Summary
Здесь мы опишем метод нового для генерации антиген-специфические Т-клеточные рецепторы (TCR) путем спаривания TCRα или TCR & beta существующего TCR, обладающих антигенной специфичности интересов, с дополнительным hemichain репертуара клеточных рецепторов периферических Т. В De Novo , сгенерированные ТКО сохраняют антиген-специфичность с различной аффинностью.
Abstract
Т-клеточные рецепторы (TCR), которые используются в клинике, чтобы направить специфичность Т-клеток целевых опухолей в качестве перспективного механизма иммунотерапии. Таким образом, клонирование ТКР специфические для различных ассоциированных с опухолью антигенов было целью многих исследований. Для того, чтобы вызвать эффективный Т-клеточный ответ, ТКС должен распознавать антиген-мишень с оптимальной сродства. Тем не менее, клонирование таких ТКО было проблемой, и многие доступны ТКО обладают субоптимальную сродством к родственным антигеном. В этом протоколе мы опишем метод клонирования De Novo высоким сродством антиген-специфические ТКО с использованием существующих ТКО за счет использования hemichain Centricity. Известно, что для некоторых ТКР, каждый TCRα или TCR & beta; hemichain не способствуют в равной степени к распознаванию антигена, и доминирующий hemichain упоминается как Центрическая hemichain. Мы показали, что путем спаривания Центрическая hemichain с ответными цепями, отличающимися от исходного контр-цепи, мы можем поддерживать антиген Specificity, в то время как модулировать свои силы взаимодействия для родственного антигена. Таким образом, терапевтический потенциал данного TCR может быть улучшена за счет оптимизации спаривание между центрированных и счетчик hemichains.
Introduction
Т-клеточные рецепторы (TCR) являются гетеродимерные адаптивные иммунные рецепторы, выраженные Т-лимфоциты, состоящие из цепи TCRα и TCR & beta;. Они генерируются с помощью соматической перегруппировки V (D) J сегментов гена, который производит чрезвычайно разнообразный репертуар, способных распознавать практически неограниченные конфигурации по HLA / пептидных комплексов. Клинически, Т - клетки , сконструированные для экспрессии клонотипическим ТКР , специфичные к опухолевым антигенам, продемонстрировали эффективность в различных раковых заболеваний 1. Тем не менее, многие ТКР клонированные для этой цели не обладают достаточной аффинностью к интересующему антигену, что ограничивает их терапевтическое применение.
Здесь мы опишем метод, чтобы преодолеть это ограничение для существующих ТКО за счет использования цепи Ориентированность. Сообщалось , что один TCR hemichain мог бы играть более доминирующую роль в признании антигена - мишени 2, здесь называют Centricity. Хрустальные структурные анализы показали, что один Centrichemichain из TCR может объяснить большинства след на MHC / пептид 3,4. Используя эту концепцию, ранее мы показали , что SIG35α TCRα может спариваться с разнообразным репертуаром TCR & beta ; цепей и поддерживать реактивность против MART1 27-35 пептида , представленного HLA-A2 5. Аналогичные результаты были получены с TAK1 TCR, где Центрическая TCR & beta ; hemichain сопряженным с различными цепями TCRα и обслуживаемой реакционной способностью по отношению к WT1 235-243 пептида , представленного HLA-A24 6. Оба MART1 и WT1, являются ассоциированные с опухолью антигены. Сеть Ориентированность был также применен для изучения распознавания антигена CD1d-ограниченных инвариантных натуральных киллеров (iNKT) ТКР, соединяя инвариантную Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα цепь ТКР iNKT человека с различными Vβ11 цепей TCR & beta ; 7.
Во всех случаях мы смогли сформировать заново репертуар ТКР по трансducing Центрическая TCR hemichain к Т-клеток периферической крови, где введена hemichain спаренных с эндогенным TCRα или TCR & beta; контр-цепей. По существу, ориентированный hemichain служит в качестве приманки, которые могут быть использованы для идентификации соответствующих встречные цепи, которые при сопряжении вместе образуют ТКО, которые поддерживают антигенную специфичность интерес, но различных по сродству. Из этих новых репертуаров, мы были в состоянии изолировать клонотипичной ТКО с улучшенной прочностью взаимодействия против антигена-мишени по сравнению с уже существующими ТКО. Поэтому мы считаем, этот метод ускорит трубопровод определения оптимальных ТКО для клинического применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Ретровирусное Construct Кодировка TCR Hemichain Интереса
- Линеаризацию Рмх вектор, чтобы позволить вставку гена TCR в последующих стадиях. Гидролизуют плазмидной ДНК с помощью ферментов рестрикции EcoRI и NotI при температуре 37 ° С в течение 3 часов (таблица 1) 8.
- Провести электрофорез расщепленной плазмиды на 1,2% агарозном геле. Акцизной полосу примерно 4500 пар оснований (БТС), и элюат в 30 мкл стерильной воды с использованием коммерчески доступных наборов для экстракции геля 9.
- Дизайн 5 'и 3' праймеры для гена TCR интереса , который также закодировать 15-20 базисных пунктов перекрывающихся переваривания сайт EcoRI и NotI из рМХ вектора соответственно 8.
- Amplify гена TCR с праймеров. Проводят электрофорез продукта ПЦР и элюции полосу примерно 1000 бод, как описано на стадии 1.2.
- Клонирование гена TCR в переваренной вектор, комбинируя каждый линейный фрагмент с коммерчески доступной плазмидысборка мастер-реагента смесь и инкубирования при 50 ° С в течение 1 ч.
Примечание: Обратитесь к протоколу производителя для относительных объемов каждого компонента. Этот метод сборки основан на методике , впервые описанной Gibson и др. 10. - (Необязательно) ген Tag TCR к Марку трансдуцированных клеток с усеченной формой человеческого нерва рецептора фактора роста (ΔNGFR, аминокислоты 1-277) 11 , разделенных Фурин сайта расщепления, серин-глицин линкера, и 2А Последовательность из 12,13. Дизайн праймеров последовательности, кодирующие перекрывающие концы фрагмента и монтируем плазмиды, как описано в пунктах 1.3-1.5.
Примечание: Эти последовательности можно найти в ссылках 11-13. - Transform химически компетентную E. палочка с собранной плазмиды следующим протоколом производителя 14. Семенной трансформированных бактерий на чашках с агаром (20 мг / мл лизогении бульона (LB), 15 мг / мл агара и 1 мкг / мл ампициллина) и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 18 часов. Культура одна бактерия колонии в 50 мл LB-среды (20 мг / мл LB и 1 мкг / мл ампициллина) в течение 16 ч в качалке инкубаторе при температуре 37 ° С и 200 выстрелов в минуту.
- Очищают плазмид с использованием коммерчески доступных наборов midiprep в соответствии с протоколом производителя. Развести плазмиды в концентрации около 1 мкг / мкл.
Примечание: Протокол очистки плазмидной основан на методе щелочной экстракции 15.
2. Создание прочной упаковке клеточной линии
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба 293GPG и PG13 клетки являются приверженцем. Культура клеток в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FCS) и 50 мкг / мл гентамицина. Культура 293GPG клетки с 1 мкг / мл тетрациклина, до трансфекции. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% CO 2 между всеми шагами.
- Трансфекцию 293GPG упаковочные клетки , культивированные в 16 T75 колбе с вектором hemichain-кодирования , полученного на стадии 1.9, USIнг коммерчески доступного реагента для трансфекции в соответствии с протоколом производителя 1 7. Примечание: трансфекцию 293GPG клетки на 50-60% сплошности.
- Отберите среда для 293GPG клеток и добавляют 10 мл свежей DMEM среда 1 день после трансфекции.
- Урожай скоротечно получают вирус от трансфицированных клеток 293GPG 2 дня после того, как шаг 2.2 путем переноса культуральной среды в шприц и проходящий через фильтр 0,45 мкм.
Примечание: Вирус можно использовать сразу или хранить при -80 ° С для последующего использования. - Культура 1 х 10 5 PG13 клеток в T25 колбу. Граф клеток с использованием гемоцитометра. После того, как один день, аспирация культуральной среды и добавляют 1,5 мл 293GPG-производного вируса с шага 2,3 и 1,5 мл DMEM среды, вместе с 8 мкг / мл полибрена.
- Изменение среды, как описано в пункте 2.4 один раз в день в течение 4-х дней, чтобы установить стабильное PG13 линию упаковывающих клеток, продуцирующих ретровирус, кодирующие TCR hemichain интерес.
- Отберите средних и заменитьсо свежей средой DMEM для линий PG13 клеток 24 ч после последней инфекции для дальнейшей культуры.
Примечание: Замораживание или субкультура клеток путем разъединением с 0,05% раствором трипсина-ЭДТА. - Для того, чтобы производить вирус из клеточных линий , трансдуцированных PG13, культуру 2 х 10 6 клеток в T75 колбу с 10 мл среды DMEM и вирус урожая , как это описано в шаге 2.3 через три дня после посева клеток.
Примечание: Вирус лучше всего использовать сразу, но можно хранить при температуре -80 ° С в течение до двух месяцев.
3. Активация и трансдукция человеческих Т-клеток
Примечание: Человеческие образцы получены и использованы в соответствии с институциональными комитет по этике утвержденных протоколов. Культура первичные клетки человека в Roswell Park Memorial института (RPMI) среде с добавлением 10% сыворотки крови человека вместо FCS и 50 мкг / мл гентамицина. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% CO 2 между всеми шагами.
- Isolate человека мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от плотностиГрадиент разделения в соответствии с протоколом изготовителя 18.
- Активация Т-клеток, чтобы индуцировать пролиферацию, необходимое для ретровирусной инфекции. Культура 2 х 10 7 свежей или оттаивают РВМС на лунку в 6-луночные планшеты, в 5 мл RPMI среде с 100 МЕ / мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека (рИЛ-2) и 50 нг / мл анти-CD3 моноклональными антителами (клон ОКТ3).
- Три дня после стимуляции, собирают Т-клеток с помощью пипетки и центрифуги при 350 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и семян 0,5-1 × 10 6 Т - клеток на лунку в 24-луночный планшет , ресуспендировали в 1 мл вируса PG13 от стадии 2.7, и 1 мл RPMI среде , дополненной 200 МЕ / мл рИЛ-2. Центрифуга пластины при 1000 х г и 32 ° С в течение 1 часа.
- Через 24 часа собирают Т-клетки, с помощью пипетки и центрифуге при 350 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мл вируса PG13 от стадии 2.7, и 1 мл RPMI среде, дополненной 200 МЕ / мл рИЛ-2. Повторите этот шаг для в общей сложности 6 Infectионов.
Примечание: Количество инфекций должна быть оптимизирована в зависимости от титра вируса, полученного путем упаковки клеточной линии. При необходимости, проход Т-клетки путем удаления 20-30% клеток, каждый день, чтобы предотвратить чрезмерно быстрый рост. - 24 ч после последней инфекции, Т-клетки собирают пипеткой и центрифуге при 350 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в RPMI среде с 100 МЕ / мл рИЛ-2 для дальнейшей культуры.
- Через 2-3 дня после шага 3.5, пятно Т-клеток с HLA мультимеру при 4 ° С в течение 30 мин, а затем анти-CD3 человека и сорецептора моноклональные антитела (МАт) при 4 ° С в течение 15 мин. Анализ с помощью проточной цитометрии. Используйте ненужную мультимер и / или untransduced клетки в качестве отрицательного контроля (Рисунок 1 - 3) 19.
- Если введенный ориентированных hemichain является TCRα цепь, анализировать использование Vβ из De Novo мультимеров положительных клеток с использованием коммерчески доступного Vβ специфичную панели антител с помощью проточной цитометрии 20.
4. Клонирование De Novo TCR Counter-hemichains
- Сортировка De Novo мультимеров положительное населения на этапе 3.6 с помощью проточной при содействии сортировки клеток.
- Изолировать РНК из отсортированных Т - клеток с использованием кислоты гуанидина тиоцианата-фенол-хлороформ методом экстракции 21,2 2.
Примечание: РНК можно хранить при температуре -80 ° С, но их следует использовать для генерации кДНК как можно скорее. - Обобщить библиотеки кДНК из экстрагированной РНК с использованием коммерчески доступных наборов обратной транскриптазы-PCR в соответствии с протоколом производителя 23,24.
- Если клонирование TCR & beta; встречные цепи, дизайн ген Vβ и TCR & beta; константная область специфических праймеров, как определено на этапе 3.7, и клонировать полнометражных гены TCR & beta; как описано в пунктах 1.3-1.9. См шаг 4.5, если встречное цепь TCRα, в противном случае переходите к шагу 5.1.
- Коммерчески доступные Vα-специфические антитела ограничены, таким образом, использование гена Vα не можетопределяется с помощью проточной цитометрии. Клон TCRα контр-цепи с помощью 5'-быстрой амплификации концов кДНК (RACE) 25, с использованием коммерчески доступного 5 'RACE комплекты 6.
- Обобщить 5 'RACE совместимую кДНК из РНК, выделенной на этапе 4.2 в соответствии с протоколом производителя.
- Выполнить 1 - й раунд ПЦР , как описано в таблице 2.
- Проводят электрофорез продукта ПЦР и элюции полосу примерно 1100 бод, как описано в пункте 1.2.
- Выполнение 2 - го тура ПЦР , как описано в таблице 3, с использованием 1 - й тур ПЦР - продукт в качестве матрицы.
Примечание: Последовательности праймеров , показанные под таблице 3 были разработаны для клонирования в EcoRI и NotI расщепляли PMX вектор. - Проводят электрофорез продукта ПЦР и элюции полосу примерно 1000 бод, как описано в пункте 1.2.
- гены клонов TCRα в EcoRI и NotI расщепляли вектор PMX и пуриFY плазмид, как описано в пунктах 1.5-1.9.
5. воссоздании новый антиген-специфические TCR Клоны
Примечание: Культура Jurkat 76 клеток и последующие клеточные линии в RPMI среде с добавлением 10% FCS и 50 мкг / мл гентамицина. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% CO 2 между всеми шагами.
- Трансдукции Jurkat 76 ячеек 26 (или эквивалент TCR - / - Т - клеточной линии человека) с центрической TCR hemichain с использованием вируса 293GPG , полученного на стадии 2.3. Для Jurkat 76 семян 5 х 10 4 клеток на лунку в 24-луночный планшет с 1 мл вируса и 1 мл RPMI среды. Центрифуга пластины при 1000 х г и 32 ° С в течение 1 часа.
- 24 ч после заражения, собирают hemichain трансдуцированная Jurkat 76 клеток с помощью пипетки и центрифуги при 350 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и ресуспендируют в свежей среде RPMI для дальнейшей культуры.
- Очищают трансдуцированных клетки, если hemichain молекулярно помечены 2-3 дня после того, как шаг 5.2, с помощью окрашиванияING с флуорофором , конъюгированные анти-NGFR мАт с последующим потоком при содействии или магнитно-помощь сортировки клеток ( по желанию) 27.
- Следующие шаги 2.1 до 2.3, производят вирус 293GPG, кодирующий ТКР встречное цепь, клонированного из шагов 4.4 или 4.5.
- Для того, чтобы полностью восстановить ТКР, трансдукции Т-клеточной линии, стабильно экспрессирующие TCR центрическую hemichain генерируется на этапах 5.1-5.3 с использованием вируса с шага 5.4. Выполните трансдукции, как описано в пунктах 5.1-5.2.
- Очищают CD3 + трансфектантов с помощью анти-CD3 магнитной помощь сортировкой клеток в соответствии с протоколом производителя, через 2-3 дня после шага 5.5 27.
- Для проверки антигенную специфичность, испачкать трансфектантов, выражающие клонотипическим ТКО, состоящие из Центрическая TCR hemichain сопряженным с различными противоионами цепями, с анти-CD3 и / или моноклональными сорецептора и HLA мультимеру, 3-5 дней после очистки CD3. Анализ клеток с помощью проточной цитометрии (рис 4 - 5) 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Без предварительного знания которых hemichain является цепью ориентированных, цепь TCRα и TCR & beta ; должен быть отдельно клонировали и трансдуцированная в периферической крови Т - клеток, что и было сделано в случае HLA-А24 / WT1 реактивная TAK1 TCR (рисунок 1). Трансдукция TAK1β дали заметно более высокую частоту антиген-специфических Т-клеток. С другой стороны , трансдукция не-центрической hemichain не уступал De Novo мультимеров положительных Т - клеток, как видно с TAK1α цепи (рис 1). В ходе анализа, ворота на NGFR + клеток , если ген TCR был помечен специфически анализировать трансдуцированных клетки (рис 1 - 2). С другой стороны, единственный ориентированный hemichain может быть трансдуцированных , если он , как известно, доминирует, например SIG35α и инвариантные цепи Vα24 TCRα (рисунок 2 и 3). Т-клетки, специфические для соответствующего cognпоел антиген повышенной частоты при трансдукции центрического TCRα hemichain. (Рисунок 2 - 3). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что введение центрической TCRα или TCR & beta ; hemichain в периферических Т - клеток крови может генерировать De Novo ТКО с антигеном специфичности интересов.
Антиген-специфической популяции можно сортировать по проточного помощь сортировки клеток и TCR hemichains может быть клонирован, как описано в разделе 4. Протокол клонотипическим TCR противоионы цепи могут быть индивидуально водостойких на Т-клеточной линии, стабильно экспрессирующие Центрическая hemichain. Jurkat 76 трансфектантов, выражающий недавно клонирован уникальные ТКО из TAK1β или SIG35α ориентированных hemichain трансдуцированных Т - клеток, обладают различной авидность к соответствующему родственным антигеном, как определено HLA / пептид мультимеров окрашивания 5,6. В частности, мы были в состоянии изолировать De Novo TCRα контр-цепи тшляпа , когда в паре с TAK1β окрашивали либо более низкой или более высокой интенсивности антигеном комплекса WT1 , чем родительский TAK1αβ спаривания (рисунок 4). Точно так же, SIG35α в паре с уникальными противоионов цепями признаны HLA-A2 / MART1 с умеренной до высокой авидности (рисунок 5). SIG35α был клонирован независимо от гетеродимера TCRαβ 5, поэтому родительская спаривание для этого hemichain был недоступен для сравнения. Важно отметить, что эти данные указывают на то, что можно модулировать сродство к антигену-мишени путем спаривания Центрическая hemichain с различными противоионами цепями.
Рисунок 1:. TAK1β в качестве примера HLA-ограниченных TCR & beta ; ориентированных hemichain TCRα или TCR & beta ; hemichains в HLA-А24 / WT1 реактивная TAK1 TCR была помечена с усеченным нервного фактора роста RecePTOR (ΔNGFR), и индивидуально трансдуцированная к периферической крови Т-клеток. Трансфектанты окрашивали PC5-конъюгированными анти-CD8 (133x разбавленный) и FITC-конъюгированные анти-NGFR (20x разбавленный) моноклональные антитела (мАт), и указанный по HLA-А24 мультимеров (5 мкг / мл), после два раза антиген-специфических стимуляция. испытывались Всего 6 доноров. Все данные были закрытого типа на клетках NGFR +. Рисунок перепечатана с разрешения исследование 6. Щелкните здесь , чтобы посмотреть увеличенное этой фигуры.
Рисунок 2:. SIG35α как пример ограниченного по HLA-TCRα центрической hemichain SIG35α TCRα цепи с меткой ΔNGFR, или одна метка, была трансдуцированных в периферической крови Т - клеток. Трансфектантов окрашивали PC5-соnjugated анти-CD8 (133x разбавленный) и FITC-конъюгированные анти-NGFR (20x разбавленный) мАт, и указывается HLA-A2 многомера (8 мкг / мл). испытывались Всего 4 доноров. Все данные были закрытого типа на клетках NGFR +. Рисунок перепечатана с разрешения ссылка 5 (Copyright 2015. Американская ассоциация иммунологов, Inc.). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Инвариантная естественные киллеры T (iNKT) клеточного рецептора Vα24 (Vα24i) в качестве примера CD1d ограниченным TCRα центрической hemichain Vα24i TCRα цепь трансдуцированная к периферической крови Т - клеток. Трансфектанты окрашивали FITC-конъюгированные анти-CD3 (20x разбавленный) монАТ и указали CD1d многомера (5 мкг / мл). Разгрузка CD1d моlecules были получены из клеток НЕК293 и присутствующих эндогенных неизвестных самостоятельных липидов. iNKT TCR определяется признанием CD1d представляющего альфа-GalCer или его аналог PBS-57. испытывались Всего 4 доноров. Рисунок перепечатана с разрешения автора из ссылки 7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель TCRα контр-цепи клонированной из TAK1β трансдуцированных Т - клеток TCRα клоны T262, A262, A186, A133 и Т4 были клонированы из HLA-A24 / WT1 мультимеров положительные TAK1β трансдуцированных периферических Т - клеток, и по отдельности восстанавливают на клетках Jurkat 76 клеток. экспрессирующих CD8 вместе с цепью TAK1β. Трансфектантов окрашивали PC5-конъюгированными анти-CD8 МКА (133x разбавленный) и указали HLA-A24мультимеров (5 мкг / мл). Данные показаны два независимых эксперимента. Столбики ошибок указывают диапазон. Рисунок перепечатана с разрешения исследование 6. Щелкните здесь , чтобы посмотреть увеличенное этой фигуры.
Фигура 5: Представитель TCR & beta ; противоионы цепи клонировали из SIG35α трансдуцированных Т - клетки TCR & beta ; клоны 413, 523, 788, 1086, 794, и 830 , были клонированы из HLA-A2 / MART1 мультимеров положительный SIG35α трансдуцированных периферических Т - клеток, и по отдельности восстанавливают на клетках Jurkat. 76 клетки, экспрессирующие CD8, наряду с SIG35α цепи. DMF5 был ранее клонировали с высоким сродством ТКР распознавания HLA-A2 / MART1. Трансфектантов окрашивали PC5-конъюгированными анти-CD8 МКА (133x разбавленный) и указывается HLA-A2 мультимерной (2 мкг / мл). Данные являются репрезентативными двух независимых экспериментов. Столбики ошибок указывают диапазон. Рисунок перепечатана с разрешения ссылка 5 (Copyright 2015. Американская ассоциация иммунологов, Inc.). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1:.. Установка для рМХ вектора пищеварения Реагенты и соответствующие объемы приведены Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Таблица 2: Установка для 1 - го раунда 5 'RACE ПЦР. Реагенты и соответствующие объемы, параметры ПЦР, и последовательность праймера показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Таблица 3: Настройка для 2 - й раунд 5 'RACE PCR Реактивы и соответствующие объемы, параметры ПЦР и последовательности праймеров показаны.. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первое требование для успешного применения этого метода является достижение достаточной эффективности трансдукции первичных Т-клеток с hemichain интереса. По нашему опыту, сочетание использования PG13 в линии упаковки клеток и PMX в качестве ретровирусных вектора приводит к стабильной и эффективной экспрессии введенного гена в первичных Т-клеток человека. PG13 упаковочные клетки могут быть одноклеточные клонировали, чтобы выбрать для упаковки клеток с высоким титром для повышения эффективности трансдукции. Кроме того, увеличение числа Т-клеток также требуется для высокой эффективности трансдукции ретровирусом. В описанном протоколе стимуляция с растворимым анти-CD3 мАт ОКТ3, наряду с высокой концентрацией рИЛ-2, обеспечивает необходимые сигналы активации, чтобы вызвать деление клеток. Моноциты необходимы для стимулирующего емкости растворимого OKT3, вероятно, через связывание с рецепторами Fc. Таким образом, основная масса РВМС, а не очищенный Т-клетки, требуется для этого конкретного протокола стимуляции. TКлетки должны быть выращены в среде RPMI с добавлением человеческой сыворотки для оптимальных результатов эксперимента. Все остальные клетки, описанные здесь, могут быть выращены в присутствии эмбриональной сыворотки теленка.
Во- вторых, De Novo , сгенерированные антиген-специфические ТКО , выражающие клетки должны быть обнаружены. Для некоторых hemichains TCR, таких как TAK1β, De Novo TCR , экспрессирующие клетки могут быть обнаружены только после стимуляции антиген-представляющих клеток антиген-импульсный (АРС). Таким образом, если антиген-специфические ТКР не обнаруживаются сразу после трансдукции центрической hemichain, они могут быть обнаружены после расширения АРС. Следует отметить , что трансдукция не-центрической hemichain не уступал De Novo антиген-специфических Т - клеток даже после того, как антиген-специфического расширения с БТРов, как видно с hemichain TAK1α (рисунок 1). В наших исследованиях, HLA мультимеры используются для обнаружения, однако, это может не быть недоступны для некоторых ТКР, особенно HLA класса II ограниченного ТКСs. В качестве альтернативы можно обнаружить функциональные Т-клеточные ответы. Hemichain трансдуцированных Т-клетки могут быть стимулированы с АРС импульсными с представляющим интерес антигеном. Автомобиль-импульсно АРС и untransduced Т-клетки могут быть использованы в качестве контрольных. Реагирование Т-клетки могут быть обнаружены с помощью повышающую регуляцию маркеров активации поверхности, таких как CD107a, CD154, CD137 или.
И, наконец, важно, чтобы подтвердить, что клонированные встречные цепочки действительно фактически признают интерес антиген, когда в паре с центрической hemichain. Это особенно важно , когда ориентированные hemichain является TCR & beta ; и встречные цепи TCRα, так как аллельного исключения генов TCRα негерметичен , и предполагается , что значительная часть периферических Т - клеток αβ выражают более одного TCRα цепь 28. Реакционная способность может быть подтверждена с мультимеров окрашивания или измерения функционального ответа после стимуляции с помощью БТРов, представляющих родственный антиген.
Один limitatiна этой техники состоит в том , что не каждый TCR будет сочинить центрическую hemichain, так как TCRα и TCR & beta ; способствуют сравнительно антигену признание в некоторых случаях 3. Таким образом, периферические Т - клетки трансдуцированных с такими не ориентированных hemichains не может дать De Novo антиген-специфические ТКО.
Тем не менее, этот метод представляет собой концептуальную продвижение при традиционном подходе к клонированию ТКО, где оба TCRα и TCR & beta ; гены должны быть клонированы и правильное сопряжение должно быть обеспечено 29,30. По нашему технике, спаривание между hemichains больше не является основной проблемой, и только одна из цепей TCR должен быть клонированы, при условии, что другая фиксирована. В дополнение к HLA класса I или CD1d ограниченным ТКР, описанный способ также может быть применен к изоляции HLA класса II-ограниченных ТКР для генной терапии TCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
