Circulando MicroRNA Quantificação Usando DNA de ligação Dye Química e Gota Digital PCR

Summary

Um método sensível e preciso para quantificação de microRNAs livres de células usando uma química baseada em corante e tecnologia de PCR digital de gotículas é descrito.

Abstract

Circulating (da isentos de células) microARNs (miARNs) são libertados a partir de células para a corrente sanguínea. A quantidade de microARNs específicos na circulação tem sido associada a um estado de doença e tem o potencial de ser utilizado como biomarcador da doença. Um método sensível e preciso para a circulação de microARN quantificação usando uma química à base de corantes e gota a tecnologia de PCR digital foi desenvolvido recentemente. Especificamente, utilizando Locked Nucleic Acid (LNA) à base de iniciadores específicos de miARN com um corante de ligação a ADN fluorescente verde num sistema de PCR compatível gota digital, é possível obter a quantificação absoluta de miARNs específicos. Aqui, nós descrevemos como realizar esta técnica para avaliar a quantidade de miARN em fluidos biológicos, tais como plasma e soro, é viável e eficaz.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) são liberados na circulação sanguínea por potencialmente todas as células do organismo, como consequência da liberação ativa ou processos necróticos e apoptóticos. MiRNAs livres de células foram detectados na corrente sanguínea como moléculas estáveis livres ou ligadas a lipoproteínas ou envoltas dentro de exossomos e microvesículas ^1-3. Acredita-se que funcionem como comunicadores célula a célula ⁴, e sua quantidade muda na presença de câncer, distúrbios cardíacos ou doenças autoimunes ^5-7. Sua quantificação precisa e reprodutível é a base para sua avaliação como biomarcadores de doenças. No entanto, por várias razões já descritas em outro ^{artigo 8,9}, a quantificação de miRNAs no soro ou plasma, bem como em outros fluidos corporais, pode ser muito desafiadora ^10,11. Recentemente, desenvolvemos um método para a quantificação absoluta de miRNAs circulantes, baseado em primers LNA específicos para miRNA e tecnologia de PCR digital de gotículas de corante de ligação ao DNA (ddPCR) ¹². Essa metodologia tem sido aplicada à validação de biomarcadores de câncer de mama miRNA ^13,14.

Após o particionamento de cada molécula de miRNA transcrita reversa dentro de uma gota do tamanho de um nanolitro, é possível contar o número de cópias de cada miRNA em cada amostra, basicamente contando o número de gotículas fluorescentes verdes e, portanto, positivas. Assim que ocorre uma reação de PCR, uma contagem positiva é alcançada, sem a necessidade de estabelecer uma curva padrão ou levar em consideração a eficiência da PCR no cálculo da quantidade alvo, como acontece com o RT-PCR quantitativo (RT-qPCR). Além disso, a ddPCR mostrou-se mais sensível e precisa do que a RT-qPCR na quantificação de miRNAs circulantes ¹⁵. Neste artigo apresentamos o protocolo detalhado desta metodologia, discutindo as etapas mais relevantes e considerando especificamente amostras clínicas de soro e plasma.

Protocol

Isolamento MicroRNA a partir de plasma ou soro

Nota: Plasma e preparação do soro é um passo importante na circulação de miRNA quantificação. Não há nenhum procedimento preferido para o plasma e preparação do soro. A única coisa importante a considerar é que todas as amostras de um mesmo experimento deve ser processado usando exatamente o mesmo fluxo de trabalho. Iniciar a partir de soro ou de plasma de 200 ul. O ARN total pode ser isolado a partir de soro ou plasma, utilizando kits disponíveis comercialmente.

1. Protocolo para RNA total (incluindo miRNA) Isolamento

1. As amostras de soro / plasma descongelamento em gelo.
2. Adicionar 1 ml de Reagente de Lise (por ex., QIAzol) a 200 ul de soro / plasma.
3. Misturar em vortex e colocar o tubo contendo o homogeneizado no banco à TA durante 5 min.
4. Adicionar 3 ml de uma solução 4,16 nM de miARN CEL-miR-39-3p sintético de C. elegans.
5. Adicionar 200 ul de clorofórmio. Agitar o tubo vigorosamente durante 15 sec. º lugare tubo no banco à TA, durante 2 min.
6. Centrifugar durante 15 minutos a 12000 xg, a 4 ° C para se obter a separação fases: a fase aquosa superior contém ARN.
7. Transferir a fase aquosa para um novo tubo, cerca de 700 ul, evitar a transferência de qualquer material interfase branca.
8. Adicionar 1 ml de etanol a 100% e misturar por inversão.
9. Pipeta-se 700 mL da amostra para uma coluna mini-rotação colocado em um tubo de recolha de 2 ml. Fechar a tampa e centrifugar a 12000 xg durante 15 seg. Descartar o fluxo de passagem.
10. Repita este passo usando a amostra restante.
11. Adicionar 700 mL de buffer ERP para o mini coluna de rotação, feche a tampa e centrifugar por 15 segundos a 12.000 xg para lavar a coluna. Descartar o fluxo de passagem.
12. Pipetar 500 ul de tampão de RPE para o mini coluna de centrifugação. Feche a tampa e centrifugar por 15 segundos a 12.000 rpm. Descartar o fluxo de passagem. Repita este passo novamente.
13. Centrifugar o mini coluna de centrifugação à velocidade máxima por 2 minutos para secar a coluna de spinmembrana a partir de etanol residual.
14. Transferir o mini coluna de centrifugação para um novo tubo de recolha de 1,5 ml e pipeta 35 ul de água isenta de RNase na membrana da coluna.
15. Centrifugar durante 1 minuto a 12000 xg para eluir o ARN.
16. Armazenar o ARN a -80 ° C.
    Nota: Uma vez que a concentração de RNA não pode ser determinada com precisão, use volumes fixos como uma medida para a quantidade de entrada.

2. MicroRNA Transcrição Reversa

1. Descongelar a transcrição reversa (RT) componentes de mistura de reagente de tampão de reacção: 5x, água isenta de nuclease. Misture suavemente, invertendo os tubos e colocar no gelo. Imediatamente antes da utilização, retire a mistura de enzimas do congelador e colocar no gelo. Spin down todos os reagentes.
2. Preparar a mistura de reagente de RT em gelo tal como descrito na Tabela 1. Preparar pelo menos 10% de mistura superior.
3. Misture a reacção por pipetagem, e, em seguida girar para baixo.
4. Incubar durante 60 min a 42 ° C.
5. Calor-inactivar a reverSE transcriptase durante 5 min a 95 ° C.
6. Imediatamente fria a 4 ° C.
7. Armazenar o cDNA a -20 ° C.

3. cDNA Diluição

1. Diluir a quantidade de modelo de cDNA necessária para as reações ddPCR planejadas em água livre de nuclease. Dilui-se a reacção de ADNc entre 1:50 e 1: 500 em água, dependente da abundância alvo miARN. Armazenar o ADNc diluída a -20 ° C. O cDNA diluído provou ser estável durante pelo menos 3 meses a -20 ° C.

4. gota Geração e PCR

Nota: A geração da gota deve ser realizada em 8 amostras de cada vez. Repetições técnicas não são necessárias, devido à elevada reprodutibilidade desta tecnologia ^12,15 .A Nenhum modelo de controlo (NTC) amostra deve ser executado em cada placa, e para cada condição ddPCR diferente.

1. Descongelar e equilibrar a mistura principal (por exemplo., EvaGreen Mix Master), microRNA conjunto de primers e cDNA à temperatura ambiente.
2. Misturar o th Mistura Principaloroughly invertendo o tubo várias vezes. Spin down todos os reagentes.
3. Preparar a mistura de ddPCR como descrito na Tabela 2. Quando várias reacções são realizadas ddPCR, preparar um ddPCR misturar-solução de trabalho. Preparar pelo menos 10% de mistura superior.
4. Uma vez montado, misturar cuidadosamente e girar a mistura ddPCR.
5. Pipetar 12 ul de ddPCR misturar em uma placa com 96 poços de PCR ou tubos PCR.
6. Adicionar 8 mL de modelo de cDNA diluído a cada tubo / poço.
7. Insira o cartucho gerador de gotículas no suporte.
8. Transferir 20 uL de cada amostra para os poços de amostra (linha do meio) do cartucho gerador de gota cuidadosamente, evitando bolhas de ar na parte inferior do poço.
9. Encha cada poço de petróleo (linha de fundo) com 70 l de óleo gerador de gota.
10. Gancho a junta sobre o suporte do cartucho e insira no gerador de gota.
11. Feche a tampa para iniciar a geração de gotículas de acordo com a pr do fabricanteotocol. Quando a geração de gota tenha terminado, abra a tampa, retire a junta descartável. Os poços superior do cartucho conter as gotículas.
12. Pipetar lenta e suavemente 40 ul do conteúdo dos oito poços de topo (as gotas) em uma única coluna de uma placa de 96 poços de PCR.
13. Selar a placa PCR com a folha imediatamente após a transferência de gotas para evitar a evaporação. Use selos perfuráveis ​​placa de folha que são compatíveis com as agulhas no leitor de gotícula.
14. Comece a ciclos térmicos (PCR) no prazo de 30 min de selagem da placa.
15. Execute o protocolo de ciclismo de acordo com a Tabela 3.

5. Gota Reading

1. Ligue o leitor de gota.
2. Mover a placa do termociclador para o leitor gota.
3. Colocar a placa de PCR de 96 poços contendo as gotículas de pós-PCR para a base de suporte da placa.
4. Coloque a parte superior de suporte da placa sobre a placa de PCR. Pressione firmemente ambos os guias de liberaçãopara baixo para fixar a placa de PCR no suporte.
5. Inicie o software do PC do sistema.
   1. Clique em Configurar para definir o experimento (quantificação absoluta), em seguida, clique em Executar para iniciar a leitura gota.
   2. Quando leitura gota está completa, clique em "Analisar" botão para abrir e analisar os dados.
   3. Use o enredo amplitude 2D no software de análise para selecionar as gotículas positivos (Lasso Tool) (Figura 1B).
   4. Use a guia Eventos para verificar o número de gotículas positivos e totais. Um número total de 18.000 - 21.000 gotículas é geralmente obtida com probeless ddPCR.
   5. Uma vez que as gotículas positivos são seleccionados, exportar os valores de concentração de miRNA usando a opção de exportação .csv a partir da guia Concentração.

Results

A quantidade absoluta de miARNs específicos por mililitro de plasma ou soro pode ser determinada utilizando um corante de ligação a ADN fluorescente verde e gota a tecnologia de PCR digital. A Figura 1 apresenta o processo de selecção do gotículas positivo, o qual determina a concentração final de miARN (cópias / ul ) na reacção de amplificação calculada pelo software de análise. A quantidade de cada um miARN no sangue é muito diferente, sendo algumas espécies de miARN m...

Discussion

miARNs circulantes estão presentes no sangue em concentrações extremamente baixas e a quantidade de ARN que pode ser extraída a partir de amostras de plasma e soro é baixa. Por esta razão, eles são difíceis de quantificar com outras técnicas tais como a sequenciação de ARN e micro-arranjo. Além disso, há uma falta generalizada de acordo com a normalização de dados e a presença de miARNs endógenos de "referência" no sangue. Neste contexto, uma tecnologia de PCR sensíveis, como digitais gota, capaz de contar o n...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit Mini miRNeasy	de 217004	Qiagen	para RNA total, incluindo miRNA, extração de soro/plasma
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p	Tecnologias Integradas de DNA	Sequência Personalizada	: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Kit universal de síntese de cDNA II, 8-64 rxns	Exiqon	203301	Kit para microRNA transcrição reversa
MicroRNA LNA PCR primer set	Exiqon	204000-206xxx e 2100000-21xxxxx	Primers para amplificação de miRNA dentro de gotículas
Gerador de gotículas QX200	BioRad	186-4002	Instrumento usado para leitura de gotículas
Leitor de gotículas QX200	BioRad	186-4003	Instrumento usado para geração de gotículas
Software QuantaSoft	BioRad	186-3007	Software para coleta e análise de dados
Seladora de placas PCR PX1	BioRad	181-4000	Seladora de placas
Cartuchos e juntas geradoras de gotículas DG8	BioRad	186-4008	Cartuchos usados para misturar amostra e óleo para gerar gotículas
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
Óleo gerador de gotículas QX200 para corante EvaGreen	BioRad	186-4005	Óleo para geração de gotículas