Introduction
在中枢神经系统中的体内模型(CNS)的疾病需要有效递送的外源物质,如药物,病原体,或外来体,进入大脑。因此,一个理想的递送方法应引起创伤小的动物,保护神经元网络的完整性,并在大脑1达到高的物质的浓度。
本地物质递送的若干外科手术方法已被描述,包括内护套,脑内,脑室内和注射或植入2,3,4,5。这些方法,但是,被认为是创伤至CNS,并且只允许感兴趣的物质的量低的施用。此外,已经提出,外源物质可以通过脑脊液6被快速移除7。全身递送方法,如口服,肺部,皮下,和静脉内途径,在动物模型中比较常用的,尽管它们在物质递送至CNS表现出低效力,由于由其他器官8,9摄取。因此,分娩这些路线需要提升的剂量给药物质,增加副作用和毒性10,11的风险。
这里,我们描述了小鼠输注显微技术,其有效地提供了物质直接进入通过内部颈动脉的大脑。除了靶向递送至CNS,该技术不绕过正常的生理障碍,因此是biologica高度相关的涉及治疗剂或病原体进入大脑的通路升进程。
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Protocol
涉及以下协议的程序已被批准的迈阿密机构动物护理和使用委员会的大学(IACUC)。此外,所有的手续正在由协会为实验动物国际评估和认可委员会(AAALAC)认证的工厂进行。
1.小鼠外科手术的准备
- 麻醉小鼠用异氟烷与氧混合,用实验室麻醉系统。在在2升4-5%之间,氧流量设定使用异氟醚/ min的商用机上(见材料表)。动物转移到手术表面,在立体显微镜下,并用鼻锥维持麻醉( - 以2升/分钟2.5和氧气流中使用异氟烷设置为1.5)。
- 确保鼠标的呼吸率大约为1 - 2呼吸/秒,而没有喘气。此外,确保动物不会出现晶须刺激的反应和踏板řeflex(趾捏)。监控呼吸率和精力的手术过程中,至少每5分钟。遵循特定的机构动物护理和使用委员会和兽医准则啮齿类动物麻醉监测。
- 应用以防止干燥使用无菌拭子上的每个眼用润滑剂的下降。推荐的抗炎和镇痛以减轻不适施用。
- 与动物躺在它的后面,保持用鼻锥麻醉。
- 经擦拭的面积与70%乙醇和洗必泰三次清洁动物的颈部。用剃刀(下文详述)刮胡子动物的手术区域。
2.解剖颈总动脉(CCA)
- 立体显微镜下完成整个显微操作。使用手术剪刀和镊子颈部执行浅正中切口,从胸骨上方低于T他颚(约3到4厘米)。
- 使用镊子小心分离脂肪和结缔组织,以暴露气管。
- 放置在鼠标的颈后枕头(圆形物体,约0.5厘米,直径),以延伸颈部,进一步暴露的区域。
- 单独使用一个组织牵开器或钩组织。
- 上气管的动物的左侧,小心tweeze相距结缔组织以露出左CCA。
- 使用镊子小心地取出所有的结缔组织,显露CCA分叉和外部和内部颈动脉的开始。
3. CCA的准备输液物质
- 将下颈外动脉尼龙线(约1厘米的每一个)的两段(ECA),使用镊子。
- 将尽可能在ECA的最高点的永久性结。
- 在最低点可能在ECA的,马上以上CCA分叉,地方一个可移动的结。相比上结这个结要宽松。
- 用血管夹关闭CCA,以尽可能低的点。
- 收用血管夹颈内动脉(ICA)。
- 采用显微弹簧剪刀执行在ECA(约2mm)的一小截,两节之间。
4. 通过 ICA物质输液
- 组装的输液系统。附上毛细管的6英寸(理想尺寸2.5毫米×1.2毫米),含有250微升的物质的结核菌素注射器要输注(药物,病原体,细胞外囊泡,等等),并轻轻插入毛细管尖端进入执行切口在步骤3.6。
- 继续,直到它到达分叉和剪辑关闭CCA之间的中点滑下毛细管。
- 阕较低ECA结。验证结宽松足以让毛细血管的流动性和拧紧,以防止leakinG。
- 从ICA删除片段。
- 轻轻施加压力的注射器活塞允许物质输注每秒大约10微升。
5.后输液过程
- 放置夹回到了ICA。
- 轻轻取下毛细管。
- 完全牵制下ECA结。
- 取下ICA和CCA剪辑。
6.切口关闭和术后护理
- 删除拉钩或组织挂钩和枕头。
- 用无菌生理盐水清洗缝合区。
- 关闭使用尼龙线/针和镊子的切口。
- 施用抗炎和镇痛,以减轻术后不适。
- 将动物笼放置在加热垫至少1小时,显示器恢复。
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Representative Results
这里所描述的小鼠输注显微外科技术是非常灵活,并已用于传递不同的物质直接进入脑,包括肿瘤细胞中的脑转移形成1,12是代表模型的交付。
这种技术也适用于评估在CNS不同病原体的病理方面。在HIV感染的小鼠模型,输液手术被用于直接注射的病毒颗粒进入CCA。我们发现,手术后7天,CNS艾滋病毒呈阳性实时PCR。另外,同侧半球感染是6-10倍以上对侧半球( 图2)更高。
这里所描述的输液手术的另一种合适的方法是提供外囊泡(的ECV),主要是外来体,进入中枢神经系统。 图3显示了CD63,对于外来的标记的在输注后的小鼠24小时的同侧脑存在下,标记有绿色荧光蛋白(GFP)。
图1: 经颈内动脉灌注的示意图。在插入(a)和(b)描述的上部和下部结,分别的定位; (c)示在ECA的小切口,通过该毛细管被插入(灰线)。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图2:HIV 检测采用Real-time PCR检测经颈内动脉灌注病毒后。横道从小鼠后7天通过左侧颈内动脉输注收获平均病毒DNA水平。误差线描绘标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3: 通过颈内动脉小鼠脑科描绘了GFP标记的CD63,外来体标记,输液的ECV后的免疫荧光。该代表图像描绘了CD63表达的ECV(绿色)相关的小鼠大脑微血管。比例尺:50微米。得到=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里所描述的输液显微已被证明是在提供各种生物特征外源物质进入中枢神经系统,以防止整个身体1,12不需要的传播非常成功。血 - 脑屏障的破坏为几种中枢神经系统有关的疾病的病理学特征;因此评估外源物质与血脑屏障的关系是非常重要和兴趣。
提出这种手术模型导致有限创伤给动物,并且具有非常低的死亡率1,12相关联。此外,该过程不与CNS功能或脑血流1,12干扰。此过程的最关键方面是在ECA执行正确的切口,这应该只允许所述毛细管的插入。更宽的削减将导致该物质渗漏被注入,需要在对面的站点的另一个ECA手术。为了防止这种情况,毛细管应该具有比切口更大的直径,并且也应该有一个尖锐的边缘,以便通过动脉以促进其入口。至于技术方面,经过全面培训的人员能够在20分钟内完成这个手术。
该技术的主要局限是输注的可能性只有一次通过相同的ICA。重复物质递送到中枢神经系统,微创需要使用与先前已描述这里描述1 .The技术具有以协助在血脑屏障中的新的正和负的相互作用的研究中,以及提供的病原体的潜在的容器,药物和生理剂进入大脑。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
Closing suture | VWR | 95057-036 | |
Isoflurane | Piramal | ||
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
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