidenziando l'importanza del periodo assuefazione, va notato che un dato di mouse può essere più difficile da trattenere se è particolarmente giovani o abituati a manipolazione. Qualsiasi difficoltà afferrare il mouse dovrebbe diminuire nel tempo in quanto l'animale è familiarizzato alla manipolazione e diventa meno paura dello sperimentatore (s). Il ceppo di topi C57 esemplificato nei risultati rappresentativi è stato osservato per abituarsi a gestire le procedure in tempi relativamente brevi (entro circa 1-3 sessioni di trattamento). Anche se tale durata può differire tra le varie specie e ceppi, non vi è alcun motivo di ritenere il lasso di tempo di acclimatazione sarebbe degenerare in modo significativo. tecnici inesperti lavorano con i roditori devono essere consapevoli che, quando sospesi e penzoloni in aria per più di pochi secondi, i topi sono suscettibili allo sviluppo di un deglovinglesioni alla coda 12. Le probabilità di questo che si verificano con l'aumento di peso del mouse e con il posizionamento della mano, con una stretta vicino alla punta della coda più probabilità di causare lesioni. Specifica la portata di questo protocollo, è imperativo che il mouse viene posizionato sulla parte superiore della gabbia griglia metallica, o in un apparecchio alternativo, quando viene trasferito da gabbia in scala, così come in preparazione per somministrazione di farmaci. Restraint durante il processo di somministrazione di farmaci è un altro passo fondamentale all'interno del protocollo. consumo di ODS può avvenire posizionando il film sottile vicino alle narici e / o la bocca del mouse, nel qual caso il soggetto piegarsi in avanti per consumare il film. In alternativa le ODS possono essere consegnate localmente sulla cavità orale posizionando manualmente il film direttamente sulla lingua per il mouse di deglutire.
Le indagini che coinvolgono la valutazione dei parametri di stress-sensibili possono essere confusi con l'uso di standard mantecniche sessuale di ritenuta raffigurati in questo protocollo e semplici regolazioni alla metodologia possono essere facilmente realizzati per ospitare studi in cui è vietato moderazione. In questo approccio modificato, le ODS potrebbe essere collocato direttamente nella gabbia per l'animale di consumare. Osservazioni raccolte da studi pilota nel nostro laboratorio indicano che questo sarebbe meglio essere eseguita collocando gli animali in gabbia senza assestamento / materiale di nidificazione, solo per la durata della procedura somministrazione di farmaci, in modo da aumentare la facilità con cui il consumo ODS può essere monitorata visivamente dallo sperimentatore (s). Inoltre, potrebbe essere opportuno avviare un periodo di formazione durante i quali vengono introdotti gli animali alle ODS in modo che possano superare l'evitamento innata iniziale del nuovo prodotto alimentare 4. Naturalmente sarebbero necessari ulteriori studi per ottimizzare un protocollo senza ritegno per la consegna ODS, tuttavia non vi è alcuna ragione di credere che tale procedura non poteva essere fatto con facilità.
In particolare, in termini di riproducibilità dei dati, ODS possono essere formulati per aderire alla lingua o la guancia dell'animale e progettato per una rapida disgregazione orale per rilasciare rapidamente il farmaco, assicurando così il corretto dosaggio è raggiunto. E, con la somministrazione ODS, la necessità per gavage e altre esperienze invasive spiacevoli per l'animale viene eliminato. Non solo questo è più umano, ma minimizza anche gli effetti dello stress come una variabile nell'esperimento. Va notato thal metodo di ODS può essere ulteriormente ottimizzata, come in molti nuovi processi di fabbricazione, che possono migliorare ulteriormente la farmacocinetica del composto in esame come ODS è espanso per terapie aggiuntive. Una limitazione che dovrebbe essere sottolineato riguarda il fatto che lo sviluppo di ODS è nelle prime fasi di sviluppo. Le questioni relative al caricamento di diversi farmaci caratteristica fisico-chimica sulla piattaforma tastant / ODS rimane una sfida per la versatilità e la generalizzazione di questa tecnica. Questa è un'area di ricerca continua.
La tecnica proposta è una tecnica semplice e romanzo che può essere adottata per l'utilizzo in studi su animali preclinici breve e lungo termine e per la consegna dei farmaci per gli animali (ad esempio, cani). Drug delivery attraverso ODS rappresenta un nuovo, veloce, conveniente e umano approccio rispetto agli approcci tradizionali esistenti, come compresse, capsule, liquidi, polveri e gel e, gavage orale.
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Disclosures
DD ha fatto domanda per un brevetto come co-inventore di questo metodo ed è interessato a condividere questo metodo con il comitato scientifico per rendere questa tecnica ben nota e prontamente disponibili per i test sugli animali cronica (consegna orale del farmaco Attivi in animali da laboratorio Uso di Fast- sciogliendo Films orali (Davies, co-inventore, domanda di brevetto depositata 2014/06/23).
Non ci sono altri interessi finanziari concorrenti sono noti.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere Jamie Thuy per il lavoro tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto, in parte, da Research concede SC CTSI NIH / NCRR / NCATS - UL1TR000130 (DLD), AA022448 (DLD), e la USC School of Pharmacy. Inoltre, a rapida dissoluzione film orali contenenti IVM sono stati gentilmente forniti da Cure Pharmaceutical (Oxnard, CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orally Dissolving Strip | Cure Pharmaceutical | Available upon special request. Alternatively, ODS may also be prepared in-house. | |
| Gavage Feeding Needle | VWR | 7912 | Our rodent studies utilized a 18 gauge feeding needle. This size may need to be adjusted for use in other mammilian species. |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G |
References
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