Artigo de método

LC-MS Análise de plaquetas humanas como uma plataforma para estudar mitocondrial Metabolism

DOI:

10.3791/53941

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4 de abril de 2016

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1Center for Cancer Pharmacology, University of Pennsylvania, 2Center for Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania, 3Penn SRP and Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 4Division of Traumatology, Department of Surgery, Critical Care and Acute Care Surgery, University of Pennsylvania, 5A.J. Drexel Autism Institute, Drexel University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui mostramos plaquetas humanas isoladas podem ser usadas como uma acessível ex vivo modelo para estudar adaptações metabólicas em resposta ao inibidor do complexo I rotenona. Esta abordagem emprega rastreio isotópica e quantificação relativa por espectrometria de massa de cromatografia de líquido e pode ser aplicado a uma variedade de modelos de estudo.

Resumo

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O metabolismo mitocondrial perturbado recebeu interesse renovado por desempenhar um papel causador em uma série de doenças. A sondagem de alterações nas vias metabólicas requer um modelo no qual os fatores externos possam ser bem controlados, permitindo resultados reprodutíveis e significativos. Muitos estudos empregam modelos celulares transformados para esses fins; no entanto, a reprogramação metabólica que ocorre em muitas linhagens de células cancerígenas pode introduzir variáveis de confusão. Por esse motivo, as células primárias são desejáveis, embora a obtenção de biomassa adequada para estudos metabólicos possa ser um desafio. Aqui mostramos que as plaquetas humanas podem ser utilizadas como uma plataforma para realizar estudos metabólicos em combinação com a análise de cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem. Essa abordagem é passível de quantificação relativa e marcação isotópica para investigar a atividade de vias metabólicas específicas. A disponibilidade de plaquetas de doadores individuais ou de bancos de sangue torna esse sistema modelo aplicável a estudos clínicos e viável para ampliação. Aqui, utilizamos plaquetas isoladas para confirmar mudanças metabólicas compensatórias previamente identificadas em resposta ao inibidor do complexo I rotenona. Mais especificamente, uma diminuição na glicólise é acompanhada por um aumento na oxidação de ácidos graxos para manter os níveis de acetil-CoA. Nossos resultados mostram que as plaquetas podem ser usadas como um modelo de fácil acesso e clinicamente relevante para investigar os efeitos dos xenobióticos no metabolismo celular.

Introdução

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Metabolismo mitocondrial disfuncional tem sido implicada numa ampla variedade de doenças, incluindo a neurodegeneração, cancro, doenças cardiovasculares e 30. Como tal, um grande esforço foi colocado sobre a caracterização de defeitos metabólicos que contribuem para a patogénese da doença. Espectrometria de massa de cromatografia líquida-tandem (LC-MS / MS) é considerada o padrão-ouro para a quantificação de analitos a partir de matrizes biológicas complexas e muitas vezes é empregada para estudos metabólicos 8. No entanto, como é frequentemente o caso com estudos biomédicos, atingindo um modelo acessível e bem definida relevantes para doenças humanas é um desafio.

Muitos estudos empregam transformado modelos celulares para sondar o impacto de xenobióticos ou anormalidades genéticas no metabolismo celular 7,9. A reprogramação metabólica que ocorre em células cancerosas podem introduzir factores de confusão 21 e, portanto, não são ideais. Estas questões podem ser circumvented com modelos de células primárias, embora a obtenção de biomassa suficiente para análises metabólicas pode ser um desafio. Além disso, o impacto de elevadas quantidades de antibióticos utilizados na cultura tem sido destacado como estudos mitocondriais potencialmente de confusão 16.

Plaquetas humanas dar a oportunidade de utilizar um modelo de célula primária com conteúdo mitocondrial suficiente para estudos metabólicos 5,22,27,32. Em primeiro lugar, as plaquetas podem ser facilmente adquiridos, através de exames de sangue de doadores individuais, ou em grandes volumes de bancos de sangue e, portanto, fornecer um modelo em que fatores externos podem ser facilmente controlado. Em segundo lugar, devido ao seu pequeno tamanho, as plaquetas podem ser facilmente isolados a partir de outros componentes do sangue com o trabalho preparatório mínima em laboratórios mesmo minimamente equipados 5. Digno de nota, as plaquetas não contêm núcleo e pode, portanto, ser usadas para estudar alterações ao metabolismo independentemente da regulação da transcrição. Aqui nós mostramos queAlém de quantificação relativa de tioésteres de acil-coenzima A (CoA), o sistema de plaquetas isoladas podem ser usadas para analisar o metabolismo de carbono. Especificamente, nós relatamos o uso de marcação metabólica com isótopo estável (não radioativo) marcado [13 C 6] -glucose e [13 C 16] -palmitato para sondar incorporação da [13 C] -label para o importante acetil metabólito CoA através da glicólise ou da oxidação de ácidos gordos. Isto proporciona uma plataforma poderosa, generalizável, e versátil devido ao amplo envolvimento de espécies acil-CoA em vias bioquímicas 13,24 ea rastreabilidade deste sistema para testar outras variáveis, tais como a inibição do complexo I com rotenona 3,33. Além das informações fornecidas no protocolo a seguir, uma extensa descrição dos métodos utilizados para a rotulagem isótopo e para as análises baseadas em LC-MS pode ser encontrado em Basu e Blair 4.

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Protocolo

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Declaração de Ética: Todos os protocolos relativos ao tratamento de amostras humanas seguir as orientações do comitê de ética em pesquisa humana da Universidade da Pensilvânia.

1. Preparação de tampões e soluções de reserva 100X

  1. Prepare 1 litro de solução tampão de Tyrode de base. Combinar 8,123 g de NaCl, 1,428 g de NaHCO3, 0,466 g de CaCl 2 ∙ 2 H 2 O, 0,224 g de KCl, e 0,095 g de MgCl 2. Ajustar o volume total a 1 L com ddH 2 O. Filtro de esterilizar tampão de base de Tyrode.
  2. Preparar soluções de concentrado 100X de glicose e de ácido palmítico. Para 100x soluções de glicose, dissolver 100 mg de glicose ou [13 C 6] -glucose em 1 ml de DDH 2 O. Para soluções de palmitato de 100x, dissolve-se 2,56 mg de ácido palmítico ou 2,72 mg de [13 C 16] ácido -palmitic em 1 ml de etanol. Filtro de esterilizar 100x soluções estoque.
  3. Prepare Buffers é apropriado Enriched Tyrode
    1. Para estudos não-marcação, adicionar 1 ml de 100x solução de glucose e 1 ml de 100x solução de ácido palmítico a 98 ml de tampão de base de Tyrode.
    2. Para os estudos de rotulagem de glicose, adicionar 1 ml de 100x [6 13 C] -glucose solução estoque e 1 ml de 100x solução mãe de ácido palmítico a 98 ml de tampão de Tyrode de base.
    3. Para os estudos de rotulagem ácido palmítico, adicionar 1 ml de solução de 100x da glucose e 1 ml de [13 C 16] da solução de ácido -palmitic a 98 ml de tampão de Tyrode de base.
  4. Prepare Soluções para Rotenone Tratamento
    1. Prepara-se uma solução de estoque 10 mM de rotenona em sulfóxido de dimetilo (DMSO).
    2. Para os estudos de dose-resposta não-marcação, passe para 1.4.3. Para os estudos de rotulagem em uma única dose, prossiga para 1.4.5.
    3. Efectuar uma diluição em série do stock de rotenona 10 mM em DMSO, para obter soluções com concentrações que variam de rotenona 1 nM a 100 uM. Estes são 100x estoques.
    4. Adicionar 50 ul de cada unidade de 5 ml de tampão de Tyrode base de glucose + ácido palmítico + a partir de 1.3.1 para preparar soluções com concentrações que variam de rotenona de 10 pM a 1 uM. Alternativamente, adicionar 50 ul de DMSO para servir como um controlo do veículo. Avance para o 2.1.
    5. Dilui-se a solução de stock 10 mM de 1000 vezes em DMSO para se obter uma solução de trabalho a 10 uM.
    6. Adicionar 50 ul deste estoque a 5 ml cada de tampão a base de Tyrode + [13 C 6] -glucose + ácido palmítico a partir de 1.3.2 e base de tampão de Tyrode + glucose + [13 C 16] ácido -palmitic de 1.3.3. A concentração final é de 100 nM de rotenona. Alternativamente, adicionar 50 ul de DMSO para cada um dos tampões para servir como controlos de veículo.

2. plaquetas Isolamento

Nota: Este método é passível de plaquetas derivadas quer de sangue total ou a partir de sacos de plaquetas. Os dados de exemplo contidas neste documento foi preparadousando plaquetas derivadas a partir de sacos de plaquetas. Por favor, veja Basu et al. 5 para obter mais detalhes sobre usando plaquetas isoladas de sangue total.

  1. Isolamento de plaquetas a partir de sangue inteiro
    NOTA: Se isolar plaquetas de um saco de plaquetas, prossiga para 2.2.1.
    1. Centrifugar o sangue total a 175 x g durante 15 min sem freios.
    2. Transferir 1 ml do plasma rico em plaquetas superior (PRP) camada para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    3. Centrifuga-se o PRP a 400 x g durante 5 min.
    4. Aspirar o sobrenadante e prossiga para a etapa 3.1 ou 3.2.
  2. Isolamento de plaquetas a partir de um saco de plaquetas
    1. Transferir 1 ml da suspensão de plaquetas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Centrifugar a suspensão a 400 xg durante 5 min.
    3. Aspirar o sobrenadante e prossiga para a etapa 3.1. ou 3.2.

3. executando uma experiência

  1. Para determinar o efeito de xenobióticostratamento (por exemplo, rotenona) sobre os níveis de um metabolito de interesse (por exemplo, acetil-CoA), proceder à 3.1.1. Para determinar o efeito de um xenobióticos (por exemplo., Rotenona) sobre a incorporação de um precursor metabólico para um metabolito de interesse a jusante, proceder à 3.2.1.
    1. Usando nada menos do que três repetições biológicas para cada condição, ressuspender pellet de plaquetas a partir do passo 2.1.4 ou 2.2.3 em 1 ml de cada solução do passo 1.4.4.
    2. Incubar plaquetas ressuspensas em uma incubadora de CO 2 com camisa de água fixada a 95% de humidade, 5% de CO 2 e 37 ° C durante 1 h. Avance para o passo 4.1
      Nota: Aqui nós descrevemos um experimento de resposta à dose. Alternativamente, uma experiência ao longo do tempo poderia ser feito, em que a dose foi fixada e a duração da incubação foi variada em vez disso.
  2. Para determinar o efeito do tratamento de xenobióticos em incorporação de um precursor metabólico para um metabolito de interesse a jusante.
    1. vocêcantar nada menos que três repetições biológicas para cada condição, ressuspender pellet de plaquetas a partir do passo 2.1.4 ou 2.2.3 em 1 ml de cada formulação do tampão de Tyrode marcado a partir do passo 1.4.6.
    2. Incubar plaquetas ressuspensas em uma incubadora de CO 2 com camisa de água fixada a 95% de humidade, 5% de CO 2 e 37 ° C durante 1 h. Avance para o passo 4.1.

4. Têmpera e CoA Extração

  1. Sedimentar plaquetas por centrifugação a 3000 xg durante 3 min.
  2. Aspirar o sobrenadante.
  3. Ressuspender em plaquetas de 750 ul de ácido gelado a 10% tricloroacético (w / v).
  4. Adicionar padrão interno marcada com isótopo estável apropriado. Por exemplo, se o objectivo é comparar os níveis das espécies CoA entre amostras, utilizar 100 ul de uma mistura de tioésteres de CoA marcados obtidos a partir de levedura tal como descrito anteriormente com isótopo estável (técnica SILEC) 29.
  5. Pulso-sonicado de cada amostra 30 vezes com impulsos de 0,5 seg.
  6. Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  7. Apor colunas C18 de extracção em fase sólida (SPE) de tubagem de vácuo.
  8. Condicionar as colunas com 1 ml de metanol.
  9. Equilibrar as colunas com 1 ml DDH 2 O.
  10. Executar sobrenadante derivado de amostra (aproximadamente 850 ul neste caso) através das colunas.
  11. Lavar as colunas com água 1 ml.
  12. Carga de 10 ml tubos de centrífuga de vidro para o colector de vácuo para recolher fração de eluição.
  13. Elui-se as colunas com 1 ml de acetato de amónio 25 mM em metanol.
  14. eluato seco sob atmosfera de azoto.
  15. Ressuspender resíduos secos em 50 ul de 5% (w / v) de ácido 5-sulfossalicílico e transferir para frascos de HPLC.

Setup 5. HPLC

  1. Utilizando o software de controlo para o sistema de HPLC, criar um método de HPLC com as condições optimizadas para os analitos alvo e coluna utilizada, tal como listado na Tabela 1.
    Nota: A coluna temperature usado para a geração de dados foi de 25 ° C, mas os parâmetros específicos variará pelo aparelho e no que diz respeito aos compostos de interesse. Para quantificação de acil-CoA, vários métodos de análise de LC-MS foram relatados, e validado para diferentes analitos em diferentes condições de LC 14,19,20.
  2. Permitir que a HPLC para equilibrar de forma adequada.
    Nota: Isto deve incluir tanto iniciação de solventes antes de anexar uma coluna e equilibração da coluna nas condições iniciais para o método de solvente. O volume de equilíbrio deve seguir as instruções do fabricante, e de efluentes resultante deve ser desviado para o lixo.
    Nota: Consulte Basu e Blair 5 para obter mais detalhes sobre as configurações de HPLC.

Setup 6. Mass Spectrometer

  1. Utilizando o software de controlo para o espectrómetro de massa, criar um método para uma detecção de formas ionizadas dos compostos de interesse. Os parâmetros são apresentadosna Tabela 2.
    Nota: os análogos isótopo estável destes compostos devem ser utilizados para determinar se um modo positivo ou negativo dá sensibilidade superior e para optimizar a fonte óptica e condição para a sua detecção. O tempo total de detecção do método de espectrómetro de massa deverá corresponder ao componente de tempo do método de HPLC associados.
    Observação: Como mencionado anteriormente, vários métodos de análise de acil-CoA têm sido relatados, incluindo positivos 14 e negativos de ionização 15 e modos de uso de um espectrómetro de massa de alta resolução 17, em vez de um instrumento triplo quadrupolo 28.
  2. Limpo e calibrar o instrumento, estabelecer uma pulverização estável no espectrómetro, e permitir tempo para a solução de calibração para dissipar de forma adequada a partir da fonte e a óptica de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Configurar uma sequência para todas as amostras com o software de controle espectrômetro de massa. includes do nome ou identificadores numéricos e indicar o método de volume de injeção e instrumento adequado. Efectue um branco antes da primeira amostra, e executar outros espaços em branco e lavagens entre as amostras conforme necessário para mitigar reporte ou matriz efeitos.
    Nota: Um método de processamento para a integração de pico dos cromatogramas líquidos "analitos seleccionados muitas vezes pode ser definido dentro desta sequência ou posteriormente aplicado no processamento de dados.
  4. Iniciar a sequência e monitorar o sistema espectrômetro e HPLC em massa periodicamente para problemas, incluindo flutuações de pressão ou falhas do sistema e perda de intensidade do sinal durante a corrida.
    Nota: Problemas graves ou falhas de execução persistentes podem exigir parar a corrida e purga e re-equilibrar o sistema HPLC, bem como a limpeza e calibrar o espectrômetro de massa. Consulte Basu e Blair 5 para obter mais detalhes sobre as configurações e dados MS processamento.

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Resultados

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Para demonstrar a utilidade desta metodologia reproduzimos a generalização de adaptação metabólica compensatória descrito anteriormente resultantes da exposição a rotenona. Este achado foi identificado previamente em modelos de cultura de células e esta investigação teve como objetivo testar se essa mudança metabólica também ocorre em plaquetas, que são anuclear e não propenso aos mesmos artefatos experimentais como cultura de células. Este trabalho foi realizado com plaquetas 6 dias de ...

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Discussão

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Aqui temos demonstrado a utilidade de plaquetas isoladas como uma plataforma para o estudo do metabolismo mitocondrial perturbado. Especificamente, temos caracterizado adaptação metabólica em resposta à inibição do complexo I por rotenona.

O presente estudo se estendeu resultados reportados anteriormente sobre o papel da inibição do complexo I por rotenona em linhas celulares para plaquetas humanas. Importante, este revelou que a formação de rotenona também inibida de plaquetas succinil-CoA,...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos o apoio do NIH subvenções P30ES013508 e T32ES019851.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ReagenteCloreto de
Sódio (NaCl)Sigma-Aldrich746398
Bicarbonato de Sódio (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
Cloreto de Cálcio Di-hidratado (CaCl2 * H2O)Sigma-Aldrich223506
Cloreto de potássio (KCl)Sigma-AldrichP9541
Cloreto de magnésio (MgCl2)Sigma-Aldrich208337
GlicoseSigma-AldrichG8270
13C6-glicoseSigma-Aldrich389374
Ácido palmíticoCayman10006627
13C16-Ácido PalmíticoSigma-Aldrich605573
RotenonaSigma-AldrichR8875
Ácido TricloroacéticoSigma-AldrichT6399
Ácido 5-SulfosalicílicoSigma-Aldrich390275
AcetonitirleFischer ScientificA996-4(optima)
Água (H2O)Fischer ScientificW7-4(optima)
Ácido fórmicoFischer Scientific85171(optima)
DimetilsulfóxidoSigma-Aldrich472301
EtanolFischer Scientific04-355-222
MetanolFischer ScientificA454-4optima)
Acetato de AmônioFischer ScientificA639-500
Tubos Eppendorf de 2 ml FrascosLC BioExpressC-3229-1
(plástico)Tubosde Vidro Waters 186002640
10 mlColunas Kimble Chase73785-10
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) WatersWAT094225
Pastuer PipetsFischer Scientific13-678-200
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Equipamento
CO2 Incubadora com camisa de águaNuaireAutoFlow NU-8500
Espectrômetro de Massa Quadropole TriploThermo ScientificFinnigan TSQ Quantum
HPLCThermo ScientificDionex Ultimate 3000
FonteThermo ScientificHESI II
HPLC ColunaPhenomenexLuna C183 μ m tamanho de partícula, 200 mm x 2 mm
( de Centrífuga

Referências

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