Utilizando un Disolución de Gaza por vía oral para estudios farmacológicos y toxicológicos: una alternativa sencilla y humana a una sonda nasogástrica para Animales

Summary

El siguiente protocolo describe un nuevo método para la administración crónica de fármaco oral usando una tira de disolución por vía oral (SAO) en lugar del método de sonda oral usado más comúnmente. Se demuestra que la administración de fármacos preclínicos, la oral, utilizando el método de SAO representa una alternativa segura, conveniente y humana de una sonda nasogástrica.

Abstract

Se requiere antes de probar nuevos productos terapéuticos en los seres humanos, a corto y largo plazo preclínica (es decir, de origen animal), farmacológica repetitivo y pruebas toxicológicas. En la mayoría de los casos, la vía preferida de administración es mediante administración oral. En la actualidad, la administración oral es en su mayoría a cabo usando un procedimiento de sonda oral, en parte, debido a que puede lograr una dosificación consistente y precisa en el modelo animal. Aunque este método está bien establecido que sí tiene complicaciones que pueden resultar en una alta tasa de desgaste animal. Para este fin, el procedimiento introducido aquí describe una alternativa al método de sonda oral en la que el fármaco deseado se incorpora en un saborizante, la disolución por vía oral de la tira (ODS) que simplemente puede ser presentado para el animal de prueba donde es entonces tomada rápidamente con manipulación mínima del sujeto de prueba. En esto, se demuestra que la administración de fármacos preclínicos, la oral, utilizando el método de SAO representa una alte segura, conveniente y humanarnative para alimentación forzada oral.

Introduction

A fin de que la traducción con éxito de un fármaco a partir de (ensayos con animales) preclínico para el desarrollo clínico, bien definido una serie de, los estudios farmacológicos y toxicológicos agudos y crónicos necesitan ser realizados en modelos animales usando la ruta clínica de administración deseada (que es normalmente la ruta oral). Para lograr este objetivo, la mayoría de los estudios pre-clínicos actualmente utilizan un procedimiento de sonda oral dado que los resultados de este método en una entrega constante y precisa del compuesto de ensayo para el animal. Sin embargo, en muchos casos, sonda oral no es bien tolerada por el animal y la evidencia acumulada sugiere que el método se asocia con una cantidad significativa de inducción de estrés ^1.

Esto es especialmente cierto en el desarrollo de tratamientos para las condiciones de vida de larga crónicas que requieren estudios preclínicos a más largo plazo, como es el caso de, pero no limitado a, casi todos trastorno neuropsiquiátrico. para insdistancia, en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer, se sugirió recientemente que el método de alimentación forzada en sí podría confundir los resultados experimentales debido a la dosificación estrés ² inducida. Del mismo modo, en un modelo de ratón de consumo de alcohol, los resultados no publicados de nuestro laboratorio han encontrado que la inserción repetitiva de la sonda de alimentación - de por sí - puede reducir significativamente el nivel de consumo de alcohol hasta el punto de poner en peligro la integridad de la experimentación paradigma (ver Figura 1).

Dadas las limitaciones mencionadas anteriormente asociadas con el procedimiento de sonda oral, considerable esfuerzo se ha puesto hacia el desarrollo de nuevos métodos de administración de fármaco oral preclínica. Enfoques alternativos actuales incluyen la incorporación del compuesto de prueba en mezclas de mantequilla de maní ^3, mohos gelatinosos ^4-5, gránulos de chocolate ^{6, 7} de agua, y galletas de barquillo ⁸ potable, todos los cuales son associado con diversos grados de temas, incluyendo la incapacidad de ser utilizado de forma fiable en el modelo animal, la falta de adopción de la captación de compuesto de ensayo por el sujeto de la prueba o la preferencia individual para el sabor que hace que el fármaco consume menos fácilmente ^9.

El procedimiento presentado en la presente memoria se describe un método en el que el fármaco deseado se incorpora en una, tiras solubles por vía oral con sabor (ODS) que puede ser fácil y rápidamente ser utilizado para administrar por vía oral el compuesto de ensayo a los animales de prueba. Este documento se centra en demostrar la eficacia del método de SAO utilizando ratones. Sin embargo, no hay razón para esperar que el mismo método no sería también útil en otro roedor, así como sujetos mamíferos más grandes. Clínicamente, el uso de SAO está empezando a ser adoptados en pacientes pediátricos y geriátricos, como una manera de superar las dificultades para deglutir ^10. Proponemos que ODS también se puede utilizar con éxito en programas de descubrimiento de fármacos preclínicos como un seguro, convenienteY alternativa humana a la sonda oral.

Protocol

Todo el procedimiento descrito han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad del Sur de California.

1. Manejo de Animales y habituación

1. Introducción
   1. Permitir que los ratones se aclimaten a las condiciones de cría y manejo de la técnica del experimento para reducir el estrés durante los procedimientos de administración de fármacos siguientes. Durante este tiempo, se registra el peso corporal y la ingesta de alimentos de cada ratón; si se desea, que más tarde se pueden utilizar como un punto de comparación para evaluar la toxicidad del fármaco (opcional) no invasiva. El anterior también se puede utilizar para determinar la dosificación basada en el peso de drogas.
      Nota: anecdótica, la duración del período de habituación debe ser determinado basado en el número de experimentadores que interactúan con el animal. En nuestra experiencia, se han observado los ratones de la cepa C57BL / 6J a tener problemas para habituar a la manipulación por los más de ~ 5 personas dentro de nuestro periodo de habituación de una semana típica. Si es factible,Se anima también experimentador (s) de abstenerse de usar lociones perfumadas, jabones, perfumes y antes de manipular los animales como los informes previos indican los estímulos novedosos, tales como olores, puede dificultar el periodo de habituación ^11.
2. Pasos
   1. A partir de al menos 5 días antes de la iniciación del estudio, la transferencia de los animales a la sala en la que se producirán los experimentos posteriores.
   2. Anotar el peso del ratón sujetando firmemente el medio de la cola y levantando suavemente el animal fuera de la jaula y en la barca de peso.
      1. Coloque el ratón en la escala tan pronto como se levanta fuera de la cagekeeping en cuenta para comprender adecuadamente la cara medial / proximal de la cola, que se evitan lesiones de disección, que pueden ocurrir si se agarra a la cara distal de la cola ^12.
      2. Registrar el valor de peso una vez que el ratón se ha colocado de forma segura en el recipiente para pesar.
   3. Anotar el peso de la comida para un recoreparado 2 días consecutivos, con el fin de establecer los niveles de consumo de alimentos básico que ayude a capturar los posibles efectos tóxicos durante el experimento ^13.

2. Preparación de la aguja de alimentación, Solución de sucrosa, y ODS individual

1. Utilice un autoclave para esterilizar las agujas alimentación forzada de acero inoxidable en la preparación para el experimento. Preparar 2 agujas / grupo y 1 aguja adicional para ser utilizado como una copia de seguridad si es necesario.
   Nota: En este estudio se utilizó un 1,5 pulgadas, curvos, 18 G, acero inoxidable aguja de alimentación con un balón de 2,25 mm en el extremo de la aguja.
2. Añadir 20 ml de agua a 0,85 g de sacarosa para crear un 4,25% (v w /) solución de sacarosa.
   Nota: En función de los parámetros que se está evaluando otras dosis bajas de sacarosa potencialmente podrían también ser utilizado ^14.
3. Preparar la tira de disolución oral (SAO) para cada animal mediante la reducción de la tira de prueba estándar rectangular en una pieza que es de 0,5 cm pulgadas de diámetro con nosotrosing un solo cuarto de pulgada perfórelas disponible en el mercado. La tira de ensayo rectangular utilizado en esta demostración se formuló para contener 6 mg de ivermectina (IVM), y cuando se corta a este tamaño, asigna un 0,21 mg de dosis a cada pieza circular individuo que se aproxima una dosis de 10 mg / kg para cada animal (nuestro deseado dosis / animal). Esta dosis se puede ajustar mediante la concentración / dilución de la formulación global en la tira rectangular y / o el corte de la tira en diferentes tamaños.

3. Medicamentos - Entrega

1. Registre los valores de peso como se ha descrito anteriormente en los pasos 1.1-1.2.
2. Después de registrar el peso, mueva el ratón a la parte superior de metal rejilla jaula. Una vez allí, utilizando el pulgar dominante, el dedo índice, y el dedo ^3º, tire suavemente hacia atrás en la cola. Esto hará que el ratón para agarrar la parte superior inadvertidamente jaula de alambre y estirar la espalda, estirando su cuerpo lejos de la experimentador.
3. Agarre la piel del cuello con el no-dominante pulgar, el dedo índice, y el dedo ^3º para frenar cómodamente al animal con un apretón que es seguro.
   Nota: Un experimentador con una mano más pequeña también puede utilizar el ^4º dedo de la misma mano, al tirar hacia atrás la piel del atrás y obtener una sujeción más segura del ratón. Además, dependiendo de la preferencia individual, dedo anular, y / o el dedo meñique también puede ser utilizado para asegurar la cola sin embargo esto no es necesario ^12.
4. Mantenga pulsado el ratón en una posición vertical.
5. Precaución: Observe el color de las membranas mucosas del ratón. Un aspecto púrpura / azul es una indicación de que el experimentador se cinchar el pescuezo con demasiada fuerza y ​​el ratón no puede respirar.
   1. Si esto ocurre, inmediatamente poner el ratón de nuevo en la cima de la jaula de metal y deje reposar por unos 2-3 minutos antes de volver a intentar frenar el animal.
6. Sumergir la punta del bulbo de la aguja de sonda en solución de sacarosa 4,25% para servir como un saborizanteadhesivo a las SAO.
7. Presione hacia abajo en un pre-cortadas SAO con la punta del bulbo de la aguja de sonda para unir la tira de disolución por vía oral.
8. Presentar las SAO en el ratón colocándolo cerca de las ventanas de la nariz y / o boca, y permitir que el animal consuma la película. Alternativamente, los ODS pueden ser entregados por vía tópica a la cavidad oral mediante la colocación de la tira fina directamente sobre la lengüeta para los ratones de tragar.
9. Vuelva a colocar la aguja mediados de grupo durante la sesión de la dosificación del medicamento para prevenir la propagación de la infección.

Representative Results

En las siguientes investigaciones representativas, la bebida social se modeló utilizando un paradigma de la elección de 24 horas de dos botellas (TBC) como se ha descrito previamente ^15. Brevemente, los ratones tuvieron acceso a dos botellas de solución, uno de los cuales contenía agua, y la otra solución de etanol de un 10% (v / v). Los sujetos fueron asignados posteriormente a grupos de tratamiento de drogas de manera que el (/ 90% / 10% v de etanol agua v) 10E ingesta media fue similar en todos los grupos.

La Figura 1 ilustra los efectos de la ivermectina (IVM) de la bebida de preferencia cuando se administra oralmente utilizando un vehículo sonda. Este estudio piloto tenía 3 grupos: N / A, placebo, y que representa IVM no gavage sonda, aceite de maíz (vehículo), y IVM (10 mg / kg, se diluyó en aceite de maíz) gavage respectivamente. Los ratones fueron tratados durante 10 días, 5 días consecutivos por semana durante 2 semanas. Como se puede ver a continuación, IVM fue capaz de reducir significativamente i 10ENtake a través del estudio en comparación con el grupo placebo. En comparación con N / A, los valores de ingesta de etanol del grupo placebo (~ 5 g / kg), son demasiado bajos (48% más bajos que los no gavaged N / grupo A), y por lo tanto, pueden no ser una representación exacta o "modelo", el comportamiento de consumo social (~ 10-15 g / kg). Lo que significa que un factor desconocido asociado con el procedimiento de alimentación forzada logró poner en peligro la integridad del paradigma de la bebida.

La Figura 2 ilustra el mismo experimento posteriormente realizó utilizando el sistema de entrega ¹⁵ ODS. El estudio tenía 3 grupos: 1) ninguna película oral, 2) de lima película vía oral con sabor sin IVM y 3) de lima película vía oral con sabor a IVM (0,21 mg, que es equivalente a los 10 mg / kg administrada en el estudio antes mencionado ) se refiere como el control, el placebo y el IVM, respectivamente. Los ratones fueron tratados durante 20 días, 5 días consecutivos por semana durante 4 semanas. No hubo dife significativarencia en la ingesta de etanol entre la N / A y de los ratones tratados con placebo, lo que indica que el grupo de placebo ODS representado un control válido con la que luego se podría hacer una comparación con el grupo de IVM. De acuerdo con trabajos previos ^13,15, IVM significativa y consistentemente reduce la ingesta de 10E.

Una representación gráfica de la técnica se muestra en la Figura 3.

Los ratones de control Figura 1. gavaged son incapaces de mantener los niveles de etanol de admisión Representante del Paradigma de TBC 24 horas. Macho C57BL / 6J ratones fueron tratados durante 10 días (5 días consecutivos por semana durante 2 semanas). Vehículo tratamiento alimentación forzada del grupo placebo alteró significativamente los valores de la ingesta de etanol en un 48% en comparación con el N no gavage / A grupo. Aunque IVM reduce significativamente el consumo de 10E en comparación conplacebo, los valores bajos de ingesta 10E del grupo de placebo añadido un segundo factor de confusión para el estudio, lo que podría tener el efecto de poner en peligro la utilidad del grupo como un control potable adecuada para el estudio. gráficos de inserción ilustran la ingesta media 10E sobre el tratamiento de 10 días. Los valores representan la media ± SEM para n = 6-8 ratones / grupo. +++ P <0,001 frente a placebo, y *** P <0,001 frente al N / A, post-hoc test Turquía. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Tratamiento de SAO IVM. Hembra C57BL / 6J ratones fueron tratados durante 20 días (5 días consecutivos por semana durante 4 semanas). El tratamiento con placebo ODS no tuvo efecto significativo en la ingesta de 10E, con respecto a la no tratada N / A grupo, manteniendo el valididad de SAO placebo como un control adecuado de la bebida social. IVM reduce significativamente el consumo de 10E comparación con el control placebo. gráficos de inserción ilustran la ingesta media 10E sobre el tratamiento de 20 días. Los valores representan la media ± SEM para n = 6-8 ratones / grupo. *** P <0,001 frente a placebo, prueba post-hoc de Turquía .. Esta cifra ha sido modificado a partir de Yardley et al. ¹⁵ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Representación ilustrada de entrega de SAO. Representación fotográfica del procedimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Sonda oral está asociada con numerosas complicaciones que resultan en la recopilación de datos potencialmente en peligro y las altas tasas de desgaste de los animales ^1. Aquí se introduce un método simple de administración oral de fármacos a través de los que los ratones (y potencialmente otros animales) pueden consumir fácilmente y de forma fiable el fármaco de elección a través de una tira de la disolución por vía oral (SAO). Cabe destacar que el uso de este método representa una alternativa segura, conveniente y humana de una sonda nasogástrica.

Otras alternativas actuales a la sonda oral, aunque algo prometedor, se asocian con diversas limitaciones que les impiden que cubre toda la gama de necesidades relacionadas con los estudios de la dosificación de la droga tales como una incapacidad para ser utilizado en los ratones, o la preferencia individual de sabor que hacen que el drogas consume menos fácilmente ^9. En contraste, ODS se pueden formular en una amplia variedad de sabores que es importante como las preferencias individuales para el sabor pueden cambiar con el tiempo y el saborpreferencias pueden variar entre diferentes cepas y especies.

El manejo adecuado de los animales es un componente esencial de esta técnica. Destacando la importancia del periodo de habituación, hay que señalar que un ratón dado puede ser más difícil de contener, si es particularmente jóvenes o poco acostumbrado a la manipulación. Cualquier dificultad para entender el ratón debe desaparecer a medida que el animal está familiarizado con el manejo y se hace menos temerosa del experimentador (s). La cepa de ratón C57 se ejemplifica en los resultados representativos se ha observado que habituarse al manejo de procedimientos relativamente rápido (dentro de aproximadamente 1-3 sesiones de manipulación). Aunque esta duración puede diferir en las distintas especies y cepas, no hay ninguna razón para suponer el plazo de aclimatación se multiplicarían de manera significativa. Los técnicos noveles que trabajan con roedores deben ser conscientes de que, cuando se suspendió y colgando en el aire durante más de unos pocos segundos, los ratones son susceptibles al desarrollo de un deglovinglesiones en la cola ^12. Las posibilidades de este aumento que tuvo lugar con el peso del ratón, así como con la colocación de la mano, con una comprensión más cerca de la punta de la cola más probable que cause una lesión. Específicas al ámbito de este protocolo, es imperativo que el ratón se coloca en la parte superior jaula de rejilla de metal, o en un aparato alternativo, cuando se transfiere de jaula a escala, así como en la preparación para administración de fármacos. Moderación durante el proceso de liberación de fármacos es otro paso crítico dentro del protocolo. el consumo de SAO se puede producir mediante la colocación de la película delgada cerca de las ventanas de la nariz y / o boca del ratón, en cuyo caso el tema se inclinará hacia adelante para consumir la película. Alternativamente, los ODS pueden ser entregados por vía tópica a la cavidad oral mediante la colocación manual de la película directamente sobre la lengüeta para el ratón de tragar.

Las investigaciones que implican la evaluación de parámetros sensibles al estrés pueden ser confundidos por el uso de la norma hombretécnicas de inmovilización UAL descritas en el presente protocolo y simples ajustes a la metodología se pueden hacer fácilmente para dar cabida a los estudios en los que se prohíbe la restricción. En este enfoque modificado, el ODS podrían ser colocados directamente en la jaula para que el animal consume. Observaciones obtenidos de estudios piloto en nuestro propio laboratorio indican que este mejor se realiza colocando los animales en una jaula sin ningún material de cama / anidación, sólo para la duración del procedimiento de administración de fármacos, con el fin de aumentar la facilidad con la que el consumo de SAO se puede controlar visualmente por el experimentador (s). Por otra parte, podría ser conveniente iniciar un período de entrenamiento durante el cual se introducen los animales a las SAO para que puedan superar la evitación innata inicial del nuevo alimento ^4. Por supuesto serían necesarios más estudios para optimizar un protocolo sin sujeciones para la entrega de SAO, sin embargo no hay ninguna razón para creer que tal procedimiento no se podía hacer con facilidad.

En particular, en términos de la reproducibilidad de datos, ODS pueden ser formulados para adherirse a la lengua o la mejilla del animal y diseñados para una rápida disgregación oral para liberar rápidamente el fármaco, asegurando así se consigue una dosificación correcta. Y, con la administración ODS, se elimina la necesidad de alimentación forzada y otras experiencias invasivos desagradable para el animal. Esto no sólo es más humana sino que también reduce al mínimo los efectos de la tensión como una variable en el experimento. Cabe señalar THen el método de ODS se puede optimizar aún más, como en muchos de los nuevos procesos de fabricación, lo que puede mejorar aún más la farmacocinética del compuesto de ensayo como ODS se expande para terapias adicionales. Una limitación que se debe señalar que se refiere al hecho de que el desarrollo de ODS está en las primeras etapas de desarrollo. Las cuestiones relativas a la carga de los diferentes fármacos característica fisicoquímica sobre la plataforma de saborizante / SAO sigue siendo un desafío a la versatilidad y la generalización de esta técnica. Esta es un área de investigación en curso.

La técnica propuesta es una técnica sencilla y novedosa que puede ser adoptado para su uso en estudios preclínicos con animales corto y largo plazo y para la entrega de medicamentos a los animales (por ejemplo, perros). El suministro de fármacos a través de ODS representa un enfoque nuevo, rápido, práctico y humano en comparación con los enfoques tradicionales existentes, como comprimidos, cápsulas, líquidos, polvos y geles y, sonda oral.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orally Dissolving Strip	Cure Pharmaceutical		Available upon special request. Alternatively, ODS may also be prepared in-house.
Gavage Feeding Needle	VWR	7912	Our rodent studies utilized a 18 gauge feeding needle. This size may need to be adjusted for use in other mammilian species.
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G