Artigo de método

Imitando a Função de Proteínas de Sinalização: Toward Artificial Signal Therapy Transdução

DOI:

10.3791/54396

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29 de setembro de 2016

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1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

Neste artigo

Resumo

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Apresentamos diretrizes para o desenvolvimento de 'transdutores químicos' sintéticos que podem induzir a comunicação entre proteínas naturalmente não relacionadas. Além disso, são apresentados protocolos detalhados para sintetizar e testar um 'transdutor' específico que permite que um fator de crescimento ative uma enzima desintoxicante e, consequentemente, regule a clivagem de um pró-fármaco anticâncer.

Resumo

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As vias de transdução de sinal, que controlam a resposta das células a vários sinais ambientais, são mediadas pela função de proteínas sinalizadoras que interagem entre si e se ativam umas às outras com alta especificidade. Agentes sintéticos que imitam a função dessas proteínas podem, portanto, ser usados para gerar etapas de transdução de sinal não naturais e, consequentemente, alterar a função da célula. Apresentamos diretrizes para projetar 'transdutores químicos' que podem induzir a comunicação artificial entre proteínas nativas. Além disso, apresentamos protocolos detalhados para sintetizar e testar um 'transdutor' específico, que pode induzir a comunicação entre duas proteínas não relacionadas: fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e glutationa-S-transferase (GST). A maneira pela qual essa comunicação PDGF-GST não natural poderia ser usada para controlar a clivagem de um pró-fármaco anticâncer também é apresentada, indicando o potencial para o uso de tais sistemas em 'terapia de transdução de sinal artificial'. Este trabalho tem como objetivo facilitar o desenvolvimento de 'transdutores' adicionais desta classe, que podem ser usados para mediar a comunicação proteína-proteína intracelular e, consequentemente, para induzir vias de sinalização celular artificial.

Introdução

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Vias de transdução de sinal de desempenhar um papel significativo em virtualmente todos os processos celulares e permitir que a célula para responder rapidamente aos sinais ambientais. 1 Estas vias são frequentemente desencadeada pela ligação de uma molécula de sinalização a um receptor extracelular, o que resulta na activação de enzimas intracelulares. A amplificação e a propagação deste sinal dentro da célula é mediada pela função de sinalização de proteínas que formam uma rede de interacções proteína-proteína, em que as enzimas são activadas de forma reversível com alta especificidade. Porque desregulação destas redes freqüentemente leva ao desenvolvime....

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Protocolo

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1. Síntese do "Chemical Transdutor '

  1. Os preparativos preliminares
    1. Preparar 2 M de acetato de trietilamónio tampão (TEAA) por mistura de 278 ml de trietilamina, com 114 ml de ácido acético e 400 ml de água ultrapura. Ajustar o pH a 7 e adicione água até um volume final de 1 L. mantê-lo em um frasco escuro.
      Nota: Esta solução é estável durante anos.
    2. Prepara-se uma solução de ácido ascórbico 5 mM por dissolução de 18 mg de ácido ascórbico em 20 ml de água ultrapura. Use uma solução fresca; a solução é estável durante um dia.
    3. Prepara-se uma solução de Cu 10 mM (II) / Tris (benzyltriazolylmethyl) amina (TBTA) por dissoluç....

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Resultados

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A concepção, síntese e mecanismo de acção de um transdutor químico "que pode induzir a comunicação artificial entre PDGF e GST são apresentados na Figura 2. A estrutura do" transdutor "integra um aptâmero ADN de PDGF e uma amida de bis-etacrínico (bEA ), que é um conhecido inibidor de GST (figura 2a). 19 Estes ligantes permitir o 'transdutor' para se ligar tanto PDGF e GST com afinidades diferentes, a saber, com constantes de dissociação (K

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Discussão

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Apresentamos um método para projetar e testar um 'transdutor químico' que pode induzir a comunicação artificial entre duas proteínas naturalmente não relacionadas, GST e PDGF, sem modificar as proteínas nativas. As comunicações GST-PDGF não naturais podem ser detectadas em tempo real usando ensaios enzimáticos que seguem as mudanças na atividade do GST na presença do 'transdutor químico' e aumentando as concentrações de PDGF. Além de detectar a ativação do GST pelo PDGF, esses ensaios foram usados para acompanhar a desat.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Minerva, a Organização HFSP e um Grant Conselho Europeu de Investigação (Começando Grant 338265).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1-cloro-2,4-dinitrobenzenoSigma-Aldrich237329
Ácido acéticoBio Lab01070521
AcenitrilaJ.T.Baker9017-03
Ácido ascórbicoSigma-AldrichA4544
Sulfato de cobre (II) pentahidratadoMerck-Millipore102790
DimetilsulfóxidoMerck-Millipore802912
Dulbecco's Phosphate Buffered SalinoBiológico Indústrias02-023-5A
Ácido etacrínicoTokyo Chemical Industry Co. LtdE0526
Glutationa-s-transferase M1-1Centro de Proteômica Estrutural de Israel (Instituto Weizmann de Ciência, Rehovot, Israel)
JS-KSigma-AldrichJ4137
L-glutationa reduzidaSigma-AldrichG4251
Cloreto de MagnésioJ.T.Baker0162
kit de ensaio colorimétrico de nitrato/nitritoCayman Chemical780001
OligonucleotídeosW. M. Keck Foundation Biotechnology na Universidadepedido personalizado
PDGF-BBCentro de Proteômica Estrutural de Israel (Instituto Weizmann de Ciência, Rehovot, Israel)
TBTASigma-Aldrich678937
TrietilaminaSigma-AldrichT0886
Coluna de dessalinizaçãoGE Healthcareillustra MicroSpin G-25 Colunas
HPLCWaters 2695 módulo
Coluna HPLCWatersXBridgeTM OST C18 coluna (2,5 μ M, 4,6 mm e vezes; Coluna de HPLC de 50 mm
Coluna WatersXBridgeTM OST C18 (2,5  μ M, 10 mm e tempos; 50 mm)
Leitor de placasBioTeksynergy H4 hybrid
de Yale de separação

Referências

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  1. Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
  2. Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
  3. Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D.

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