טכניקה אינפוזיה Microsurgery עכבר למשלוח ואלכוהול ממוקד לתוך מערכת העצבים המרכזית Published: January 31, 2017 doi: 10.3791/54804

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Ana R. Leda¹, Levy Dygert¹, Luc Bertrand¹, Michal Toborek^1,2

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, Miller School of Medicine, University of Miami, ²The Jerzy Kukuczka Academy of Physical Education

Introduction

במודלים vivo של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מחלות דורשים משלוח יעיל של חומרים אקסוגניים, כגון תרופות, פתוגנים, או exosomes, לתוך המוח. לכן, שיטת הצגה אידיאלית צריכה לגרום טראומה מינימאלית לבעל החיים, לשמור על שלמותה של הרשת העצבית, ולהשיג ריכוזי חומר גבוהים במוח ^1.

מספר שיטות כירורגיות של משלוח חומר מקומי תוארו, כולל תוך-נדן, תוך-מוחי, וזריקות תוך חדרים או שתלים ^{2, 3, 4, 5.} גישות אלה, עם זאת, הנחשבים טראומטיות אל מערכת העצבים המרכזי, ולאפשר מתן בהיקפים נמוכים בלבד של החומר של עניין. יתר על כן, הוצע כי חומרים אקסוגניים ניתן להסיר במהירות על ידי הנוזל השדרתי ⁶ 7 כאשר הטכניקות הנ"ל מועסקות. שיטות משלוח מערכתיות, כגון פה, ריאות, תת עורית, ומסלולים תוך ורידים, נמצאות בשימוש נפוצה יותר במודלים של בעלי חיים, אם כי הם מפגינים אפקטיביים נמוכים באספקת החומרים אל מערכת העצבים המרכזי, בשל הספיגה ידי גופים אחרים ^{8, 9.} לכן, המסלולים האלה של משלוח דורשים מנות גבוהות של חומרים המנוהלים, מעלים את הסיכון של תופעות לוואי רעיל ^{10, 11.}

כאן אנו מתארים טכניקה המיקרו-כירורגיה עירוי עכבר, אשר למעשה מספקת חומרים ישירות לתוך המוח דרך עורק התרדמה הפנימי. בנוסף למיקוד המסירה של מערכת העצבים המרכזית, טכניקה זו אינה לעקוף מחסומים פיזיולוגי ולכן הוא רלוונטי מאוד Biologicaתהליכי l המעורבים הקטעים של רפויים או פתוגנים לתוך המוח.

Protocol

הנהלים מעורבים בפרוטוקול הבא אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים מוסדיים מיאמי ועדת שימוש (IACUC). בנוסף, כל ההליכים מתנהלים במתקנים שאושרו על ידי האגודה הערכה וההסמכה של הבינלאומי טיפול בבעלי חיים מעבדה (AAALAC).

1. הכנת עכברים לכירורגיה

1. להרדים עכבר עם isoflurane מעורבב עם חמצן, באמצעות מערכת הרדמת מעבדה. השתמש isoflurane בשעה מוגדר בין 4-5% ותזרים חמצן 2 ליטר / דקה על מכונת המסחרי (ראה לוח חומרים). מעבירים את החיה על פני השטח ניתוח, תחת סטראו, ולקיים הרדמה באמצעות חרטומו (להשתמש isoflurane הגדרת 1.5 - תזרים 2.5 וחמצן ב 2 ליטר / דקה).
   1. להבטיח שמירה על קצב עכבר הנשימה הוא סביב 1 - 2 נשימה / sec בלי להתנשף. בנוסף, להבטיח כי בעל החיים לא להפגין תגובה לגירוי שפם הדוושה reflex (קמצוץ הבוהן). צג הנשימה שיעור ומאמץ במהלך הניתוח, לפחות כל 5 דקות. עקוב ספציפי מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת שימוש והנחיות וטרינרים לניטור הרדמה מכרסמת.
2. החל ירידה של חומר סיכה עיניים על כל עין באמצעות ספוגית סטרילית על מנת למנוע יובש. מנהל של אנטי דלקתי משכך כאבים כדי להקל נוחות מומלצת.
3. עם החיה שוכבת על גבה, לשמור על הרדמה באמצעות חרטומו.
4. נקה את אזור הצוואר של החיה על ידי מנגב את האזור שלוש פעמים עם 70% ו chlorhexidine אתנול. לגלח את אזור הניתוח של החיה באמצעות סכין גילוח (כמפורט להלן).

2. דיסקציה של עורק התרדמה המשותף (CCA)

1. בצע את ההליך המיקרו-כירורגיה כולו תחת סטראו. בעזרת מספריים כירורגיים מלקחיים לבצע חתך קו האמצע רדוד בצוואר, מלמעלה עצם החזה אל מתחת ל tהוא הלסת (כ -3 עד 4 ס"מ).
2. בעזרת מלקחי שומן בקפידה נפרד ורקמות חיבור לחשוף את קנה הנשימה.
3. מניחים כרית (חפץ עגול, כ -0.5 ס"מ קוטר) על החלק האחורי של הצוואר של העכבר כדי להאריך את הצוואר, עוד חשיפת האזור.
4. הפרד את הרקמות או באמצעות מפשק רקמות או ווים.
5. בצד שמאל של החיה של קנה הנשימה, בזהירות למרוט לגזרים את רקמת החיבור לחשוף את המרכז לאמנות עכשווית שמאל.
6. בעזרת מלקחיים להסיר את כל רקמת החיבור בזהירות לחשוף הסתעפות המרכז לאמנות העכשווית, והתחילה הוא עורקי הראש חיצוניים ופנימיים.

3. הכנה של CCA עבור עירוי ואלכוהול

1. הכנס שני מגזרי ניילון תפר (כ 1 סנטימטר כל אחת) תחת עורק ראשי חיצוני (ECA), באמצעות מלקחיים.
2. מניח פקעת קבעה בנקודה הגבוהה ביותר האפשרית של ECA.
3. בנקודה הנמוכה ביותר האפשרית של ECA, מיד מעל הסתעפות המרכז לאמנות עכשווית, מקוםקשר נשלף. קשר זה צריך להיות משוחרר לעומת הקשר העליון.
4. סגור את CCA באמצעות קליפ כלי, בנקודה הנמוכה ביותר האפשרית.
5. סגור את עורק התרדמה הפנימי (רשפ"ת) באמצעות קליפ כלי.
6. מספריים האביב microdissection באמצעות לבצע חתך קטן ECA (כ -2 מ"מ), בין שני הקשרים.

4. עירוי ואלכוהול באמצעות הרשפ"ת

1. להרכיב מערכת אינפוזיה. צרף 6 אינץ 'של צינור נימים (מידות אידיאלית: 2.5 מ"מ x 1.2 מ"מ) כדי מזרק טוברקולין המכיל 250 μl של החומר להיות חדור (תרופות, פתוגנים, שלפוחית ​​תאית, בין יתר) והכנס את קצה הנימים בעדינות לתוך החתך מבוצע בשלב 3.6.
2. המשך להחליק במורד הנימים עד שהוא מגיע נקודת אמצע בין ההסתעפות ואת הקליפ סגירת CCA.
3. לכבול את קשר ECA הנמוך. ודא כי הקשר הוא רופף מספיק כדי לאפשר נזילות נימים חזקות מספיק כדי למנוע דולףז.
4. הסר קליפ מן ICA.
5. בעדינות להפעיל לחץ על בוכנת מזרק עירוי החומר המאפשר בכ 10 μl לשנייה.

5. נהלי אינפוזיה הודעה

1. מקום קליפ בחזרה על ICA.
2. הסר בעדינות את צינור נימי.
3. לכבול את קשר ECA הנמוך לחלוטין.
4. הסר קליפים מתוך הרשפ"ת ובין CCA.

סגירת חתך 6. שלאחר ניתוח טיפול

1. סור ווים מפשקים או רקמות כרית.
2. אזור תפר נקי באמצעות תמיסת מלח סטרילית.
3. סגירת החתך באמצעות ניילון תפר / מחט מלקחיים.
4. נהל אנטי דלקתי משכך כאבים כדי להקל אי נוחות לאחר הניתוח.
5. מניחים חיה בכלוב מונח על כרית חימום לפחות התאוששות 1 hr וצג.

Representative Results

הטכניקה המיקרו-כירורגיה עירוי העכבר המתואר כאן הוא מאוד תכליתי ויש בו נעשה שימוש כדי לספק חומרים שונים ישירות לתוך המוח, כולל אספקה של תאים סרטניים במודל נציג של היווצרות גרורות במוח ^{1, 12.}

טכניקה זו מתאימה גם להעריך את ההיבטים פתולוגית של פתוגנים שונים במערכת העצבים המרכזית. במודל עכברים של הידבקות ב- HIV, ניתוח העירוי שמש להזריק חלקיקים נגיפיים ישירות לתוך CCA. מצאנו כי 7 ימים לאחר הניתוח, מערכת העצבים המרכזית הייתה חיובית ל- HIV על ידי PCR בזמן אמת. יתר על כן, הזיהום בחצי הכדור ipsilateral היה 6-10 מקפל גבוה יותר מאשר בחצי הכדור הנגדי (איור 2).

גישה מתאימה נוספת של ניתוח אינפוזיה המתואר כאן היא לספק שלפוחית ​​תאית (ECVs), בעיקר exosomes, לתוך מערכת העצבים המרכזי. איור 3 מציג את הנוכחות של CD63, סמן exosomes, שכותרתו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) במוח ipsilateral של עכבר 24 שעות לאחר עירוי.

איור 1: ייצוג סכמטי של עירוי דרך עורק התרדמה הפנימי. ב הכנס (א) ו- (ב) מתאר את הלוקליזציה של קשרים העליונים ותחתונים, בהתאמה; (ג) מייצג את החתך הקטן ECA, שדרכו צינור נימי מוכנס (קו אפור). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

4804fig2.jpg "/>
איור 2: HIV זיהוי על ידי PCR בזמן אמת אחרי עירוי ויראלי דרך עורק התרדמה הפנימי. ברים לציין רמות HIV DNA ממוצעות שנקטפו מעכברים 7 ימים שלאחר עירוי דרך עורק התרדמה הפנימי מהשמאל. ברי שגיאה מתארים סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: Immunofluorescence של עכבר המוח סעיף המתאר GFP-tagged CD63, סמן Exosome, לאחר עירוי ECVs דרך עורק התרדמה הפנימי. דימוי הנציג מתאר microvessel במוח עכבר קשור ECVs להביע CD63 (ירוק). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר.לקבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

המיקרו-כירורגיה העירוי המתואר כאן כבר הוכיח את עצמו מאוד מוצלח ומספק חומרים אקסוגניים של תכונות ביולוגיות שונות לתוך מערכת העצבים המרכזי, מניעת הפצה רצויה בכל הגוף ^{1, 12.} שיבוש של מחסום דם מוח הוא מאפיין פתולוגי של מחלות כמה הקשורות במערכת העצבים המרכזית; ולכן בהערכת היחסים של חומרים אקסוגניים עם המחסום שבין הדם למוח היא בעלת חשיבות ועניין עיקריים.

מודל ניתוח זה מוצג גורם טראומה מוגבלת לבעלי החיים והיא קשורה עם תמותה ¹ נמוכה ^{מאוד, 12.} זאת ועוד, הנוהל אינו מפריע לתפקוד מערכת העצבים המרכזי או זרימת דם במוח ^{1, 12.} ההיבט הקריטי ביותר של הליך זה הוא לבצע את החתך הנכון ECA, אשר צריך להרשות רקהחדרת צינור הנימים. חתך רחב יותר יגרום דליפה של החומר להיות חדורה, המחייב עוד ניתוח ECA באתר ההפך. כדי למנוע מצב זה, צינורות הנימים צריכים להיות בקוטר גדול יותר לחתוך, ואת צריך להיות גם קצה חד על מנת להקל את הכניסה דרך העורק. בהיבט הטכני, כוח אדם מאומן היטב הוא מסוגל לבצע את הניתוח הזה תוך 20 דקות.

המגבלה העיקרית של הטכניקה הזו היא האפשרות של עירוי רק פעם אחת דרך אותו ICA. למסירת חומר חזרה לתוך מערכת העצבים המרכזי, כלי microport צריך לשמש ו תואר בעבר ¹ טכניקת .the המתוארת כאן יש הפוטנציאל לסייע במחקרים על אינטראקציות חיוביות ושליליות חדשים בתוך BBB, כמו גם לספק פתוגנים תרופות, וסוכנים פיסיולוגיים לתוך המוח.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia instrument	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine Science Tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine Science Tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine Science Tool	00109-11
Spring scissors	Fine Science Tool	15000-08
Nylon suture	Braintree Scientific	SUT-S 104
Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.)	Braintree Scientific	MRE01050
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherScientific	50-121-8005