Summary
Heri beskriver vi en hidtil ukendt fremgangsmåde til at generere antigenspecifikke T-celle-receptorer (TCR'er) ved parring af TCRα eller TCRβ af en eksisterende TCR, der besidder den antigen-specificitet af interesse, med komplementær hemichain af den perifere T-celle receptor repertoire. De novo genererede TCR'er bevarer antigen-specificitet med varierende affinitet.
Abstract
T-cellereceptorer (TCR'er) anvendes klinisk til at dirigere specificiteten af T-celler til at målrette tumorer som et lovende modalitet af immunterapi. Derfor har kloning TCR'er specifikke for forskellige tumorassocierede antigener været målet for mange undersøgelser. At fremkalde en effektiv T-celle respons, skal TCR genkender målantigenet med optimal affinitet. Imidlertid har kloning sådan TCR'er været en udfordring og mange tilgængelige TCR'er besidder suboptimal affinitet for dertil hørende antigen. I denne protokol, beskriver vi en metode til at klone de novo høj affinitet antigen-specifikke TCR'er bruger eksisterende TCR'er ved at udnytte hemichain centricity. Det er kendt, at for nogle TCR'er, behøver hver TCRα eller TCRβ hemichain ikke bidrager ligeligt til antigengenkendelse, og den dominerende hemichain omtales som den centriske hemichain. Vi har vist, at ved parring af centric hemichain med counter-kæder afviger fra den oprindelige counter-kæde, er vi i stand til at opretholde antigenet specificity, mens modulere dens interaktion styrke for den beslægtede antigen. Således kan det terapeutiske potentiale af en given TCR forbedres ved at optimere parring mellem centreret og counter hemichains.
Introduction
T-cellereceptorer (TCR'er) er heterodimere adaptive immune receptorer udtrykt af T-lymfocytter, bestående af et TCRα og TCRβ kæde. De genereres via somatisk omlejring af V (D) J-gensegmenter, som frembringer et meget varieret repertoire stand til at genkende næsten ubegrænsede konfigurationer af HLA / peptid-komplekser. Klinisk har T-celler manipuleret til at udtrykke klonotypisk TCR'er er specifikt for tumorassocierede antigener viste virkning i en række forskellige cancere 1. Men mange TCR'er klonede til dette formål mangler tilstrækkelig affinitet for antigenet af interesse, som begrænser deres terapeutiske anvendelse.
Her beskriver vi en metode til at overvinde denne begrænsning for eksisterende TCR'er ved at udnytte kæde-centricity. Det er blevet rapporteret, at en TCR hemichain kunne spille en mere dominerende rolle i erkendelse af målantigenet 2, her betegnet centricity. Crystal strukturelle analyser har vist, at en centrerethemichain af en TCR kunne redegøre for størstedelen af fodaftryk på MHC / peptid-kompleks 3,4. Ved hjælp af dette koncept, har vi tidligere vist, at SIG35α TCRα kan parre med en varieret repertoire af TCRβ kæder og vedligeholde reaktivitet mod MART1 27-35 peptid præsenteret af HLA-A2 5. Lignende resultater blev opnået med TAK1 TCR, hvor den centriske TCRβ hemichain parret med forskellige TCRα kæder og opretholdt reaktivitet for WT1 235-243 peptidet præsenteres af HLA-A24 6. Både MART1 og WT1 er tumor-associerede antigener. Kæde-centricity blev også anvendt til at studere antigen anerkendelse af CD1d-begrænsede invariante naturlige dræberceller (iNKT) TCR, ved at parre den invariante Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα kæde af menneskelige iNKT TCR'er med forskellige Vβ11 TCRβ kæder 7.
I alle tilfælde var vi i stand til at generere en de novo repertoire af TCR'er af transducere den centriske TCR hemichain til perifert blod T-celler, hvor den indførte hemichain parret med den endogene TCRα eller TCRβ counter-kæder. I det væsentlige centreret hemichain tjener som en lokkemad, der kan anvendes til at identificere de passende counter-kæder, som, når parret sammen danner TCR'er der opretholder antigenspecificitet af interesse, men varierende affinitet. Ud fra disse nye repertoirer, var vi i stand til at isolere klonotypisk TCR'er med forbedret interaktion styrke mod målantigenet sammenlignet med allerede eksisterende TCR'er. Derfor mener vi, denne metode vil fremskynde rørledningen identificere optimale TCR'er for klinisk anvendelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse Retroviral Construct Kodning TCR Hemichain of Interest
- Linearisere pMX vektoren for at tillade indsættelsen af en TCR-gen i efterfølgende trin. Fordøje plasmid-DNA med EcoRI og NotI restriktionsenzymer ved 37 ° C i 3 timer (tabel 1) 8.
- Udfør elektroforese af det fordøjede plasmid på 1,2% agarosegel. Excise band på ca. 4500 basepar (bps), og der elueres i 30 pi sterilt vand anvendelse af kommercielt tilgængelige gel udvinding kits 9.
- Design 5'- og 3'-primere for TCR-genet af interesse, som også kode 15-20 bps overlappende EcoRI og Notl-fordøjelse site af pMX vektor henholdsvis 8.
- Amplificere TCR-gen med primere. Udfør elektroforese af PCR-produktet, og der elueres bånd på ca. 1.000 bps som beskrevet i trin 1.2.
- Klon TCR-genet i spaltet vektor ved at kombinere hver lineære fragment med kommercielt tilgængeligt plasmidsamling mastermix reagens og inkubering ved 50 ° C i 1 time.
BEMÆRK: Se producentens protokol for relative mængder af hver komponent. Denne samling metode er baseret på den oprindeligt beskrevet af Gibson et al. 10 teknik. - (Valgfrit) Tag TCR gen markere transducerede celler med den afkortede form af human nervevækstfaktorreceptor (ANGFR, aminosyrer 1-277) 11 adskilt af furinkløvningssitet, serin-glycin-linker, og 2A sekvenserne 12,13. Design primere kodende sekvenser overlapper fragmentet ender og samle plasmid som beskrevet i trin 1,3-1,5.
BEMÆRK: Disse sekvenser kan findes i referencer 11-13. - Transform kemisk kompetent E. coli med samlet plasmidet efter fabrikantens protokol 14. Seed transformerede bakterier på agar-plader (20 mg / ml lysogeni bouillon (LB), 15 mg / ml agar, og 1 ug / ml ampicillin) og inkuberes ved 37 ° C i 18 timer. Kultur en enkelt bakterie koloni i 50 ml LB-medium (20 mg / ml LB og 1 ug / ml ampicillin) i 16 timer i en rysteinkubator ved 37 ° C og 200 omdrejninger pr min.
- Oprens plasmider ved anvendelse af kommercielt tilgængelige kits midiprep følgende producentens protokol. Fortynd plasmid til koncentration på ca. 1 pg / pl.
BEMÆRK: Plasmidet rensning protokol er baseret på den alkaliske ekstraktionsmetode 15.
2. Generering Stabil pakkende cellelinje
BEMÆRK: Både 293GPG og PG13 celler er vedhængende. Dyrke celler i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 50 ug / ml gentamicin. Kultur 293GPG celler med 1 ug / ml tetracyclin før transfektion. Cellerne inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 mellem alle trin.
- Transficere 293GPG pakkeceller 16 dyrket i T75-kolbe med hemichain-kodende vektor opnået i trin 1.9, USIng kommercielt tilgængelig transfektionsreagens efter fabrikantens protokol 1 7. BEMÆRK: transfektion 293GPG celler ved 50-60% sammenflydning.
- Aspirer medium for 293GPG celler og tilsættes 10 ml frisk DMEM medium 1 dag efter transfektion.
- Harvest forbigående producerede virus fra transficerede 293GPG celler 2 dage efter trin 2.2 ved at overføre dyrkningsmedium til sprøjte og går igennem 0,45 um filter.
BEMÆRK: Virus kan anvendes straks eller opbevares ved -80 ° C til senere brug. - Kultur 1 x 10 5 PG13 celler i T25-kolbe. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer. Efter en dag, aspireres dyrkningsmedium og tilsæt 1,5 ml 293GPG-afledt virus fra trin 2.3 og 1,5 ml DMEM-medium, sammen med 8 ug / ml polybren.
- Ændre medium som beskrevet i trin 2.4 en gang om dagen i 4 dage, til at etablere stabile PG13 pakkecellelinie producerer retrovirus, der koder for TCR hemichain af interesse.
- Aspirer medium og erstattemed frisk DMEM medium til PG13 cellelinier 24 timer efter sidste infektion til yderligere dyrkning.
BEMÆRK: Frys eller sub-kultur celler ved aftagning med 0,05% trypsin-EDTA-opløsning. - For at producere virus fra transducerede PG13 cellelinier, kultur 2 x 10 6 celler i T75-kolbe med 10 ml DMEM-medium, og høst virus som beskrevet i trin 2.3 tre dage efter podning af cellerne.
BEMÆRK: Virus er bedst anvendes straks, men kan opbevares ved -80 ° C i op til to måneder.
3. Aktivering og transduktion af humane T-celler
BEMÆRK: Humane prøver opnås og anvendes i overensstemmelse med de institutionelle etiske udvalg godkendte protokoller. Kultur primære humane celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium suppleret med 10% humant serum i stedet for FCS og 50 ug / ml gentamicin. Cellerne inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 mellem alle trin.
- Isolere humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) efter densitetgradient separation efter fabrikantens protokol 18.
- Aktivere T-celler til at inducere proliferation kræves for retroviral infektion. Kultur 2 x 10 7 fersk eller optøet PBMC pr brønd i 6-brønds plade, i 5 ml RPMI-medium med 100 IU / ml rekombinant human interleukin-2 (rhIL-2) og 50 ng / ml af anti-CD3-monoklonalt antistof (klon OKT3).
- Tre dage efter stimulering, indsamle T-celler ved pipettering og der centrifugeres ved 350 xg i 4 min. Supernatanten kasseres og frø 0,5-1 x 10 6 T celler per brønd i 24-brønds plade resuspenderet i 1 ml PG13 virus fra trin 2.7, og 1 ml RPMI-medium suppleret med 200 IU / ml rhIL-2. Centrifuge plade ved 1.000 xg og 32 ° C i 1 time.
- Efter 24 timer, indsamle T-celler ved pipettering og der centrifugeres ved 350 xg i 4 min. Supernatanten kasseres og resuspender cellerne i 1 ml PG13 virus fra trin 2.7, og 1 ml RPMI-medium suppleret med 200 IU / ml rhIL-2. Gentag dette trin for alt 6 inficereioner.
BEMÆRK: Antallet af infektioner bør optimeres afhængigt titer af virus, der produceres ved at pakke cellelinie. Hvis det er nødvendigt, at passage T-celler ved at fjerne 20-30% af cellerne hver dag forhindre overvækst. - 24 timer efter den sidste infektion, indsamle T-celler ved pipettering og der centrifugeres ved 350 xg i 4 min. Supernatanten kasseres og resuspender cellerne i RPMI-medium med 100 IE / ml rhIL-2 for yderligere kultur.
- 2-3 dage efter trin 3.5, bejdse T-celler med HLA multimer ved 4 ° C i 30 minutter, derefter anti-humant CD3 og co-receptor monoklonale antistoffer (mAb'er) ved 4 ° C i 15 min. Analyser ved flow-cytometri. Brug irrelevant multimer og / eller utransducerede celler som negative kontroller (figur 1 - 3) 19.
- Hvis den introducerede centric hemichain er en TCRα kæde, analysere Vp brug af de novo multimer positive celler ved anvendelse af kommercielt tilgængelige Vp-specifikt antistof panel ved flowcytometri 20.
4. Kloning De Novo TCR Counter-hemichains
- Sorter de novo multimeren positive population i trin 3.6 ved flow-assisteret cellesortering.
- Isoler RNA fra sorteres T-celler under anvendelse af syreguanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion metode 21,2 2.
BEMÆRK: RNA kan opbevares ved -80 ° C, men bør anvendes til at generere cDNA snarest muligt. - Syntetisere cDNA-bibliotek fra ekstraherede RNA ved anvendelse af kommercielt tilgængelige reverse transkriptase-PCR-kits ifølge producentens protokol 23,24.
- Hvis kloning TCRβ counter-kæder, designe Vp-gen og TCRβ konstant region specifikke primere, som bestemt i trin 3.7, og klone fuld længde TCRβ gener som beskrevet i trin 1,3-1,9. Se trin 4.5, hvis counter-kæden er TCRα, ellers fortsætte til trin 5.1.
- Kommercielt tilgængelige Va-specifikke antistoffer er begrænset, kan således ikke Va gen-anvendelsebestemmes ved flowcytometri. Klon TCRα counter-kæder via 5'-hurtig amplifikation af cDNA-ender (RACE) 25, under anvendelse af kommercielt tilgængelige 5'-RACE kits 6.
- Syntetisere 5'-RACE kompatibel cDNA fra RNA ekstraheret i trin 4.2 efter fabrikantens protokol.
- Udfør 1 m runde PCR som beskrevet i tabel 2.
- Udfør elektroforese af PCR-produktet og eluer bånd på ca. 1.100 bps, som beskrevet i trin 1.2.
- Udfør 2. runde PCR som beskrevet i tabel 3, anvendelse af 1 st round PCR-produkt som template.
BEMÆRK: Primer sekvenser vist i tabel 3 blev konstrueret til kloning i EcoRI og Notl-fordøjet pMX vektor. - Udfør elektroforese af PCR-produktet og eluer bånd på ca. 1.000 bps, som beskrevet i trin 1.2.
- Klon TCRα gener ind i EcoRI og Notl-fordøjet pMX vektor og purify plasmider som beskrevet i trin 1,5-1,9.
5. rekonstituere Novel Antigen-specifikke TCR Kloner
BEMÆRK: Kultur Jurkat 76 celler og efterfølgende cellelinier i RPMI-medium suppleret med 10% FCS og 50 ug / ml gentamicin. Cellerne inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 mellem alle trin.
- Transducere Jurkat 76 celler 26 (eller tilsvarende TCR - / - human T-celle linie) med centreret TCR hemichain hjælp 293GPG virus produceret i trin 2.3. For Jurkat 76, frø 5 x 10 4 celler per brønd i 24-brønds plade med 1 ml virus og 1 ml RPMI-medium. Centrifuge plade ved 1.000 xg og 32 ° C i 1 time.
- 24 timer efter infektion, indsamle hemichain transducerede Jurkat 76 celler ved pipettering og centrifuger ved 350 xg i 4 min. Supernatanten kasseres og resuspender i frisk RPMI-medium til yderligere dyrkning.
- Oprense transducerede celler, hvis hemichain er molekylært tagged 2-3 dage efter trin 5.2, ved pleting med fluorophor konjugeret anti-NGFR mAb efterfulgt af flow-assisteret eller magnetisk-assisteret cellesortering (ekstraudstyr) 27.
- Efter trin 2.1 til 2.3, producere 293GPG virus koder for en TCR counter-kæde klonet fra trin 4.4 eller 4.5.
- For fuldt ud rekonstituere TCR, transducere T-cellelinie stabilt udtrykker centriske TCR hemichain genereret i trin 5,1-5,3 ved anvendelse virus fra trin 5.4. Udfør transduktion som beskrevet i trin 5,1-5,2.
- Oprense CD3 + transfektanter under anvendelse af anti-CD3 magnetisk-assisteret cellesortering efter fabrikantens protokol, 2-3 dage efter trin 5.5 27.
- For at validere antigenspecificitet, plette transfektanterne udtrykte klonotypisk TCR'er sammensat af den centriske TCR hemichain parret med forskellige counter-kæder, med anti-CD3 og / eller co-receptor mAb'er, og HLA multimer, 3-5 dage efter CD3 oprensning. Analyser celler ved flowcytometri (fig 4. - 5.) 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uden forudgående kendskab til hvilke hemichain er kæde-centreret, det TCRα og TCRβ kæde skal separat klonet og transduceres til perifere blod T-celler, som blev gjort i tilfældet med HLA-A24 / WT1 reaktiv TAK1 TCR (figur 1). Transduktion af TAK1β gav et mærkbart højere frekvens af antigenspecifikke T-celler. Omvendt ville transduktion af en ikke-centreret hemichain ikke give de novo multimer positive T-celler, som set med TAK1α kæde (figur 1). Under analyse, gate på NGFR + -celler, hvis TCR-genet blev tagget til specifikt at analysere transducerede celler (figur 1 - 2). På den anden side kan den enkelt centreret hemichain transduceres hvis det er kendt for at være dominerende, f.eks SIG35α og invariante Vα24 TCRα kæder (figur 2 og 3). T-celler specifikke for den respektive Cognspiste antigen steg i frekvens ved transduktion af en centreret TCRα hemichain. (Figur 2 - 3). Sammen viser disse data, at indførelsen af en centrisk TCRα eller TCRβ hemichain til perifere blod-T-celler kan generere de novo TCR'er med antigen-specificitet af interesse.
Antigen-specifik population kan sorteres ved flow-assisteret cellesortering og TCR hemichains kan klones som beskrevet i protokollen sektion 4. klonotypiske TCR counter-kæder kan være individuelt rekonstitueres på en T-cellelinie stabilt udtrykker centriske hemichain. Jurkat 76 transfektanter, der udtrykker nyligt klonet unikke TCR'er fra TAK1β eller SIG35α centric hemichain transducerede T-celler, besad varierende aviditet for det respektive beslægtede antigen, som bestemt af HLA / peptid multimer farvning 5,6. Konkret kunne vi isolere de novo TCRα counter-kæder that når parret med TAK1β blev farvet med enten lavere eller højere intensitet af WT1 antigen-komplekset end den parentale TAK1αβ parring (figur 4). Tilsvarende SIG35α parret med unikke counter-kæder anerkendte HLA-A2 / MART1 med moderat til høj aviditet (figur 5). SIG35α blev klonet uafhængigt af en TCRαβ heterodimer 5, derfor forældrenes parring for denne hemichain var utilgængelig for sammenligning. Vigtigt er, indikerer disse data, at det er muligt at modulere affiniteten for målantigenet ved at parre den centriske hemichain med forskellige counter-kæder.
Figur 1:. TAK1β som et eksempel på HLA-begrænsede TCRβ centric hemichain TCRα eller TCRβ hemichains af HLA-A24 / WT1 reaktiv TAK1 TCR blev tagget med trunkeret nervevækstfaktor receptor (ANGFR), og individuelt transduceres til perifere blod-T-celler. Transfektanter blev farvet med PC5-konjugeret anti-CD8 (133x fortyndet) og FITC-konjugeret anti-NGFR (20x fortyndet) monoklonale antistoffer (mAb'er), og angivet HLA-A24 multimer (5 ug / ml), efter to gange antigenspecifik stimulation. Alt 6 donorer blev testet. Alle data blev gated på NGFR + celler. Figur re-trykt med tilladelse fra henvisning 6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. SIG35α som et eksempel på HLA-begrænsede TCRα centric hemichain SIG35α TCRα kæde mærket med ANGFR, eller mærket alene, blev transduceret til perifere blod-T-celler. Transfektanter blev farvet med PC5-conjugated anti-CD8 (133x fortyndet) og FITC-konjugeret anti-NGFR (20x fortyndet) mAb'er, og indikeret HLA-A2 multimer (8 ug / ml). Alt 4 donorer blev testet. Alle data blev gated på NGFR + celler. Figur re-trykt med tilladelse fra henvisning 5 (Copyright 2015. American Association of immunologer, Inc.). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Uforanderlige natural killer T (iNKT) cellereceptor Vα24 (Vα24i) som et eksempel på CD1d-begrænset TCRα centric hemichain Vα24i TCRα kæde blev transduceret til perifere blod-T-celler. Transfektanter blev farvet med FITC-konjugeret anti-CD3 (20x fortyndet) mAb og angives CD1d multimer (5 ug / ml). Ubelastet CD1d molecules blev produceret fra HEK293 celler og nuværende endogene ukendte selv-lipider. iNKT TCR er defineret ved anerkendelse af CD1d præsentere α-GalCer eller dets analog PBS-57. Alt 4 donorer blev testet. Figur re-trykt med tilladelse fra henvisning 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentativ TCRα counter-kæder klonet fra TAK1β transducerede T-celler TCRα kloner T262, A262, A186, A133, og T4 blev klonet fra HLA-A24 / WT1 multimer positive TAK1β transducerede perifere T-celler, og individuelt rekonstitueres på Jurkat 76 celler. udtrykker CD8, sammen med TAK1β kæden. Transfektanter blev farvet med PC5-konjugeret anti-CD8 mAb (133x udvandet) og angivet HLA-A24multimer (5 ug / ml). Data er repræsentative to uafhængige forsøg. Fejlsøjler indikerer rækkevidde. Figur re-trykt med tilladelse fra henvisning 6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentativ TCRβ counter-kæder klonet fra SIG35α transducerede T-celler TCRβ kloner 413, 523, 788, 1086, 794, og 830 blev klonet fra HLA-A2 / MART1 multimer positiv SIG35α transducerede perifere T-celler, og individuelt rekonstitueres på Jurkat. 76 celler, der udtrykker CD8, sammen med SIG35α kæde. DMF5 var en tidligere klonet høj affinitet TCR genkende HLA-A2 / MART1. Transfektanter blev farvet med PC5-konjugeret anti-CD8 mAb (133x fortyndet) og angivet HLA-A2 multimer (2 ug / ml). Data er repræsentative for to uafhængige forsøg. Fejlsøjler indikerer rækkevidde. Figur re-trykt med tilladelse fra henvisning 5 (Copyright 2015. American Association of immunologer, Inc.). Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1:.. Opsætning til pMX vektor fordøjelse Reagenser og respektive voluminer vises Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 2: Opsætning til 1. runde 5 'RACE PCR. Reagenser og respektive mængder, PCR indstillinger og primer sekvens vises. Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 3: Opsætning til 2. runde 5 'RACE PCR-reagenser og respektive mængder, PCR indstillinger og primer sekvenser er vist.. Klik her for at se en større version af denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den første forudsætning for en vellykket anvendelse af denne metode er at opnå tilstrækkelig transduktionseffektivitet af primære T-celler med hemichain af interesse. Det er vores erfaring, at kombinationen af anvendelse af PG13 som pakningscellelinie og pMX som retrovirale vektor resulterer i stabil og effektiv ekspression af det indførte gen i humane primære T-celler. PG13 pakkeceller kan være enkelt-celle klones at selektere for høj titer pakkeceller for at forbedre transduktionseffektivitet. Endvidere er proliferation af T-celler også påkrævet for høj transduktionseffektivitet af retrovirus. I den beskrevne protokol, stimulering med opløseligt anti-CD3 mAb OKT3, sammen med en høj koncentration af rhIL-2, giver den nødvendige aktiveringssignaler at inducere celledeling. Monocytter er nødvendige for den stimulerende kapacitet af opløseligt OKT3, sandsynligvis ved binding med Fc-receptorer. Derfor bulk-PBMC, og ikke oprenset T-celler, der kræves for denne særlige stimuleringsprotokol. Tceller bør dyrkes i RPMI suppleret med humant serum for optimale eksperimentelle resultater. Alle andre celler er beskrevet her, kan dyrkes i nærværelse af føtalt kalveserum.
For det andet skal de novo genererede antigenspecifikke TCR'er udtrykkende celler kunne detekteres. For visse TCR hemichains, såsom TAK1β, de novo TCR udtrykkende celler kun spores efter stimulering med antigen-pulserede antigenpræsenterende celler (APC'er). Hvis således antigenspecifikke TCR'er ikke påvises umiddelbart efter transduktion af centric hemichain, kunne de være detekterbar efter ekspansion af APC'er. Bemærk, at transduktion af en ikke-centreret hemichain ikke ville give de novo antigenspecifikke T-celler selv efter antigenspecifik ekspansion med APC'er, som set med TAK1α hemichain (figur 1). I vores undersøgelser, er HLA multimerer anvendes til påvisning, men dette er muligvis ikke tilgængelige for nogle TCR, især HLA klasse II-begrænsede TCRs. Et alternativ ville være at påvise T-celle-funktionelle responser. Hemichain transducerede T-celler kan stimuleres med APC'er pulseret med antigenet af interesse. Vehicle-pulserede APC'er og utransducerede T-celler kan anvendes som kontroller. Responderende T-celler kan påvises ved opregulering af overfladen aktiveringsmarkører såsom CD107a, CD154, CD137 eller.
Endelig er det vigtigt at validere, at de klonede counter-kæder i virkeligheden kan genkende antigenet af interesse, når parret med den centriske hemichain. Dette er især vigtigt, når centric hemichain er TCRβ og counter-kæder er TCRα, da allel udelukkelse for TCRα gener er utæt, og det skønnes, at en betydelig del af perifere αβ T-celler udtrykker mere end én TCRα kæde 28. Reaktivitet kan bekræftes med multimer farvning eller måling funktionelt respons efter stimulering med APC'er præsentere det beslægtede antigen.
én limitatipå ved denne teknik er, at ikke alle TCR vil komponere en centreret hemichain, da både TCRα og TCRβ bidrager sammenligneligt for antigen anerkendelse i nogle tilfælde 3. Derfor kan perifere T-celler transduceret med sådanne ikke-centric hemichains ikke give de novo antigenspecifikke TCR'er.
Ikke desto mindre er denne metode repræsenterer en konceptuel fremskridt på den konventionelle tilgang til kloning TCR'er, hvor både TCRα og TCRβ gener skal klonede og skal sikres korrekt parring 29,30. I vores teknik, parring mellem hemichains er ikke længere en største bekymring og kun én af TCR-kæderne skal klones, eftersom den anden er fast. Foruden HLA klasse I eller CD1d-begrænsede TCR'er, kan den beskrevne fremgangsmåde også anvendes til isolering af HLA klasse II-begrænsede TCR'er for TCR genterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
