A ligação do anticorpo especificidade para Kappa (VK) Humanos (IgM) Anticorpos contendo Cadeia Luz: Acid polissiálico (PSA) Anexado a MACN como um estudo de caso

Resumo

Apresentamos um protocolo para identificar porções proteicas contendo antígenos para anticorpos IgM humanos e de camundongos com cadeias leves kappa (Vκ) específicas. Este protocolo não se limita aos anticorpos da classe IgM, mas se aplica a todos os isotipos de imunoglobulinas que visam seu antígeno com afinidade suficientemente alta durante as imunoprecipitações.

Resumo

Os anticorpos do isotipo IgM são frequentemente negligenciados como potenciais terapêuticos em ensaios em humanos, modelos animais de doenças humanas, bem como agentes de detecção em técnicas laboratoriais padrão. Em contraste, vários IgMs humanos demonstraram prova de eficácia em modelos de câncer e modelos de distúrbios do SNC, incluindo esclerose múltipla (EM) e esclerose lateral amiotrófica (ELA). As razões para sua falta de consideração incluem dificuldades para expressar, purificar e estabilizar anticorpos IgM, desafio para identificar antígenos (não proteicos), ligação de baixa afinidade e lacunas de conhecimento fundamentais na pesquisa de carboidratos e lipídios.

Este manuscrito usa HIgM12 como exemplo para fornecer um protocolo detalhado para detectar antígenos por Western blotting, imunoprecipitações e imunocitoquímica. O HIgM12 tem como alvo o ácido polissiálico (PSA) ligado à molécula de adesão de células neurais (NCAM). O tecido cerebral de camundongos pós-natais precoces de camundongos do tipo selvagem (WT) e NCAM knockout (KO) sem as três principais variantes de splice do sistema nervoso central (SNC) NCAM180, 140 e 120 foi usado para avaliar a importância do NCAM para a ligação ao HIgM12. A digestão enzimática adicional do tecido do SNC e das células do SNC cultivadas usando endoneuraminidases nos levou a identificar o PSA como o epítopo de ligação específico para HIgM12.

Introdução

Os anticorpos do isotipo IgM demonstram um grande potencial terapêutico para o tratamento de diversas doenças, incluindo o cancro e doenças do SNC ^1-7. O grupo Vollmers 'identificados numerosos anticorpos em doentes com cancro para utilização potencial como biomarcadores específicos de tumores ou terapêuticos activos que são capazes de matar células malignas, induzindo vias apoptóticas ^4,8,9. Curiosamente, todos os anticorpos identificados com potencial terapêutico são do isotipo IgM e pertencer ao grupo de "auto-anticorpos naturais" (bebidas não alcoólicas).

Do mesmo modo, o grupo de Rodriguez identificado rato e anticorpos humanos que estimulam a remielinização em lesões da medula espinhal de desmielinização cronicamente nos modelos de esclerose múltipla (EM). Idêntico a anticorpos com efeitos anti-cancro, todos os anticorpos de promover a remielinização são NAbs e do isotipo IgM ^1,6,7,10. Os antígenos precisas para IgM mais identificados ainda estão undetermined incluindo o anticorpo de promoção remielinização humana rHIgM22, atualmente em Fase I de ensaios clínicos para pacientes com EM ^11. Apesar dos repetidos esforços por especialistas no campo da pesquisa de lipídeos e carboidratos, tanto no ambiente acadêmico e em parceria com a indústria ^11, tenta identificar o antigénio de rHIgM22 não foram bem sucedidos. A falha de técnicas convencionais usadas para identificar antigénios de anticorpos IgG para o trabalho com anticorpos IgM identifica uma necessidade crítica de métodos específicos para refinar esses anticorpos que provavelmente de hidratos de carbono ou lípidos alvo antigénios.

O foco deste manuscrito é o anticorpo humano HIgM12 regenerativa e os procedimentos experimentais utilizados para identificar o seu antigénio. Anticorpo HIgM12 foi identificado a partir de pacientes com macroglobulinemia de Waldenstrom, estimula o crescimento de neurites in vitro e ^12-14 como alvo ácido polissiálico (PSA) ligado à molécula de adesão celular neural (PSA-NCAM) ^15,16. HIgM12 estende vida útil em um modelo de mouse ALS ¹⁷ e melhora o resultado funcional em vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) camundongos infectados. Especificamente, HIgM12 estimula a atividade motora horizontal e vertical espontânea em ratos e aumenta cronicamente desmielinização número de diâmetro pequeno e médio axônios da medula espinhal oito semanas após uma única dose baixa de intraperitoneal, injetado anticorpo ^18.

A molécula de adesão de células neurais (NCAM) é uma glicoproteína da imunoglobulina (Ig) superfamília expressa na superfície celular de neurónios, glia, no músculo esquelético, e células assassinas naturais ^19-25. Os três principais isoformas NCAM denominado NCAM180, NCAM140 e NCAM120, são variantes de splicing alternativo de um transcrito primário, que variam apenas em seu domínio citoplasmático. Dentro do sistema nervoso central, NCAM é a maior molécula polissialilados (> 95%) com homopolímeros de ácido longos, siálico carregados negativamente. polissiálico umcid com n> 10 é chamado de PSA, mas existem estruturas oligoméricas mais curtos, que também são biologicamente relevante. Outras proteínas expressas polissialilados no SNC são SynCAM1 ^26, neuropilina-2 (NRP-2) ^27,28 e uma subunidade do canal de sódio ^{de 25} (para revisão veja-se ^29).

Os métodos aqui descritos permitem a identificação de antigénio para imunoglobulinas humanas e de ratinho contendo (cadeias leves VκI, VκIII ou VκIV para anticorpos humanos e cadeias leves VκI para anticorpos de ratinho) específicos kapa (VK) cadeias leves independentemente do isotipo do anticorpo (por exemplo, IgG, IgM , IgA, IgD ou IgE). Esta limitação se baseia na utilização de proteína G agarose para imunoprecipita�es com anticorpos do isótipo IgM. As estratégias alternativas podem incluir as lectinas de ligação a manose e anticorpos IgG anti-IgM secundários ligados covalentemente a esferas de agarose, que pode alargar a aplicabilidade deste método a mais anticorpos IgM Including aqueles com cadeias leves lambda (λ) (ver discussão). Rácios de cadeias de soro luz IgM VK comparação com cadeias leves IgM λ derivados de indivíduos saudáveis ​​são 1,5: 1 ^30.

Com base na metodologia de cromatografia usado aqui para separar, enriquecer, e imunologicamente detectar certas moléculas ^31, todos os antigénios devem incluir, pelo menos, um domínio de proteína pequena. Epitopo de ligação específica do anticorpo pode estar dentro ou fora do domínio da proteína (por exemplo, glicoproteínas, lipoproteínas no). passos bioquímicos iniciais utilizados para identificar o antígeno específico para HIgM12, respectiva para diminuir a lista de potenciais candidatos, são os passos mais decisivos na esse método. Preparações específicas do tipo de célula e caracterizações baseadas na morfologia das células são descritos para células gliais, mas esta metodologia pode ser extrapolada para acomodar outros tipos de células dentro ou fora do SNC.

Existe uma urgenteprecisa para desenvolver novas ou modificadas técnicas aplicáveis ​​para o aumento do número de anticorpos IgM com potencial terapêutico em diferentes desordens humanas particularmente nos casos (a maioria dos antigénios da classe IgM), onde os alvos de anticorpos são estruturas de hidratos de carbono ou lípidos.

Protocolo

protocolos e procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde e aprovado pelas comissões da Clínica Mayo de cuidados de animais e uso institucional (Mayo IACUC número de protocolo # A51912).

1. Geral CNS preparação do tecido

1. Gerar MACN deficiente camundongos (KO) em C57 / BL6 fundo (gentilmente cedido pelo Dr. Lynn Landmesser, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio), ratos NCAM heterozigotos e irmãos de tipo selvagem (WT) (C57 / Bl6) cruzando os heterozigotos. Genotipagem de ratinhos KO MACN foi descrito anteriormente ^32-34 e não será explicado em mais pormenor.

Nota: Os passos 1,2-1,6 são opcionais.

2. Antes da cirurgia, administrar uma solução de pentobarbital (de Stock: 25 mg / ml; 50/100 ul de pentobarbital para os respectivos estágios adultos pós-natal precoce) através de injecção intraperitoneal (agulha de calibre 27 e 1 mlseringa).
3. Espera durante 2 minutos ou até que o animal atingiu um plano cirúrgico de anestesia. Administrar anestesia adicional conforme necessário, durante o curso de cada operação de manter um plano cirúrgico de anestesia. Use toe método pinch-resposta para determinar a profundidade da anestesia. Os animais devem ser responder antes de continuar.
4. Faça um 0.5 - 1 centímetro incisão lateral através do tegumento e da parede abdominal logo abaixo da caixa torácica. Cuidadosamente separar o fígado a partir do diafragma. Fazer uma pequena incisão no diafragma utilizando um curvos, tesoura sem corte. Continuar a incisão diafragma ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural.
5. Coloque curvas, tesoura sem corte ao longo de um lado da caixa torácica, deslocando cuidadosamente os pulmões, e fazer um corte através da caixa torácica até a clavícula. Faça um corte semelhante no lado contralateral. Elevação do esterno de distância, aparar cuidadosamente qualquer tecido ligando-o ao coração.
6. Realizar uma incisão ao animalDo átrio direito com íris tesouras para criar tão grande uma saída possível. Injecte lentamente 10 ml de salina tamponada com fosfato (PBS) no ventrículo esquerdo do animal (luz vermelha; taxa de fluxo: 1 ml / min) usando uma seringa de 10 mL, equipado com uma agulha de calibre 27. Não aumente a pressão de fluxo / PBS durante a perfusão para evitar a destruição do tecido.
7. Decapitar ratos neonatal usando uma tesoura cirúrgica.
8. Remover o cérebro, agarrando as órbitas com uma pinça e através da inserção de uma pequena tesoura na coluna vertebral. Corte o crânio para a frente ao nível do ouvido. Retire o crânio e colocar suavemente o cérebro para uma placa de Petri 60 milímetros preenchida com 10 ml de meio de dissecção gelado sobre gelo (Tabela 1). Colocar cada cérebro em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar imediatamente em gelo seco (-79 ° C).
9. Faça uma incisão na cerebelo e tronco cerebral a partir de cérebros congelados usando uma lâmina de barbear limpa no gelo. Trabalhar rapidamente para evitar o descongelamento do tecido.
10. Pesa-se océrebro congelado, colocado num tubo de 15 ml em gelo e adicionar tampão de lise arrefecido em gelo (ver Tabela 1) a uma concentração final de 150 ug de tecido cerebral por ul de tampão de lise. Repita para os restantes cerebra. Manter cérebros em gelo em todos os momentos para as etapas de 1,9 - 1,11.
11. Homogeneizar cérebros em tampão de lise por trituração através de uma pipeta de 1 ml de ponta (10 vezes) seguido por trituração através de uma seringa de 5 ml equipada com agulha de calibre 27 (10 vezes). Incubar lisados ​​cerebrais durante mais 30 minutos em gelo para permitir que a lise do tecido completo.
12. E remover o material de lípidos cerebrais detergentes insolúveis através de centrifugação de série (quatro rondas a 19.000 xg durante 10 min a 4 ° C). Rejeitar (branco) de mielina e de detritos celulares contendo sedimento mas reter o sobrenadante depois de cada passo de centrifugação. lisados ​​cérebro alíquotas e armazenar a -80 ºC.

2. imunoprecipitações Usando IgM Humano (HIgM12 e Isotype Controle IgM) como um "pull-down" Agente de Cerebral Os lisados ​​de WT e KO MACN

1. Proteína G agarose grânulo Preparação ^9,35,36
   1. Preparar 200 ml de tampão de IP, incluindo BSA (ver Tabela 1). Preparar mais 200 ml do mesmo tampão sem BSA IP.
   2. Por imunoprecipitação transferência de reacção 100 ul de Proteína G agarose suspensão usando uma pipeta de 200 uL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Não faça proteína vortex esferas L agarose! Adicionar 1 ml de tampão de PI (ver Quadro 1) a cada tubo. Misture Proteína G agarose e tampão IP manualmente através de inversão (cinco vezes).
   3. Lavar proteína G esferas de agarose quatro vezes por centrifugação numa centrifugadora de bancada (1000 x g, 2 min, 25 ° C). Tire sobrenadante utilizando uma pipeta de 200 uL, sem perturbar o sedimento de agarose. lavar Repita os passos 2.1.2 a 2.1.3 três vezes adicionais.
   4. Equilibrar proteína G de agarose em 1 ml de tampão IP adicionado de fresco sobre um rolo durante a noite a 4 ºC.
2. Antígeno-anticorpo-agarose L Formação de Complexos e detecção de antígeno no Western Blot
   1. Incubar 30 mg de tecido cerebral lisadas (~ 200 ul de lisado) em 1 ml de tampão IP gelada com 20 ug de anticorpo IgM (HIgM12) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml durante a noite num cilindro a 4 ºC.
   2. Girar proteína G de contas de agarose (passo 2.1.4) numa centrífuga de bancada durante 2 minutos a 1000 xg, 4 ° C. Descartar o sobrenadante utilizando uma pipeta de 200 uL, sem perturbar o sedimento de agarose. Adicionar a solução arrefecida anticorpo-cérebro lisado (a partir do passo 2.2.1) para a proteína G de agarose utilizando uma pipeta de 1 ml.
   3. Incubar a antígeno-anticorpo-proteína suspensão L agarose, durante 2 horas em um rolo a 4 ºC. Lavar o complexo anticorpo-antigénio ligado a agarose L através de centrifugação a 1000 xg durante 2 min, 4 ºC. Cuidadosamente descartar o sobrenadante sem perturbar o sedimento e adicionar 1 ml de tampão de PI gelado contendo BSA a 0,2%.
   4. Repetir o passo de lavagem mais uma vez usando tampão de PI gelado contendo BSA a 0,2% e duas vezes mais usando tampão IP gelada sem BSA.
   5. Girar complexo anticorpo-antigénio ligado a agarose L a 1000 xg durante 2 min, 4 ºC. Elimine o sobrenadante completamente primeiro, utilizando uma pipeta de 200 uL até ~ 50 ul de solução são deixados em cima da proteína G da pelota de agarose seguido de uma pipeta de 10 uL. Manter as amostras em gelo.
   6. Adicionar 40 ul de tampão de eluição de IP (ver Tabela 1) por 1,5 ml de tubos de microcentrífuga, dedo tubos súbito 6 vezes e de calor durante 5 minutos a 95 ºC. Coloque as amostras em gelo durante 2 min e girar para baixo durante 30 segundos a 13.000 xg, 4 ºC.
   7. Transferir o sobrenadante utilizando uma pipeta de 10 mL (~ 35 ul total) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml fresco, sem perturbar o sedimento. Confirmar ausência de esferas de Proteína G agarose por lavagem abaixo de uma pequena quantidade de amostra eluída a parede interna do tubo.
      Nota: "granular"proteína G agarose são claramente visíveis se estiver presente.
   8. Se esferas de proteína G agarose estão presentes, girar amostra por mais 30 segundos a 13.000 xg e transferir o sobrenadante para limpar o tubo. Repita o passo até que não haja contas de agarose são detectáveis.
   9. Carga de 10 - 20 ul de amostras eluídas por poço em gel de poliacrilamida-SDS num sistema de tampão Tris / glicina / SDS (ver Tabela 1).
      Nota: O uso de 7,5% ou 4 - 20% de geles de gradiente com um volume de carregamento de 50 uL por poço para a detecção de isoformas NCAM (dimensões em gel (W x L x espessura PSA-NCAM ou: 8,6 x 6,7 x 0,1 cm).
   10. Géis correm para ~ 1 hora a 100 V (1,74 V / cm ²⁾ na bancada. Resfriamento adicional não é necessário para este passo ^37,38.
   11. Proteínas de transferência de PVDF (fluoreto de polivinilideno) de membrana (dimensão de poro 0,45 um) durante 2,5 horas na câmara fria a 100 V (1,74 V / cm ²⁾ utilizando um tampão de transferência de frio (5-10 ° C) (ver Tabela 1).
   12. membranas bloco wom 10% (w / v) de leite em pó seco em PBS-T durante 1 h a 25 ºC num agitador orbital benchtop, lavar as membranas duas vezes durante 10 min com PBS-T e a sonda durante a noite com anticorpo primário em 5% de BSA em PBS T em um agitador orbital na câmara fria.
   13. Na manhã seguinte, as membranas de lavagem uma vez rapidamente com um excesso de PBS-T a 25 ºC (incluem tampa e do recipiente), seguido por 3 lavagens com PBS-T, durante 10 min cada, num agitador orbital (80 rpm) (todos os passos de lavagem são realizadas a 25 ºC).
   14. Adicionar anticorpo secundário (peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo anti-humano anti-IgM (por HIgM12) (diluição 1: 30000) em 5% de leite seco em pó em PBS-T durante 1 h a 25 ° C num agitador orbital (70 rpm ).
   15. membranas Lavar extensivamente uma vez rapidamente com um excesso de PBS-T a 25 ºC (incluem tampa e do recipiente), seguido por 3 lavagens com PBS-T, durante 10 min cada, num agitador orbital (80 rpm) (todos os passos de lavagem são realizadas a 25 ° C) .
   16. Misture 1 ml de chemiluminescen reforçada refrigeradosce HRP componente do substrato A (reforçada reagente luminol) com 1 ml do componente B (oxidantes reagente) (por mini-blot) a 25 ºC.
   17. Use uma pinça de plástico para transferir as membranas numa toalha de papel para remover o excesso de líquido (segurá-los nas próprias bordas). contentores secos com toalhas de papel e membranas colocar de volta na recipientes (um para cada membrana). Imediatamente adicionar 2 ml do substrato pré-misturado quimioluminescência aumentada HRP (composto A + B) (passo 2.2.16.) para cada membrana e incubar durante 2 min a 25 ° C num agitador orbital (90 rpm). Fazem membranas certeza são uniformemente umedecido pelo reagente quimiluminescência.
   18. Transferência de membranas em uma luva de plástico transparente e remover o excesso de bolhas de líquido e ar com toalhas de papel. Coloque membranas na manga de plástico em um cassete de filme e, eventualmente, fita da luva de plástico na cassete. Feche a cassete.
   19. Tome a fita, filme, temporizador e tesouras para a câmara escura. Cortar canto superior direito de cada film para fins de orientação, expor filmes (diferentes) para diferentes períodos de tempo (10 seg, 1 min, 10 min) e desenvolver filmes em um desenvolvedor de filme.

3. Endoneuraminidase-NF digestão de PSA Anexado a MACN ³⁹

1. Digest lisadas tecido cerebral a partir do dia pós-natal (P) 7 ratinhos WT e KO ratinhos P7 MACN (preparado a partir do passo de 1,12) durante 2 horas em gelo utilizando endoneuraminidase-NF (endo-NF), tal como ilustrado na Tabela 2 ^39.
2. Adicionar 5 uL de tampão de amostra de Laemmli 4x a cada tubo (1-6) do passo 3.1 (Tabela 2).
3. amostras de carga em um 4 - gel de poliacrilamida-SDS gradiente de 20% e repita os passos 2.2.10 para 2.2.19. membranas de sonda com HIgM12 (1 ug / ml), comercialmente disponível de anti-PSA mAb (clone 2-2B) (1 ug / ml) e anticorpo (controlo de carga) β-actina (1 ug / ml) em 5% de BSA em PBS -T.

4. Preparação de Rat e culturas Rato do SNC

1. Preparação de lamelas de vidro
   1. Ácido-lavagem lamelas de vidro de 25 mm em HCl 1 M a 50 - 60 ºC durante 4-16 horas num exaustor de fumos, utilizando um recipiente de vidro. Agitar lamelas, ocasionalmente, através de agitação suave.
   2. Lavar lamelas de vidro extensivamente em água destilada (3x). Certifique-se de lavar o ácido entre lamelas empilhados.
   3. Lavar lamelas em 100% de etanol e seca-los em parafilme em um capuz de cultura de células. Um dia antes da utilização, aquecer as lamelas de vidro durante 24 horas num recipiente de vidro com tampa a 100 ° C num forno.
   4. Coloque lamelas de vidro no prato de 6 poços e revestimento com 3 ml de 40 ug / ml de poli-D-lisina em água estéril durante 1 hora a 37 ºC.
   5. Lavar duas vezes com água estéril, secar completamente sob capuz de cultura de células e aplicar luz UV durante 20 min.
2. Preparação de Cultura de Tecidos de plástico para células do SNC
   1. Brasão frascos de cultura de tecido ² 60 mm placas de cultura de células ou 75 cm com 3ml ou 10 ml, respectivamente, de 40 ug / ml de poli-D-lisina em água estéril durante 1 hora a 37 ºC.
   2. Lavar duas vezes com água, secar completamente sob capuz de cultura de células e aplicar luz UV durante 20 min.
3. Rat misturado Glia Isolamento ⁴⁰
   1. Anestesiar ratos recém-nascidos no IACUC aprovados câmara de eutanásia roedor com fornecimento de gás CO ₂ (totalmente automatizada). Use toe método pinch-resposta para determinar a ausência de resposta do animal. Decapitar neonatal ratos Sprague Dawley (P0P1) (6 - 10 crias de cada vez).
   2. Remover o cérebro, agarrando as órbitas com uma pinça e através da inserção de uma pequena tesoura na coluna vertebral. Corte o crânio para a frente ao nível do ouvido. Retire o crânio e colocar suavemente o cérebro para uma placa de Petri 60 milímetros preenchida com 10 ml de meio de dissecção gelado em gelo (ver Tabela 1).
   3. Repita para os restantes crias de ratos (6 - 10 filhotes). Manter o tecido no gelo para as etapas 4.3.2 - 4.3.7.
   4. Divida o cérebro ao longo da linha mediana em dois hemisférios cerebrais e, posteriormente, cortado bulbos olfatórios, gânglios da base abaixo do córtex cerebral eo hipocampo com uma pinça Dumont. Colocar o córtex cerebral isolado numa placa de Petri limpa contendo dissecando meio em gelo.
   5. Tome um córtex. Retire as meninges com uma pinça com pontas finas sob um microscópio de dissecação.
   6. Repita com os córtices restantes. Coloque todos os córtices meninges-livres em uma placa de Petri limpa no gelo.
   7. Combine hemisférios corticais de todos os filhotes em um 60 mm placa de Petri e usar uma lâmina de barbear estéril para dado o tecido cerebral em 1 mm pedaços picados.
   8. Transferir o tecido cerebral picada usando uma pipeta de 10 ml para um frasco de vidro estéril, não revestido de 500 ml e adicionar 10 ml de meio de dissecção gelado por cérebro de rato. Agitar ligeiramente o frasco enquanto a adição de 1 ml de solução de tripsina em HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank) (5 mg / ml de tripsina) a 9 mL de HBSS por cérebro de rato. Adicionar 2% Do volume total de solução de DNase I (1 mg / ml) e 2% do volume total de solução de MgSO ₄ (3,82% MgSO ₄ em HBSS (w / v)) para a suspensão do tecido do cérebro e agite bem.
   9. Tripsinizar tecido sob agitação suave num agitador rotativo durante 30 min a 37 ºC. Certifique-se de peças de tecido são flutuação durante este passo e não sedimentar para o fundo. Aumentar a velocidade de rotação, se necessário.
   10. Adicionar soro fetal de bovino (FBS) a uma concentração final de 10% (v / v) e misturar por agitação do balão de 10 vezes durante 10 seg. Arrefecer suspensão de tecido em água com gelo durante 15 min. Redemoinho frasco suavemente cinco vezes a cada segundo min.
   11. Suavemente transferir a suspensão de tecido estéreis em tubos de 50 ml utilizando 25 ml ou 50 ml pipetas e centrifugar durante 5 minutos a 200 xg, 4 ° C.
   12. Descartar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o tecido do SNC digerido em 15 ml de meio de dissecção gelado suplementado com 5 ml de soro fetal bovino, 0,4 mL de solução de _MgSO4 (3,82%MgSO ₄ em HBSS) e 1,6 mL de ADNase I (1 mg / ml).
   13. suspensão de tecido dividido igualmente em dois tubos estéreis de 15 ml (~ 10 ml cada) e tritura-se lentamente, utilizando uma pipeta de 10 ml (10 vezes) até a suspensão torna-se turvo / leitoso. Manter as células em suspensão em gelo durante o processamento do tubo seguinte. Espera durante 3 min até restante digerido SNC tecidos sedimento no fundo do tubo. Transfira o sobrenadante para limpar tubo de 50 ml, sem perturbar a fração pellet.
   14. Opcionalmente, passar sobrenadantes turvos através de filtro de células 40 mícrons e combinar a suspensão única célula resultante em estéreis tubos de 50 ml em gelo.
   15. Girar pasta de células durante 5 minutos a 200 xg, 4 ºC.
   16. Com cuidado, remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de 10 ml até ~ 2 ml de meio de dissecação são deixadas no topo do sedimento celular.
   17. pellets de células filme dedo em tubos de 50 ml (~ 10 vezes). Adiciona-se lentamente 5 ml de meio de crescimento quente (ver Tabela 1) para a suspensão de células, enquanto suavementemão agitando o tubo.
   18. Opcionalmente, repita o passo DNase 4.3.12 para um 10 min adicionais sobre o gelo com uma solução de DNase I fresco e _MgSO4 -solution em caso de aglomerados de tecido visíveis ou aglomerados de DNA. tubo de redemoinho manualmente 5 vezes a cada segundo min.
   19. Placa de 50.000 células por lamela de vidro de 25 mm de uma poça de 400 ul de meio de crescimento numa placa de 6 poços e deixar que as células aderir durante 30 min numa incubadora de cultura celular (5% de CO _2, 37 ºC).
   20. Para confluente (no prazo de 24-48 horas após o plaqueamento) placas de cultura celular de 60 mm e 75 centímetros frascos de cultura de ² tecidos, chapa de 500.000 células (60 mm de prato) ou 2 milhões de células (75 cm ²⁾ frascos.
   21. Adicionar cuidadosamente 2 ml (por cavidade, 25 mm em lamelas de vidro de 6 poços prato), 3 ml (pratos de 60 mm) ou 10 ml (75 cm ² frascos) de meio de crescimento aquecido a cada poço. Incubar as células durante a noite e mudar meio completamente na manhã seguinte. Em seguida, mude médio em dias alternados (dia 3, dia 5, dia 7, etc.).
       Nãote: Rato culturas glia mista está pronto a ser usado para imunocitoquímica ou bioquímica 24-48 horas após o plaqueamento.
4. Culturas do mouse Mixed gliais
   1. Idêntica à dissecação de cérebros de ratos neonatais descritos nos pontos 4.3.1 a 4.3.6, decapitar neonatais ratos P0 WT e KO MACN com C57 / BL6 fundo, remover cérebros e colocá-los em meio de dissecação gelada (ver Tabela 1). Manter o tecido em gelo em todos os momentos.
   2. Divida o cérebro ao longo da linha mediana em dois hemisférios cerebrais e, posteriormente, cortado bulbos olfatórios, gânglios da base abaixo do córtex cerebral eo hipocampo com uma pinça Dumont. Colocar o córtex cerebral isolado numa placa de Petri limpa contendo HBSS em gelo.
   3. Tome um córtex. Retire as meninges com uma pinça com pontas finas sob um microscópio de dissecação. Repita com os córtices restantes. Coloque todos os córtices meninges-livres em uma placa de Petri limpa no gelo.
   4. Transferir hemisphe corticalres com uma pipeta a partir de cada ratinho em separado, estéreis tubos de 15 ml. Adicionar 1,2 ml de meio de dissecção gelado para cada cérebro e mecanicamente perturbar o tecido cerebral, pipetando-o 2 vezes para cima e para baixo usando uma pipeta de 1 ml de ponta.
   5. Adicionar 150 ul de solução de papaína (10 mg / ml em PBS), 100 ul de solução de DNase I (1 mg / ml em HBSS) e 50 uL _MgSO4 (3,82% em HBSS) para cada cérebro e misturar por um movimento súbito do dedo.
   6. Incubar a suspensão de cérebro por 30 min a 37 ºC em banho-maria e misture suspensões cerebrais a cada segundo minuto a estalar os dedos. Adicionar 1 ml de FBS por tubo, misturar e arrefecer a suspensão de tecido durante 10 minutos em gelo.
   7. Girar o tecido cerebral durante 4 minutos a 200 xg, 4 ° C e ressuspender o sedimento de tecido em 1 ml de tampão de dissecação gelada suplementada com 70 ul de ADNase solução de I (1 mg / ml em HBSS) e 30 uL _MgSO4 solução (3,82% em HBSS).
   8. Tritura-se o tecido cerebral usando um FBS-revestido 1 ml ponta da pipeta(~ 5 vezes) até que o sobrenadante torna-se turva. Passar o sobrenadante através de um filtro celular de 40 micron e transferir para um tubo limpo em gelo.
   9. Sedimentar as células gliais mistas através de centrifugação durante 5 minutos a 200 xg, 4 ° C. Aspirar o sobrenadante até ~ 100 ul de meio são deixadas no topo do sedimento celular. Ressuspender o pellet celular por dedos passar rapidamente (~ 5 vezes) e adicionar 1 ml de meio de crescimento do rato quente (ver Tabela 1).
   10. Opcionalmente, dissolver agregados celulares visíveis e células submetidas a lise / ADN precipitado por pipetagem suave da suspensão de células cima e para baixo (cinco vezes).
   11. rato placa de células gliais mistos sobre lamelas de vidro revestidas de PDL ou pratos de 60 mm conforme descrito nas etapas 4.3.19 - 4.3.21. Lave as células na manhã seguinte com meio de crescimento do rato quente e, posteriormente, a cada dois dias. Rato glia mista está pronto a ser usado para imunocitoquímica 48-72 horas após o plaqueamento.
5. Rat Microglia Isolamento
   1. Cultura rato misturadoas células da glia em 75 cm frascos de cultura de ² tecidos em meio de crescimento (ver Tabela 1) durante 10 dias. Agite fora agregados de células microgliais de culturas mistas de glia, num agitador de rotação dentro de uma incubadora de cultura celular (5% de _CO2, 37 ° C) a 140 rpm durante 1 h.
   2. Retirar o sobrenadante contendo a microglia a partir de culturas gliais mistas, passá-lo através de um filtro celular de 40 micra e manter a suspensão de células em tubos de 50 ml estéreis.
      Nota: As culturas microgliais são tipicamente> 95% de pureza após este passo, com poucos contaminantes OPCs e muito poucas astrócitos.
   3. Opcionalmente, substituir meio de crescimento em culturas glia mistos para futuras shake-offs microgliais. Normalmente executar várias shake-offs microgliais (uma vez por semana) a partir de culturas gliais mistos.
   4. Opcionalmente, para obter purezas superiores a 95% da placa 10 mL do sobrenadante contendo microglia (passo 4.5.2) por 100 mm de placas de Petri, e incubar numa incubadora de cultura de células durante 30 min a 37 ºC. Apenas microglIA vai anexar para placas de Petri, enquanto os astrócitos e OPCs permanecem no sobrenadante.
   5. Agitar suavemente placas de Petri no sentido horário e anti-horário (cinco vezes cada) na capa de cultura de células. Aspirar o meio de cultura celular completamente e substitua com 10 ml de meio de crescimento. Resultantes culturas microgliais são> 98% pura.
   6. microglia cultura durante 7 dias em DMEM suplementado com 1% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina.
6. Rat OPC / Isolamento oligodendrócitos
   1. Para obter culturas OPC altamente enriquecido sacudir células microgliais primeiro a partir de 10 dias de idade, culturas gliais mistas cultivadas em frascos de 75 cm ² num agitador de rotação dentro de uma incubadora de cultura celular (5% de _CO2, 37 ° C) a 140 rpm durante 1 h. Descarte microglia única contendo sobrenadante ou utilizar para experiências específicas de microgliais (veja o passo 5.5).
   2. Substitua o sobrenadante contendo microglial com meio de crescimento de 10 ml e sacudir culturas gliais mistos paraoutro 18 horas num agitador rotativo a 200 rpm (5% de CO _2, 37 ºC).
   3. Recolher o microglia- e sobrenadante contendo OPC de culturas glia mistas e passar através de um filtro de células 40-micron. Recolha a suspensão de células em tubos de 50 ml estéreis.
   4. Opcionalmente, substituir meio de crescimento em culturas glia mistos para futuras OPC shake-offs.
      Nota: OPCs continuam a proliferar em camadas alimentadoras astrocíticos e pode ser agitada de saída uma segunda e terceira vez (uma vez por semana), embora com rendimentos inferiores.
   5. Placa 10 ml da microglia- e OPC contendo sobrenadante em placas de Petri de 100 mm e incubar numa incubadora de cultura de células durante 30 min a 37 ºC. Microglia irá anexar as placas de Petri, enquanto OPCs e astrócitos permanecem no sobrenadante.
   6. Agitar suavemente placas de Petri no sentido horário e anti-horário (5 vezes cada) em uma capa de cultura de células. Retire apenas algumas placas de Petri em um momento da incubadora de cultura de células (microglia vai começar a retirada de Petpratos ri quando agitados vigorosamente em meio mais frio).
   7. Recolher e combinar o sobrenadante contendo OPC em tubos de 50 ml. Opcionalmente, adiciona meio de cultura para pratos de Petri para serem utilizados em experiências específicas da microglia.
   8. Opcionalmente, para aumentar ainda mais a pureza das culturas OPC repetir os passos 5.6.5 e 5.6.6 uma vez com pratos de Petri frescas para reduzir a extensão da microglia em preparações OPC.
   9. Spin down sobrenadante contendo OPC enriquecido em centrífuga durante 5 minutos a 250 xg, 4 ºC. Com cuidado, aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Deixar 3 ml de sobrenadante por cima do sedimento e comece a ressuspensão OPCs por um movimento súbito do dedo (10 vezes).
   10. Triturar suavemente aglomerados celulares OPC, utilizando uma pipeta de 10 ml (5 - 10 vezes).
   11. Contagem de células e a placa 50,000 OPCs por lamela de vidro de 25 mm (PDL-revestidos) de uma poça de meio de crescimento de 400 ul numa placa de 6 poços e deixar que as células aderir durante 30 min numa incubadora de cultura celular (5% de CO _2, 376; C). Com cuidado, adicionar 2 ml de meio de proliferação quente (ver Tabela 1) a cada poço. Para PDL-revestidas placas de cultura celular de 60 mm, placa 1 - 1500000 OPCs em 3 ml de meio de proliferação.
   12. Cuidadosamente substituir FBS contendo meio de proliferação com meio de proliferação fresco 3 horas após o plaqueamento os OPCs (certifique-se OPCs ligados corretamente e não desalojar durante a mudança médio). meio de permuta de cada segundo dia.
       Nota: as culturas de rato OPC preparados utilizando este protocolo são tipicamente 90% puro com microglia como o tipo celular contaminante principal, seguido por astrócitos.

5. imunocitoquímica, utilizando HIgM12 em células primárias da glia

1. Imunofluorescência-label tríplice com HIgM12, mAb anti-PSA, eo tipo celular marcadores específicos em células primárias da glia de WT e MACN KO Mice
   1. Sob condições de células vivas, a etiqueta 60% confluentes rato culturas mistas de glia de ratinhos WT e KO MACN cultivadas em PDL-revestido25 mm lamelas de vidro com HIgM12 (10 ug / ml) e mAb anti-PSA (clone 2-2B) (10 ug / ml) em PBS suplementado com FBS a 10% a 4 ºC durante 30 min.
   2. Lave as células três vezes durante 20 segundos cada com PBS arrefecido em gelo suplementado com FBS a 10% e fixar com 4% de paraformaldeído em PBS, pH 7,4 durante 15 min a 25 ºC.
   3. Lavar as células duas vezes fixas durante 1 min cada, com PBS suplementado com FBS a 10% e permeabilizar as células com 0,1% de Triton-X100 em PBS, pH 7,4 durante 2 min a 25 ºC. Lave as células duas vezes para 1 min e etiqueta com marcadores glial GFAP (astrócitos) ou IBA-1 (microglia) (1 ng / ml) em PBS suplementado com FBS 10% durante a noite a 4 ºC na câmara fria.
   4. Proceda com condições de imunofluorescência padrão, incluindo DAPI meio contendo ³¹ montagem.
      Nota: O uso de fluorescente etiquetado Fab ₂ fragmentos de anticorpos secundários para o homem (HIgM12) e do rato (mAb anti-PSA, clone 2 - 2B) IgM é fortemente recomendado.
   5. tome flimagens uorescent em 60X ou 100X. Use as mesmas configurações do instrumento para todas as imagens e processar imagens de forma idêntica.
2. Imunofluorescência de células tratadas com WT glia ENDO-NF HIgM12 utilizando como anticorpo primário
   1. Cultura WT do rato glia misturado cultivadas durante 3 dias em um Neurobasal suplementado com FBS a 10% e suplemento B27 (1:50) em PDL revestidas de lamelas de vidro de 25 mm. Adicionar ENDO-NF (30 ng / mL) ao meio de cultura de 1 ml e incubar durante a noite numa incubadora de cultura de células (37 ° C, 5% CO _2).
   2. células de etiquetas vivem no frio com HIgM12 e GFAP marcador astrocitário interna após fixação e permeabilização como descrito nos passos 5.1.1 a 5.1.5. Tome imagens fluorescentes em 60X ou 100X. Use as mesmas configurações do instrumento para todas as imagens e processar de forma idêntica.

Resultados

Esta secção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos através do estudo de PSA-antigénios específicos de IgM humanas no SNC. A utilização de anticorpos IgM humanos contendo cadeias específicas de luz a sequência Vk em configurações bioquímicas e por imunocitoquímica fluorescente é mostrado.

HIgM12 imunoprecipita o seu antigénio a partir de lisados ​​de cérebro cerebrais e actua como um (anticorpo primário) agente de detecção, em transferências de Western. Nem o anticorpo de controlo de isotipo ou L esferas de agarose imunoprecipitar um antigénio semelhante, o que demonstra a especificidade do puxar para baixo (Figura 1). As transferências de Western utilizando lisados ​​do SNC de ratinhos WT e KO MACN demonstrar a especificidade da ligação a HIgM12-MACN-PSA contendo (Figura 2A). A digestão enzimática de tecido do SNC de ratinhos WT usando ENDO-NF identifica PSA ligado a MACN como o epitopo de ligação específica para HIgM12 (Figura 2B). Utilizando o método descrito no presente documento, IBA-1-positivo de rato culturas microgliais de elevada pureza são obtidos (Figura 3). Comercialmente disponível anticorpo anti-PSA (clone 2-2B) não rotula da superfície celular ou piscinas PSA internas no fixadas e permeabilizadas células microgliais IBA-1-positivos por microscopia fluorescente. Consistente com a literatura publicado anteriormente, que relata nenhuma expressão na superfície celular de PSA-NCAM em microglia ^16,41 não HIgM12 não rotular antígenos de superfície celular em microglia de rato purificadas. Curiosamente, a rotulagem HIgM12 de resultados microglia fixadas e permeabilizadas em uma intracelular padrão perinuclear, que não se restringe a organelos específicos (figura 3). Os resultados estão em contraste com os resultados obtidos utilizando um anticorpo anti-IgG de PSA (clone 735) ^26, que tem como alvo o PSA-SynCAM em microglia no nível do Golgi ^41.

Em contraste com a microglia, HIgM12e antigénios de superfície de células alvo A2B5 em culturas de OPC de rato altamente enriquecidos sob condições de células vivas (Figura 4). Culturas OPC contêm ~ 5% contaminar as células microgliais. A Figura 5 ilustra um padrão praticamente idêntico na superfície celular de coloração entre HIgM12 e anti-PSA mAb (clone 2-2B) em astrócitos GFAP-positivos (Figura 5A). Rotulagem de imunofluorescência de astrócitos WT ENDO-NF-digeridos em comparação com tampão astrócitos WT tratados de controle usando HIgM12 demonstra a presença de PSA astrócitos (Figura 5B). A presença de astrócitos PSA-positiva in vivo ainda não foi confirmada.

Figura 1: HIgM12 age como um "pull-down" Agente em imunoprecipitações imunoprecipitações de lisado total do cérebro de ratos de três meses de idade usando HIgM12, controle de isotipo humano HIGM.grânulos de 126 ou de agarose G apenas como "puxar para baixo" agentes. proteínas eluídas foram executados em Western blot com membranas sondadas contra HIgM12. Os pesos moleculares das proteínas eluidas a partir de grânulos revestidos foram HIgM12 na gama de 160-200 kDa, para além da cadeia pesada de IgM (~ 65-73 kDa). Este valor foi modificado de J. Neurochem. ^15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: HIgM12 Metas do ácido polissiálico (PSA) Porção de MACN. A. homogeneizados de cérebro de P7, P13, P16 e P27 MACN total de KO e controles ninhada heterozigotos foram executados em Western blot com membranas sondadas contra HIgM12, PSA e β-actina como controlo de carga. J. Neurochem. ^15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: a ausência de PSA no Rat Microglia é espelhada por uma falta de HIgM12 Labeling microglia rato foram cultivadas durante 48 horas na revestidas com poli-D-lisina lamínulas de vidro e ou rotulados ao vivo no gelo com HIgM12 ou após fixação com HIgM12 ou anti. -PSA mAb (clone 2-2B). As células foram triple marcado com microglia marcador IBA-1 (verde), HIgM12 / PSA (vermelho) e DAPI (azul). Imagens mostram falta de superfície de células microgliais ligação usando HIgM12 (linha superior) e falta de anti-PSA de ligação (clone 2-2B) à superfície da célula e lojas internas no microglia rato primário (linha inferior). Com base na morfologia bipolar e ausência de IBA-1 coloração, a pequena célula de PSA-positivas (fila inferior) foi sugerida para ser uma OPC. Em células fixas, HIgM12 coloração resultou em um padrão punctated, perinuclear que não se restringiu à organelas específicas e foi considerado ligação não específica (linha do meio). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: HIgM12 alvos celulares de superfície PSA-NCAM em Rat OPCs OPCs rato e microglia foram cultu.vermelho por 4 dias em meio de proliferação em lamelas de vidro revestidas com poli-D lisina e triplos marcados ao vivo no gelo com HIgM12 ou A2B5 (verde), interna macrófagos / monócitos marcador CD68 (clone ED-1) (vermelho) e DAPI (azul) . Imagens mostram populações de células majoritariamente positivo para A2B5 OPC marcador (linha superior) e HIgM12 (linha inferior) com poucas microglia CD68-positivos (~ 5%). Contraste de fase e imagens DAPI foram adicionados para revelar a integridade celular e os números de celulares para cada população. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: HIgM12 e mAb anti-PSA co-rotular um subpopulação astrocitária mouse Mixed Glia. A. mouse células gliais mistas de WT e MACN total de animais KO contendo astrócitos, células oligodendrócitos-linhagem e microglia foram cultivadas durante 3 dias e rotulados ao vivo no gelo com HIgM12 (verde), anti-PSA mAb (clone 2-2B) (vermelho) e, posteriormente, para astrocitário marcador GFAP (roxo) e DAPI (azul). HIgM12 e anti-PSA revelam um padrão de coloração idêntica virtual em astrócitos WT GFAP-positivos, mas a falta de ligação para astrócitos em cultura de ratos MACN KO. Este valor foi modificado de J. Neurochem. ^15. B. glia misturadas foram cultivadas de forma idêntica tal como descrito em A. e tratadas durante a noite com endoneuraminidase-NF (gentilmente fornecida pelo Dr. Martina Muehlenhoff) ou controlo de PBS. As células foram marcadas ao vivo no gelo com HIgM12 (verde) e posteriormente coradas para marcadores GFAP interno (vermelho) e DAPI (azul). HIgM12 alvo antígenos de superfície celular em PBS-controlo tratado culturas gliais mistos, mas não endoneuraminidase-NF tratados glia mista. Este valor foi modificado a partir JNSCI ^16. Plfacilitar clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Todas as imagens foram tomadas em 60X de ampliação usando as mesmas configurações do instrumento e processados ​​de forma idêntica.

Tabela 1:. Tampão e Solução Receitas Por favor clique aqui para baixar esta tabela.

	tecido do SNC	ENDO-NF / PBS	O tampão de lise	Volume total
1. rato WT	67 ^ g (0,45 ul)	2 ul (12 ug) ENDO-NF	7,55 mL	10 ul
2. rato WT	67 ^ g (0,45 ul)	2 ul de PBS	7,55 mL	10 ul
3. rato WT	67 ^ g (0,45 ul)	nenhum PBS ou ENDO-NF	9,55 mL	10 ul
4. MACN KO rato	67 ^ g (0,45 ul)	2 ul (12 ug) ENDO-NF	7,55 mL	10 ul
5. MACN KO rato	67 ^ g (0,45 ul)	2 ul de PBS	7,55 mL	10 ul
6. MACN KO rato	67 ^ g (0,45 ul)	nenhum PBS ou ENDO-NF	9,55 mL	10 ul

Tabela 2: Endo-NF digestão de tecido do SNC de ratinhos P7 WT e KO MACN.

Discussão

Auto-anticorpos IgM naturais humanos são candidatos atraentes para imunoterapias e demonstraram o potencial terapêutico para o tratamento de diversas doenças, incluindo o cancro e doenças do SNC ^1-7. Vantajosamente, estes anticorpos não vai eliciar uma resposta imunitária em que a geração de anticorpos neutralizantes reduz substancialmente a dose terapêutica eficaz e eficácia. Mais importante, todos os anticorpos com potencial terapêutico foram do isotipo IgM e pertencem ao repertório NAB ^{3-5,8,9,37,40,42-45.} Um obstáculo principal para a potencial aplicação clínica de anticorpos IgM é a identificação dos seus antigénios, que são indeterminado em muitos casos. As técnicas padrão empregadas para anticorpos IgG muitas vezes não são aplicáveis ​​para identificar o antigénio de uma IgM.

Este protocolo descreve a identificação de PSA-NCAM como o antigénio para o anticorpo IgM humano regenerativa HIgM12, eficazes em modelos animaisde MS e ALS ^15-18. A metodologia utilizada é principalmente aplicável a todos os anticorpos humanos com cadeias leves sequência Vk específicos VκI, VκIII e VκIV e anticorpos de ratinho com cadeias leves VκI, independentemente do isotipo do anticorpo.

O passo mais importante neste protocolo é a utilização de anticorpos IgM em aplicações de cromatografia de afinidade. Mais especificamente, os anticorpos bem sucedidos são obrigados a actuar como agentes suspensos em imunoprecipitações para isolar ou para enriquecer um antigénio de complexos para tecidos ou de células de cultura de lisados. As fracções enriquecidas de antigénios pode ser comparado com as imunoprecipitações de anticorpos de controlo de isotipo e subsequentemente analisados ​​por diferenças por espectrometria de massa. Um requisito essencial ou limitação deste passo é a presença do anticorpo correcta sequência Vk de cadeia leve e hospedeiro (humano, rato) para permitir a ligação à proteína G de agarose anticorpo. Utilização de proteínas de ligação a manana ligada a agarose (também callelectina de ligação a manose d) em vez da proteína G de agarose é uma alternativa potencial para imunoprecipitar IgM específicas sem cadeias leves sequência Vk. No entanto, como indicado por Arnold et al. ^35, os anticorpos IgM ligado ao antigénio não se ligam à proteína de ligação a manana, como os glicano alvo parecem tornar-se inacessível uma vez que o IgM tem ligado ao seu antigénio. Com base nestes resultados de ligação a manana proteína não pode ser usado como uma matriz de ligação para imunoprecipitar IgM carregadas com antigénio, as moléculas ^35. Outras alternativas potenciais pode ser o uso de anticorpos ligados a agarose secundárias IgM anti-IgG ^46,47 ou utilização de esferas magnéticas activadas de superfície ^48. anticorpos dirigidos contra IgG IgM pode ser quimicamente reticulado a agarose A ou G agarose a fim de reduzir o grau de anticorpo eluído juntamente com o antigénio de interesse. Uma comparação adequada entre as diferentes variantes de IgM imunoprecipitação com respeito aos antigénios identificados com sucesso ié difícil porque a maioria imunoprecipita�es foram realizados para isolar ou empobrecem IgM sem mais interesse em seus antígenos. Além disso, imunoprecipita�es usando IgM foram usados ​​principalmente para confirmar um antígeno único já conhecidos ou esperados com a exposição anticorpo para antigénios purificados ^49. Uma desvantagem das IgG acoplado a agarose dirigido contra IgM humano é um rendimento muito baixo (10 - 15%) das moléculas de IgM séricos imunoprecipitado quando comparado ao material de partida ^50. Em contraste, esferas magnéticas activadas de superfície foram aplicadas com sucesso para anticorpos de diferentes isotipos, incluindo IgM para imunoprecipitar fibrilas associadas à scrapie ^48. Este método não se restringe a kappa específica (VK) ou cadeias lambda (λ) ou de um hospedeiro particular e pode alargar substancialmente o espectro de anticorpos IgM utilizadas em imunoprecipitações.

Outro passo importante no protocolo é a capacidade do anticorpo para funcionar como um detecting anticorpo (anticorpo primário) em Western blots ou outras plataformas de rastreio. anticorpos de sucesso deve ter como alvo o seu antigénio com afinidade suficientemente elevada para permitir a ligação do antigénio na presença de detergentes não-iónicos ou iónicos, possivelmente. anticorpos de elevada afinidade são comuns entre anticorpos IgG maturados por afinidade, mas menos comum entre os anticorpos do isótipo IgM, o que é uma das razões pelas quais há relativamente poucos anticorpos IgM disponíveis comercialmente como agentes de detecção em configurações bioquímicos. ligação de anticorpos de alta afinidade é uma exigência para imunoprecipi tacões de antigénios moleculares e por Western blotting. Redução das concentrações de detergente ou a completa ausência de detergentes em buffers IP e tampões de lise permite antigénio alvo por anticorpos de baixa afinidade, através do seu domínio Fab. Em contraste, a capacidade do anticorpo para a proteína alvo G agarose através da sua porção Fe não é substancialmente afectada entre os controlos de isotipo longo de uma gama de diferentes detergentes concentrações. No entanto, a baixa concentração de detergente no tampão de lise e tampão IP impede ruptura da membrana celular e o isolamento de moléculas específicas. Da mesma forma, uma baixa concentração de detergente de lavagem em tampões de Western blot (por exemplo, PBS-T) permite a ligação de anticorpos de baixa afinidade antigénio, mas ao mesmo tempo aumenta a ligação não específica e, portanto, não é uma opção.

A presença de uma proteína de antigénio núcleo é outro requisito para este método. Proteínas com modificações pós-tradução (por exemplo, glicoproteínas, lipoproteínas) e as proteínas não modificadas, mas não únicos lípidos ou hidratos de carbono, são detectáveis ​​em transferências de Western. Não é possível imunoprecipitar lípidos (por exemplo, esfingolípidos) a partir de lisados ​​celulares ou de tecidos, na presença ou na ausência de detergentes. As propriedades físico-químicas dos lípidos e detergentes são muito semelhantes para permitir interacções selectivas lipídicas-anticorpo, enquanto que ao mesmo tempo detergentes são essenciais para interrompermembranas a fim de permitir o isolamento selectivo de moléculas específicas. Para o nosso melhor conhecimento, imunoprecipitações exclusivamente constituídas por hidrato de carbono, na ausência de um núcleo proteico, não foram relatados na literatura. Isto torna-se particularmente relevante porque os anticorpos IgM frequentemente alvo carboidratos e glycolipids, que não estão necessariamente ligados a uma unidade de proteína. Outras técnicas cromatográficas são necessários para a separação e identificação imunológica de lípidos e hidratos de carbono na ausência de um núcleo proteico. Por exemplo, cromatografia de camada fina (TLC) dos lípidos celulares, com detecção subsequente anticorpo na placa de TLC (imuno-TLC) pode ser implementado ^51,52.

Outros anticorpos anti-PSA foram descritos em estudos anteriores e os resultados são comparados com HIgM12, bem como a IgM anti-PSA comercialmente disponível (clone 2-2B). O anticorpo mais vulgarmente utilizados no campo de PSA é um anticorpo de IgG (o clone 735) disponível como monoc ratolonal ou anticorpo policlonal de coelho ^53. Este anticorpo anti-PSA de PSA detecta IgG em SynCAM e NCAM em diferentes tipos de células do SNC, incluindo as células microgliais ^41. Em contraste com o anticorpo anti-PSA de IgG, os anticorpos IgM humanos HIgM12, HIgM42 e o anti-PSA IgM de ratinho (clone 2-2B) são incapazes de atingir PSA em SynCAM (mas em MACN) em vários estágios embrionários e pós-natais precoces em ratinhos , enquanto SynCAM não polissialilados é facilmente detectável ^15. Os anticorpos IgM utilizadas também não são capazes de detectar PSA em células microgliais (Figuras 3 + 4). Uma possível explicação para as diferenças observadas entre os isotipos de anticorpos podem ser baixos níveis de PSA-SynCAM em comparação com os níveis de PSA-NCAM combinados com o potencial mais baixo de ligação de anticorpos de IgM em comparação com a IgG anti-PSA afinidade. Para testar essa hipótese, realizamos imunoprecipita�es em animais MACN KO em fase embrionária E17 com vastas quantidades de SynCAM presente e usado HIgM12 como um "agente de pull-down" ^{15. Em E17 WT da mesma ninhada controla HIgM12 imunoprecipitada PSA-NCAM de uma forma que mostrou intensidades semelhantes de "puxado para baixo" de PSA-NCAM em comparação com a cadeia pesada de IgM, conforme detectado por densitometria de Western blot subsequente utilizando antigénios eluídos. Este resultado sugeriu que pelo menos uma afinidade suficiente para a sua HIgM12 de PSA alvo. Em contraste com a da mesma ninhada WT controla HIgM12 não detectar PSA ligado a MACN SynCAM em animais KO. Resultados idênticos foram obtidos em imunoprecipitações com o anticorpo anti-PSA HIgM42 IgM. HIgM12 e HIgM42, bem como a de ratinho anti-PSA IgM (clone 2-2B) foram incapazes de atingir PSA em SynCAM em transferências de Western de animais WT e KO NCAM em estágios embrionários e pós-natais. Dada a baixa quantidade de HIgM12 requerido (0,1 ug / ml) para detectar especificamente PSA ligado a MACN, em transferências de Western, utilizando pequenas quantidades de tecido do SNC (0,1 ug tecido do SNC por poço) 15 parece ser pouco provável que as baixas afinidades são sozinhoresponsável pela completa falta de detecção de PSA-SynCAM por HIgM12 em três métodos diferentes.}

Conclui-se que existem diferenças significativas entre os anticorpos IgM-PSA anti e o anticorpo anti-PSA IgG frequentemente publicados (clone 735). Não está claro por que os anticorpos anti-PSA IgM comercialmente disponíveis não foram utilizados com mais frequência no passado para confirmar os resultados obtidos com antiPSA IgG anticorpo 735. Isto é particularmente interessante porque HIgM12 já provou eficácia em diferentes modelos de doenças. Enquanto outros anticorpos anti-PSA IgM podem ter efeitos terapêuticos semelhantes não fica claro se o anticorpo PSA anti-IgG (clone 735) tem um resultado terapêutico semelhante em modelos de MS e ALS.

Em resumo, os métodos descritos aqui foram utilizados principalmente para identificar o antigénio dos anticorpos humanos HIgM12 regenerativas para suportar ensaios clínicos potenciais para MS e, possivelmente, de outras doenças neurodegenerativas. A identificação de formigaIrgens para anticorpos com atividade biológica é um passo essencial para compreender o seu mecanismo de acção. Isto torna-se particularmente relevante no contexto de numerosos anticorpos monoclonais actualmente a ser testados para a segurança e eficácia em humanos ensaios. Embora o número de anticorpos IgM clinicamente testados até à data é pequeno, os recentes avanços na tecnologia de hibridoma, juntamente com um número crescente de estudos que destacam o potencial terapêutico desta classe de anticorpos ^{1-10,37,40,42-45} insta o desenvolvimento de novos ou métodos modificados aplicável para identificar não-protéicos antigénios IgM.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Fisher Scientific	MT-10-013-CVRF	Alta glicose, com glutamina, com piruvato de sódio, 500 ml
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml, L-glutamina, piruvato de sódio, alta glicose
Penicilina-Estreptomicina	Life Technologies	15140-122	10.000 U/ml, 100 ml
N-2 Suplemento (100x)	Life Technologies	17502-048	5 ml
B-27 Suplemento (50x)	Life Technologies	17504-044	sem soro, 10 ml
Soro Fetal Bovino - Optima	Atlanta Biologicals	S12450	500 ml
Água estéril para irrigação	Baxter Healthcare	#2F7114	USP-1.000 ml, 12/CA
Clomidrato de poli-D-lisina	Sigma	P7886-50MG	D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Peso Molecular 30.000-70.000 g/mol, 50 mg
fração de albumina de soro bovino V	Sigma	A-3294-100G	fração de choque térmico, livre de protease, pH 7,  pureza 98%, 100 g
D-(+)-Glicose	Sigma	G5767-500G	C6H12O6, Peso molecular: 180,16 g/mol, reagente ACS, 500 g
de tripsina do pâncreas bovino	Sigma	T9935-100mg	essencialmente sem sal, pó liofilizado, 9.000 unidades BAEE/mg de proteína
Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino	Sigma	D5025-150KU	Tipo IV, pó liofilizado, 2.000 unidades Kunitz/mg de proteína
Proteína básica Recombinante de rato FGF R	& D systems	3339-FB-025	BSA como proteína transportadora, 25 µ g, liofilizado, > 95%, 16,2 kDa
Proteína PDGF-AA Recombinante de Rato	R& D systems	1055-AA-50	sem transportadora, 50 µ g, liofilizado, > 97%, derivado de E. coli, 12,5
kDa Neurobasal-A	Life Technologies	10888-022	500 ml, Sem Glutamina, Sem Ácido Aspártico, Sem Ácido Glutâmico
Paraformaldeído	Sigma	P6148-1KG	cristalino, 1 kg, grau de reagente, Peso Molecular 30,03 g/mol (como monômero)
Tris[hidroximetil]aminometano (Tris bas	Biorad	1610719	1 kg, 99,8% puro, pó
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)	Biorad	#1610302	1 kg, pó
Glicina	Fisher Scientific	BP-381-5	C2H5NO2, Peso molecular: 75,07 g/mol, Pó cristalino branco, 5 kg
Cloreto de sódio	Sigma	S7653-5KG	NaCl, Peso molecular: 58,44 g/mol, 5 kg
de fosfato de sódio monobásico	Sigma	S0751-500G	NaH2PO4, Peso molecular: 119,98 g/mol, 500 g
Solução tamponada com fosfato 1x (PBS)	Cellgro	MT-21-040-CV	sem cálcio e magnésio, 6 x 500 ml
Falcon 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish	Corning Life Sciences	#353002	Placa de Cultura de Células de 60 mm, poliestireno tratado com TC, 20/pacote, placa de
Petri Falcon estéril de 60 mm x 15 mm	Corning Life Sciences	#351007	Não Placa de Petri Bacteriológica Não Tratada com TC, 20/Pacote
Placas de cultura de células de 6 poços	Corning Costar	CLS3516	6 poços, fundo plano (Embalado individualmente), irradiado com raios gama, área de crescimento 9.5 c
75 cm² frasco de cultura de tecidos	Corning Life Sciences	430720U	75 cm² Cantil de Cultura de Células em Forma de U com Tampa de Vedação de Plugue
Pierce™ Proteína L Plus Agarose	ThermoFisher Scientific	#20520	2 ml, reticulado 6% agarose frisada (CL-6B), capacidade de ligação: 10 a 20 mg IgG
4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Gel Pré-moldado	Biorad	456-1094	10-poço, 50 µ l, para uso com células de eletroforese Mini-PROTEAN
Membrana Immobilon-P	Millipore	IPVH00010	PVDF, 0,45 µ m, rolo de 26,5 cm x 3,75 m
Anticorpo antiácido polissiálico-NCAM, clone	Millipore	MAB5324	50 microlitros, Hospedeiro: camundongo, monoclonal IgM
4x Laemmli Tampão de amostra	Biorad	#1610747	10 ml, 4x tampão de amostra de proteína pré-misturada
2-mercaptoetanol	Biorad	#1610710	25 ml, 98% puro, 14,2 M
Endoneuraminidase-N (Endo-N)	ABC Scientific	ABC0020	50 microlitros, 200 e micro; g/ml, 3.500 U/mg
Lamínulas de vidro de 25 mm	Fisher Scientific	12-545-102	Círculos nº 1; Espessura: 0,13 a 0,17 mm; Tamanho: solução
tampão HEPES	ThermoFisher Scientific	15630-080	100 ml, 1 M
Hanks' Solução salina balanceada 1x (HBSS)	Cellgro	MT-21-022-CV	500 ml, sem cálcio, magnésio, fenol vermelho
Papaína	Worthington Cooperação	bioquímica LS003119	pó liofilizado, 100 mg
de sulfato de magnésio	Sigma	M-2643-500G	pó, 500 g
L-Glutamina	Gibco	#25030-081	100 ml, 200 mM