Introduction
Nei modelli in vivo del sistema nervoso centrale (SNC) malattie richiedono un efficace erogazione di sostanze esogene, come la droga, agenti patogeni, o esosomi, nel cervello. Pertanto, un metodo di distribuzione ideale dovrebbe causare un trauma minimo per l'animale, preservare l'integrità della rete neuronale, e raggiungere elevate concentrazioni di sostanza nel cervello 1.
Sono stati descritti diversi metodi chirurgici di consegna sostanza locale, tra intra-guaina, intracerebrale, e iniezioni intraventricolare o protesi 2, 3, 4, 5. Questi approcci, tuttavia, sono considerate traumatica al SNC, e permettono la somministrazione di solo bassi volumi della sostanza di interesse. Inoltre, è stato suggerito che le sostanze esogene possono essere rapidamente rimossi dal liquido cerebrospinale 6 7 quando le tecniche sopra menzionate sono impiegati. Metodi di consegna sistemici, come ad esempio per via orale, polmonare, per via sottocutanea, endovenosa e, sono più comunemente utilizzati nei modelli animali, anche se essi mostrano scarsa efficacia nel fornire le sostanze al sistema nervoso centrale, a causa di assorbimento da parte di altri organi 8, 9. Pertanto, queste rotte di consegna richiedono dosi elevate di sostanze amministrati, aumentando il rischio di effetti collaterali e la tossicità 10, 11.
Qui, descriviamo una tecnica microchirurgica infusione del mouse, che offre in modo efficace le sostanze direttamente nel cervello attraverso l'arteria carotide interna. Oltre al targeting la consegna al CNS, questa tecnica non bypassare normali barriere fisiologiche ed è quindi molto importante per biologicaprocessi l coinvolti nei passaggi terapie o agenti patogeni nel cervello.
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Protocol
Le procedure coinvolte nel seguente protocollo sono stati approvati dalla University of Miami Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC). In aggiunta, tutte le procedure sono state condotte in impianti autorizzati dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento degli animali da laboratorio Care International (AAALAC).
1. Preparazione di topi per Chirurgia
- Anestetizzare topo con isoflurano mescolato con l'ossigeno, utilizzando un sistema di laboratorio anestesia. Utilizzare isoflurano a stabilire tra il 4-5% e il flusso di ossigeno a 2 L / min sulla macchina commerciale (vedi Materiali Tavolo). Trasferire l'animale alla superficie un intervento chirurgico, sotto uno stereomicroscopio, e sostenere l'anestesia con un cono (utilizzare l'impostazione 1,5 isoflurano - 2,5 e ossigeno flusso a 2 L / min).
- Assicurarsi che la frequenza respiratoria del mouse è di circa 1 - 2 respirazione / sec, senza boccheggiare. Inoltre, assicurarsi che l'animale non presenta reazione stimolazione baffi e pedale reFlex (tep pizzico). Monitorare la frequenza respiratoria e lo sforzo durante l'intervento chirurgico, almeno ogni 5 min. Seguire specifica Istituzionale Animal Care e del Comitato Usa e le linee guida per il monitoraggio veterinari roditore anestesia.
- Applicare una goccia di lubrificante oftalmica su ciascun occhio con un tampone sterile per prevenire la secchezza. Si raccomanda somministrazione di anti-infiammatori e analgesici per alleviare il disagio.
- Con l'animale sdraiato sul dorso, mantenere l'anestesia con un cono di naso.
- Pulire collo dell'animale strofinando la zona tre volte con etanolo al 70% e clorexidina. Radere zona chirurgia dell'animale utilizzando un rasoio (descritto di seguito).
2. La dissezione della carotide comune (CCA)
- Eseguire l'intera procedura microchirurgia allo stereomicroscopio. Utilizzando forbici chirurgiche e pinze eseguire una incisione mediana superficiale nel collo, da sopra lo sterno al di sotto tegli mascella (circa 3 o 4 cm).
- Utilizzando pinze grassi accuratamente separato e tessuto connettivo per esporre la trachea.
- Posizionare un cuscino (oggetto rotondo, circa 0,5 cm di diametro) sul retro del collo del mouse per estendere il collo, esponendo la zona.
- Separare il tessuto utilizzando un divaricatore tissutale o ganci.
- Sul lato sinistro dell'animale della trachea, accuratamente tweeze parte il tessuto connettivo per esporre il CCA partita.
- Uso di pinze rimuovere accuratamente tutto il tessuto connettivo per esporre la biforcazione CCA, e l'inizio di entrambe le arterie carotidi interne ed esterne.
3. Preparazione del CCA per la sostanza Infusion
- Inserire due segmenti di sutura in nylon (circa 1 cm ciascuno) sotto carotide esterna (ECA), con pinze.
- Posizionare un nodo permanente al punto possibile della ECA più alto.
- Nel punto più basso possibile della ECA, immediatamente al di sopra della biforcazione CCA, postoun nodo rimovibile. Questo nodo dovrebbe essere sciolto rispetto al nodo superiore.
- Chiudere la CCA utilizzando una clip nave, nel punto più basso possibile.
- Chiudere l'arteria carotide interna (ICA) utilizzando una clip nave.
- Con le forbici a molla di microdissezione eseguire un piccolo taglio nella ECA (circa 2 mm), tra i due nodi.
4. Infusione Sostanza via ICA
- Assemblare un sistema di infusione. Fissare 6 pollici di tubo capillare (dimensioni ideali: 2,5 mm x 1,2 mm) ad una siringa tubercolina contenente 250 ml di sostanza da infondere (farmaci, agenti patogeni, vescicole extracellulari, tra gli altri) e inserire la punta capillare dolcemente verso l'incisione eseguita al punto 3.6.
- Continua a scivolare lungo il capillare fino a raggiungere un punto medio tra la biforcazione e la clip di chiusura del CCA.
- Legare giù il nodo ECA inferiore. Verificare che il nodo è sufficiente per consentire capillare fluidità sciolti e abbastanza stretta per impedire leaking.
- Rimuovere clip dalla ICA.
- applicare una leggera pressione alla sostanza della siringa del pistone consente l'infusione a circa 10 ml al secondo.
5. Procedure di infusione postali
- Posizionare la clip posteriore sul ICA.
- Rimuovere delicatamente il tubo capillare.
- Legare giù il nodo ECA inferiori completamente.
- Rimuovere clip dal ICA e il CCA.
6. Incisione di chiusura e di assistenza post-operatoria
- Rimuovere divaricatore o di tessuti ganci e cuscino.
- Pulire l'area di sutura con soluzione fisiologica sterile.
- Chiudere l'incisione mediante sutura in nylon / ago e pinza.
- Somministrare anti-infiammatori e analgesici per alleviare il disagio post-operatorio.
- Mettere animale in gabbia posto sulla piastra elettrica per almeno 1 ora e il recupero del monitor.
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Representative Results
La tecnica microchirurgia infusione topo descritto qui è molto versatile ed è stato utilizzato per fornire diverse sostanze direttamente nel cervello, compresa la fornitura di cellule tumorali in un modello rappresentativo di una formazione di metastasi cerebrale 1, 12.
Questa tecnica è adatto anche per valutare gli aspetti patologici diversi patogeni nel SNC. In un modello murino di infezione da HIV, l'intervento di infusione è stato usato per iniettare particelle virali direttamente nel CCA. Abbiamo riscontrato che 7 giorni dopo l'intervento, il sistema nervoso centrale è stato positivo per l'HIV mediante real-time PCR. Inoltre, l'infezione nell'emisfero ipsilaterale era 6-10 piega superiore dell'emisfero controlaterale (Figura 2).
Un altro approccio adeguato della chirurgia infusione qui descritto è quello di fornire vescicole extracellulari (ECVS), principalmente esosomi, nel sistema nervoso centrale. La Figura 3 mostra la presenza di CD63, un marker per esosomi, marcato con proteina fluorescente verde (GFP) nel cervello omolaterale di un topo 24 ore dopo l'infusione.
Figura 1: Rappresentazione schematica della infusione attraverso l'arteria carotide interna. Nel inserto (a) e (b) rappresentare la localizzazione dei nodi superiore ed inferiore, rispettivamente; (c) rappresenta il piccolo taglio nella ECA, attraverso il quale viene inserito il tubo capillare (linea grigia). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2: Rilevamento HIV da Real-time PCR dopo infusione virale attraverso l'arteria carotide interna. Bar indicano medi livelli di HIV DNA raccolti da topi 7 giorni dopo l'infusione attraverso l'arteria carotide interna sinistra. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immunofluorescenza di cervello di topo Sezione Raffigurante GFP-tagged CD63, un marker Exosome, dopo ECV infusione attraverso l'arteria carotide interna. L'immagine raffigura un rappresentante dei microvasi del mouse cervello associata con CD63 esprimere ECV (verde). barra della scala: 50 micron.ottenere = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La microchirurgia infusione qui descritto è stato dimostrato di essere molto successo nella fornitura di sostanze esogene di varie funzioni biologiche nel SNC, impedendo la diffusione indesiderata in tutto il corpo 1, 12. Rottura della barriera emato-encefalica è una caratteristica patologica di diverse malattie del sistema nervoso centrale-correlate; pertanto valutare il rapporto di sostanze esogene con la barriera emato-encefalica è di grande importanza ed interesse.
Questo modello chirurgia presentato provoca traumi limitata agli animali ed è associata a bassissima mortalità 1, 12. Inoltre, la procedura non interferisce con la funzione CNS o del flusso sanguigno cerebrale 1, 12. L'aspetto più critico di questa procedura è di eseguire il taglio corretto nella ECA, che dovrebbe consentire solo lainserimento del tubo capillare. Un taglio più largo causerà fuoriuscita della sostanza da infondere, richiedendo un altro intervento chirurgico ECA sul lato opposto. Per evitare questa situazione, il tubo capillare deve avere un diametro maggiore rispetto al taglio, e dovrebbe anche avere un bordo tagliente per facilitare il suo ingresso attraverso l'arteria. Per quanto riguarda l'aspetto tecnico, un personale completamente addestrato è in grado di eseguire questo intervento entro 20 minuti.
La maggiore limitazione di questa tecnica è la possibilità di infusione sola volta attraverso la stessa ICA. Per la consegna sostanza ripetuto nel SNC, una nave microport deve essere utilizzato ed è stato descritto in precedenza 1 tecnica .Il qui descritto ha il potenziale per aiutare negli studi sulle nuove interazioni positive e negative all'interno della BBB, nonché di fornire patogeni , la droga, e gli agenti fisiologiche nel cervello.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).
- Frisella, W. A., et al. Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII. Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Wu, G., et al. Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates. Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).
- Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).
- Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain. J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).
- Pardridge, W. M. Drug and gene delivery to the brain: the vascular route. Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).
- Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells. Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).
- Huang, R. Q., et al. Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer. FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).
- Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain. Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).
- Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels. Biol Trace Elem Res. , (2015).
