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Artigo de método

Imitando a Função de Proteínas de Sinalização: Toward Artificial Signal Therapy Transdução

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⸱

DOI:

10.3791/54396

⸱

29 de setembro de 2016

 ,  , 
1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

Neste artigo

Resumo

Apresentamos diretrizes para o desenvolvimento de 'transdutores químicos' sintéticos que podem induzir a comunicação entre proteínas naturalmente não relacionadas. Além disso, são apresentados protocolos detalhados para sintetizar e testar um 'transdutor' específico que permite que um fator de crescimento ative uma enzima desintoxicante e, consequentemente, regule a clivagem de um pró-fármaco anticâncer.

Resumo

As vias de transdução de sinal, que controlam a resposta das células a vários sinais ambientais, são mediadas pela função de proteínas sinalizadoras que interagem entre si e se ativam umas às outras com alta especificidade. Agentes sintéticos que imitam a função dessas proteínas podem, portanto, ser usados para gerar etapas de transdução de sinal não naturais e, consequentemente, alterar a função da célula. Apresentamos diretrizes para projetar 'transdutores químicos' que podem induzir a comunicação artificial entre proteínas nativas. Além disso, apresentamos protocolos detalhados para sintetizar e testar um 'transdutor' específico, que pode induzir a comunicação entre duas proteínas não relacionadas: fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e glutationa-S-transferase (GST). A maneira pela qual essa comunicação PDGF-GST não natural poderia ser usada para controlar a clivagem de um pró-fármaco anticâncer também é apresentada, indicando o potencial para o uso de tais sistemas em 'terapia de transdução de sinal artificial'. Este trabalho tem como objetivo facilitar o desenvolvimento de 'transdutores' adicionais desta classe, que podem ser usados para mediar a comunicação proteína-proteína intracelular e, consequentemente, para induzir vias de sinalização celular artificial.

Introdução

Vias de transdução de sinal de desempenhar um papel significativo em virtualmente todos os processos celulares e permitir que a célula para responder rapidamente aos sinais ambientais. 1 Estas vias são frequentemente desencadeada pela ligação de uma molécula de sinalização a um receptor extracelular, o que resulta na activação de enzimas intracelulares. A amplificação e a propagação deste sinal dentro da célula é mediada pela função de sinalização de proteínas que formam uma rede de interacções proteína-proteína, em que as enzimas são activadas de forma reversível com alta especificidade. Porque desregulação destas redes freqüentemente leva ao desenvolvimento do câncer, tem havido muito interesse no estabelecimento de "terapia de transdução de sinal do câncer ', 2 em que as drogas são projetados para interromper vias de sinalização malignas. Propusemos recentemente uma abordagem alternativa terapia para assinalar a transdução que se baseia na capacidade das drogas para gerar vias de transdução de sinal não naturais. 3 em particular, acreditamos que através da concepção de agentes sintéticos que mimetizam a função das proteínas de sinalização, seria possível modular a função da célula indirectamente. Por exemplo, estas redes artificiais podem activar proteínas biomarcadores para activar enzimas que clivam pró-fármacos. Alternativamente, estes miméticos de proteínas de sinalização pode ser capaz de activar as vias de sinalização de células não-naturais, o que resulta em efeitos terapêuticos.

Para demonstrar a viabilidade desta abordagem, criámos recentemente um transdutor química "sintético 4, que permite que o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), para desencadear a clivagem de um pró-fármaco anticanceroso, activando a glutationa-S-transferase (GST), que é não o seu parceiro de ligação natural. A estrutura deste "transdutor" consiste em um aptâmero ADN anti-PDGF que é modificado com um inibidor bivalente para GST. Por isso, este agente sintético pertence a uma família de moléculas com locais de ligação paraproteínas diferentes, 5-7, tais como indutores químicos de dimerização (CIDs) 8-10 e também para o grupo de proteína de ligantes com base em conjugados de molécula oligonucleotídica-sintético. 21/11

Os princípios gerais da concepção de tais sistemas é aqui descrito e protocolos detalhados para sintetizar e testar a função deste "transdutor" com ensaios enzimáticos convencionais são fornecidos. Este trabalho destina-se a facilitar o desenvolvimento de transdutores '' adicionais desta classe, que pode ser usado para mediar a comunicação proteína-proteína intracelular e, consequentemente, para induzir vias de sinalização celular artificiais.

A Figura 1 descreve esquematicamente os princípios de funcionamento dos transdutores '' químicos sintéticos que podem mediar a comunicação proteína-proteína não naturais. Nesta ilustração, um transdutor química ", que integra ligantes sintéticos para protEins I e II (ligantes I e II), permite que a proteína II para desencadear a actividade catalítica da proteína I, que não é o seu parceiro de ligação natural. Na ausência de proteína II, o transdutor se liga ao sítio catalítico da enzima (proteína I) e inibe a sua actividade (Figura 1, no estado II). A ligação do "transdutor" de proteína II, no entanto, promove as interacções entre ligante I e a superfície da proteína II (Figura 1, no estado III), o que reduz a sua afinidade para a proteína I. Como resultado, a concentração eficaz do ' livre transdutor 'na solução é reduzida, o que conduz à dissociação do transdutor em proteínas do complexo I e a reactivação da proteína I (Figura 1, estado IV). Tomados em conjunto, estes passos destacar três princípios fundamentais subjacentes à concepção de transdutores '' eficazes: (1) um transdutor 'deve ter um ligante específico para cada um dos alvos de proteína, (2) a interacção between ligante II e proteína II deve ser mais forte do que a interacção entre o ligante I e proteína I, e (3) agente ligante que deve ser capaz de interagir com a superfície da proteína II. Este último princípio não exige necessariamente que aglutinante só eu teria uma alta afinidade e selectividade para a proteína II. Em vez disso, baseia-se nos nossos estudos recentes que mostraram que a interposição de uma molécula sintética na proximidade de uma proteína é susceptível de promover interacções entre esta molécula e a superfície da proteína 19,22,23.

figure-introduction-1

Figura 1:. Operando princípios da 'transdutores químicas "Quando o' transdutor química 'é adicionada a uma proteína ativa I (estado i), que se liga ao seu sítio ativo através ligante I e inibe a sua actividade (estado ii). Na presença da proteína II, no entanto, não ligado a 't químicaransducer 'interage com a proteína II por meio de ligante II, que promove as interacções entre ligante I e a superfície da proteína II. Esta pasta induzida I-proteína interação II reduz a concentração eficaz de ligante I, o que leva à dissociação do 'transducer'-proteína I complexa e à proteína I reactivação (estado iv). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

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Protocolo

1. Síntese do "Chemical Transdutor '

  1. Os preparativos preliminares
    1. Preparar 2 M de acetato de trietilamónio tampão (TEAA) por mistura de 278 ml de trietilamina, com 114 ml de ácido acético e 400 ml de água ultrapura. Ajustar o pH a 7 e adicione água até um volume final de 1 L. mantê-lo em um frasco escuro.
      Nota: Esta solução é estável durante anos.
    2. Prepara-se uma solução de ácido ascórbico 5 mM por dissolução de 18 mg de ácido ascórbico em 20 ml de água ultrapura. Use uma solução fresca; a solução é estável durante um dia.
    3. Prepara-se uma solução de Cu 10 mM (II) / Tris (benzyltriazolylmethyl) amina (TBTA) por dissolução de 25 mg de cobre (II) penta-hidrato de sulfato em 10 ml de água ultrapura e 58 mg de TBTA em 11 ml de dimetil sulfóxido (DMSO). Misturar as duas soluções. Mantenha-o em temperatura ambiente e proteger da luz.
  2. conjugação Procedimento
    1. Dissolve-se 100 nmoles do oligonucleótido modificado (ODN-1) em 80 ulde água ultrapura fresca. Adicionar 20 ul de TEAA 2 M, pH = 7. Adicionar 80 ul de uma solução feita recentemente de ácido ascórbico (5 mM em água).
    2. Dissolve-se 1,5 mol (574,5 g) de ácido etacrínico modificada-azido em 180 ul de DMSO e adicioná-lo para a solução. Desgaseificar a solução com árgon durante 60 segundos e rapidamente adicionar 40 ul a partir da (ii) Solução de Cu / TBTA (10 mM em 55% (v / v) de DMSO / água).
    3. Purgar novamente com Argon, fechar bem e agitar durante a noite.
    4. Monitorizar o progresso da reacção e purificar o conjugado por RP-HPLC (fase móvel: A) 5% acetonitrilo, 5% de TEAA, 90% de água ultrapura; B) 65% de acetonitrilo, 5% de TEAA, 30% de água ultrapura). 24

2. Controlar GST Atividade por PDGF

  1. Os preparativos preliminares
    1. Preparar 50 ml de tampão de ensaio por mistura de 33,9 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBSx1) com 16,1 ml de água ultrapura para atingir uma concentração final de fosfato de 8 mm e add 23,8 mg de MgCl2 para obter uma concentração final de 5 mM.
    2. Prepara-se uma solução estoque de GST M1-1 por dissolução da proteína em tampão contendo Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, ditiotreitol 1 mM (DTT), 5 mM e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para uma concentração final de 30 uM. Divida esta solução em pequenas alíquotas e armazenar a -80 C. Diluir recentemente, de acordo com a secção 2.1.5.1, no tampão de ensaio e manter em gelo.
      Nota: a solução será estável durante cerca de 5 horas, ou até que haja uma redução na actividade da enzima.
    3. Prepara-se o substrato de acordo com as seguintes instruções:
      1. Dissolve-se 10 mg de glutationa reduzida (GSH) em 325 ul de água ultrapura até uma concentração final de solução de estoque de 100 mM. Dilui-se 21 ul desta solução de stock em 979 ul de tampão de ensaio para uma concentração final de solução de trabalho de 2,1 mM.
      2. Dissolve-se 10 mg de 2,4-dinitroclorobenzeno (CDNB) em 492 ul de eThanol para uma concentração final da solução de estoque 100 mM. Dilui-se 43,2 ul de solução de reserva em 956,8 ul de um tampão de ensaio para uma concentração final de 4,32 mM de solução de trabalho.
    4. Em uma placa de 96 poços, coloque cada substrato em uma linha separada (12 poços). Inserir, pelo menos, 60 uL em cada poço para permitir a retirada fácil e rápida da solução. Cubra o prato com uma folha de alumínio para proteção contra a luz.
    5. Prepare as seguintes soluções de no tampão de ensaio:
      1. Diluir GST M1-1 por 50 a uma concentração final de 0,6 uM do dímero.
      2. Dilui-se a 'transdutor químico »a uma solução de estoque de 30? M.
      3. Dilui-se PDGF para uma concentração final de 40 uM.
      4. Diluir PDGF aptâmero a uma concentração final de 250 uM.
  2. Medir a atividade da GST na Presença do 'transdutor química "e PDGF.
    1. Estabelecer um procedimento experimental iN o leitor de placas para a medição cinética.
      1. Criar uma nova experiência como um "protocolo padrão '.
      2. Pressione no "processo" para abrir a janela de configurações do procedimento.
      3. Na lista pop-up na parte superior da janela, escolher o tipo de '384 placa' de acordo com o fabricante da placa.
      4. Pressione 'Ler' no menu à esquerda.
      5. Em relação ao método de detecção escolha 'Absorvância'.
      6. Em relação ao tipo de leitura escolha 'ponto final'.
      7. Adicione 340 nm na janela de comprimento de onda.
      8. Pressione na parte inferior 'placa completa "no lado superior direito e escolha o bem a ser medido.
      9. Pressione "OK" para fechar o "Read" janela.
      10. Escolha 'start cinético "no menu à esquerda.
      11. Faça o tempo de execução 10 min.
      12. Selecione a opção intervalos mínimos.
      13. Pressione "OK" para fechar a janela cinética.
      14. Arraste o "Read" linha into a medida cinética.
      15. Pressione o botão 'validar' e depois no botão 'ok'.
      16. Salve o experimento.
      17. Pressione o botão 'play'. Uma caixa de diálogo aparecerá - pressione o botão 'ok' apenas quando a medição deve ser iniciado.
    2. A fim de realizar o experimento triplicado, preparar quatro amostras de cada uma contendo 3,25 mL da 'transdutor química "e 3,25 ul de GST M1-1. Adicionar a cada amostra de 0, 1,2, 2,4, ou 4,9 ul de PDGF e 123,5, 122,3, 121,1, 118,6 ou ul de tampão de ensaio, respectivamente.
    3. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 10 min.
    4. Em uma placa de 384 poços-transparente, inserir 40 ul de amostra a cada poço. Inserir as amostras apenas nos poços ímpares ou apenas do mesmo poços na mesma linha para permitir a utilização de um multi-pipeta para adição de substrato.
    5. Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul de cada uma das tele substratos que foram previamente preparados, na placa de 96 poços (secção 2.1.4). Misture delicadamente e rapidamente para evitar bolhas. Insira a placa no leitor e iniciar a medição cinética. Como a cinética de GST é bastante rápido, tentar minimizar o tempo entre a adição de substrato e o início da medição cinética.
  3. GST Activation Ciclos / inibição mediada pelo "transdutor química".
    1. A fim de realizar o experimento triplicado, preparar 5 amostras, cada uma contendo 84,5 uL de tampão de ensaio, 3,25 ul de 'transdutor química ", e 3,25 ul de GST M1-1. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
    2. Adicionar 3,65 mL de tampão de ensaio para a amostra 1 e 3,65 mL de PDGF para amostras 2-5. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
    3. Adicionar 3,12 mL de tampão de ensaio para as amostras 1-2 e 3,12 ul de PDGF aptâmero para amostras 3-5. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
    4. Adicionar 24.4 ul de tampão de ensaio para amostras1-3 e 24,4 ul de PDGF para amostras 4-5. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
    5. Adicionar 7,8 uL de tampão de ensaio para as amostras 1-4 e 7,8 ul de PDGF aptâmero a amostra 5. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    6. Em uma placa de 384 poços-transparente, inserir 40 ul de amostra em cada poço. amostras inserir somente para o ângulo diferente, ou apenas para os poços até mesmo na mesma linha.
    7. Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul a partir de cada substrato (pré-preparado na placa de 96 poços). Misture delicadamente e rapidamente para evitar bolhas. Insira a placa no leitor e iniciar a medição cinética.
    8. Calcula-se a 0 V [mOD / min] sob cada condição subtraindo a densidade óptica medida a 340 nm a t = 0,5 min medido a partir da OD a 340 nm a t = 1,5 min para avaliar a activação / inibição de reciclagem. 25
  4. Avaliar a resposta em tempo real do 'transdutor química' para mudanças no ambiente.
    1. efeito em tempo real de PDGF disso
      1. Estabelecer um procedimento experimental no leitor de placas para a medição cinética.
      2. Repita os passos 2.2.1.1-2.2.1.10.
      3. Faça o tempo de execução de 3,5 min.
      4. Selecione a opção intervalos mínimos.
      5. Pressione "OK" para fechar a janela cinética.
      6. Arraste a linha de "Read" para a medição cinética.
      7. Escolha Placa Out / In no menu à esquerda.
      8. Escolha a opção "placa out (sem diálogo) '.
      9. Escolha a opção "Delay" no menu à esquerda e entrar 30 seg.
      10. Escolha Placa Out / In no menu à esquerda.
      11. Escolha o "prato em (sem diálogo)" opção.
      12. Criar uma segunda medição de cinética, repetindo os passos 2.2.1.4 - 2.2.1.14 mas na secção 2.2.1.11 definir a cinética de ser de 25 minutos em vez de 10 minutos.
      13. Pressione o botão 'validar' e depois no botão 'ok'.
      14. Salve o experimento.
      15. Pressione o 'plabotão y '. Uma caixa de diálogo aparecerá - pressione o botão 'ok' apenas quando a medição deve ser iniciado.
      16. Prepare duas amostras por mistura de 1 ul de GST M1-1 e 1 ul da 'transdutor químico »em 38 ul de tampão de ensaio. Coloque as amostras em duas cavidades de uma placa de 384 poços-transparente, deixando um poço vazio entre estes dois poços.
      17. Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul a partir de cada substrato, misturar suavemente e rapidamente para evitar bolhas, inserir a placa no leitor e iniciar a medição cinética.
      18. Quando a chapa se abre para cima (após 3,5 min), adicionar rapidamente 1.125 ul de PDGF a um dos poços, misturar suavemente, e permitir que a placa para a fechar-se para as restantes medições cinéticas.
    2. efeito em tempo real da adição do PDGF aptâmero
      1. Repita os passos 2.4.1.1-2.4.1.15.
      2. Prepare duas amostras por mistura de 1 ul de GST M1-1, 1 ul da 'transdutor química ", e 1,125 mL de PDGF em 36,9 ul de tampão de ensaio. Coloque as amostras em duas cavidades de uma placa de 384 poços-transparente, deixando um poço vazio entre estes dois poços.
      3. Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul a partir de cada substrato, misturar suavemente e rapidamente para evitar bolhas, inserir a placa no leitor, e iniciar a medição cinética.
      4. Quando a chapa se abre para cima (após 1,5 min), adicionar rapidamente 1,2 mL de PDGF aptâmero a um dos poços, misturam suavemente e permitir que a placa para a fechar-se para as restantes medições cinéticas.
  5. Meça JS-K Pr�f�maco Ativação por GST na Presença do 'transdutor química "e PDGF.
    1. Estabelecer um procedimento experimental no leitor de placas para a medição cinética.
      1. Criar uma nova experiência como um "protocolo padrão '.
      2. Pressione no "processo" para abrir a janela de configurações do procedimento.
      3. Na lista pop-up na parte superior da janela, escolha o tipo '384 placa' de acordo com o fabricante da placa.
      4. Pressione 'Ler' no menu à esquerda.
      5. Em relação ao método de detecção escolhi 'absorvância'.
      6. Em relação ao tipo de leitura escolha 'ponto final'.
      7. Adicione 305 nm na janela de comprimento de onda.
      8. Pressione o botão de 'placa completa "no lado superior direito e escolha o bem a ser medido.
      9. Pressione "OK" para fechar o "Read" janela.
      10. Escolha 'start cinético "no menu à esquerda.
      11. Faça o tempo de execução 10 min.
      12. Selecione a opção intervalos mínimos.
      13. Pressione "OK" para fechar a janela cinética.
      14. Arraste a linha de "Read" para a medição cinética.
      15. Pressione o botão 'validar' e depois no botão 'ok'.
      16. Salve o experimento.
      17. Pressione o botão 'play'. A bo de diálogox aparecerá - pressione o botão 'ok' apenas quando a medição deve ser iniciado.
    2. Para a produção de medições usar um kit de calorimetria nitrito / nitrato. Numa placa de 96 poços inserir 50 ul de tampão de ensaio em uma fileira, 70 ul de Griess eu reagente numa segunda fila, e 70 ul de reagente de Griess II em uma terceira fila.
    3. A fim de realizar o experimento triplicado, preparar quatro amostras de cada uma contendo 4,8 mL da 'transdutor química ". Para a amostra 1, adicionar 155,2 ul de tampão de ensaio; a Amostra 2, adicionar 3,2 mL de GST-M1-1 e 152 ul de tampão de ensaio; a Amostra 3, adicionar 9,6 mL de PDGF e 145,6 uL de tampão de ensaio; e a amostra 4, adicionar 3,2 mL de GST-M1-1, 9,6 ul de PDGF, e 142,4 uL de tampão de ensaio.
    4. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Em uma placa de 384 poços-transparente, inserir 50 ul de amostra em cada poço. amostras de inserção apenas no estranho ou apenas namesmo poços na mesma linha para permitir a utilização de um multi-pipeta para adição de substrato.
    6. Adicionar 0,54 mL de JS-K (5 mM em DMSO) a cada poço.
    7. Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul da solução de GSH (pré-preparado na placa de 96 poços), misturar suavemente e rapidamente, para evitar as bolhas. Insira a placa no leitor e iniciar a medição cinética.
    8. Imediatamente após a medição da cinética, utilizando um multi-pipeta de 12 canais, tomar 50 ul de cada amostra para a linha de tampão de ensaio na placa de 96 poços pré-preparado e rapidamente adicionar-lhe 50 ul de Griess eu reagente e 50 ul de reagente de Griess II. Incubar enquanto protege da luz durante 10 min à temperatura ambiente e meça a absorvência a 550 nm.
      Nota: O tampão de ensaio e os volumes de reagentes são dependentes de protocolo dos kits.

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Resultados

A concepção, síntese e mecanismo de acção de um transdutor químico "que pode induzir a comunicação artificial entre PDGF e GST são apresentados na Figura 2. A estrutura do" transdutor "integra um aptâmero ADN de PDGF e uma amida de bis-etacrínico (bEA ), que é um conhecido inibidor de GST (figura 2a). 19 Estes ligantes permitir o 'transdutor' para se ligar tanto PDGF e GST com afinidades diferentes, a saber, com constant...

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Discussão

Apresentamos um método para projetar e testar um 'transdutor químico' que pode induzir a comunicação artificial entre duas proteínas naturalmente não relacionadas, GST e PDGF, sem modificar as proteínas nativas. As comunicações GST-PDGF não naturais podem ser detectadas em tempo real usando ensaios enzimáticos que seguem as mudanças na atividade do GST na presença do 'transdutor químico' e aumentando as concentrações de PDGF. Além de detectar a ativação do GST pelo PDGF, esses ensaios foram usados para acompanhar a desat...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Minerva, a Organização HFSP e um Grant Conselho Europeu de Investigação (Começando Grant 338265).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1-cloro-2,4-dinitrobenzenoSigma-Aldrich237329
Ácido acéticoBio Lab01070521
AcenitrilaJ.T.Baker9017-03
Ácido ascórbicoSigma-AldrichA4544
Sulfato de cobre (II) pentahidratadoMerck-Millipore102790
DimetilsulfóxidoMerck-Millipore802912
Dulbecco's Phosphate Buffered SalinoBiológico Indústrias02-023-5A
Ácido etacrínicoTokyo Chemical Industry Co. LtdE0526
Glutationa-s-transferase M1-1Centro de Proteômica Estrutural de Israel (Instituto Weizmann de Ciência, Rehovot, Israel)
JS-KSigma-AldrichJ4137
L-glutationa reduzidaSigma-AldrichG4251
Cloreto de MagnésioJ.T.Baker0162
kit de ensaio colorimétrico de nitrato/nitritoCayman Chemical780001
OligonucleotídeosW. M. Keck Foundation Biotechnology na Universidadepedido personalizado
PDGF-BBCentro de Proteômica Estrutural de Israel (Instituto Weizmann de Ciência, Rehovot, Israel)
TBTASigma-Aldrich678937
TrietilaminaSigma-AldrichT0886
Coluna de dessalinizaçãoGE Healthcareillustra MicroSpin G-25 Colunas
HPLCWaters 2695 módulo
Coluna HPLCWatersXBridgeTM OST C18 coluna (2,5 μ M, 4,6 mm e vezes; Coluna de HPLC de 50 mm
Coluna WatersXBridgeTM OST C18 (2,5  μ M, 10 mm e tempos; 50 mm)
Leitor de placasBioTeksynergy H4 hybrid
de Yale de separação

Referências

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