Summary
यह फेफड़े के बाह्य मैट्रिक्स से एक 3-आयामी सेल संस्कृति पाड़ बनाने के लिए एक विधि है। बरकरार फेफड़ों हाइड्रोजेल कि तीन आयामों में कोशिकाओं के विकास का समर्थन कर सकते में कार्रवाई की है।
Abstract
यहाँ हम इन विट्रो फेफड़ों सेल संस्कृति के लिए कई घटक सेल संस्कृति हाइड्रोजेल की स्थापना के लिए एक तरीका मौजूद है। एन सुअर, चूहे, या माउस से गुट फेफड़े के ऊतकों को स्वस्थ के साथ शुरू, ऊतक भरकर रखा और बाद में रासायनिक डिटर्जेंट में डूबे हुए सेलुलर मलबे को हटाने के लिए किया जाता है। पहले और प्रसंस्करण के बाद ऊतक के histological तुलना की पुष्टि डबल असहाय डीएनए और अल्फा galactosidase धुंधला की 95% से अधिक के हटाने का सुझाव सेलुलर मलबे के बहुमत निकाल दिया जाता है। decellularization के बाद, ऊतक lyophilized और फिर एक पाउडर में cryomilled है। मैट्रिक्स पाउडर एक अम्लीय पेप्सिन पाचन समाधान में 48 घंटे के लिए पचा और फिर pregel समाधान के लिए फार्म निष्प्रभावी है। pregel समाधान का जमाना 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा प्रेरित किया जा सकता है और तुरंत बाद निराकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। कोटिंग्स सी के लिए एक गैर इलाज प्लेट पर pregel समाधान का उपयोग गठन किया जा सकतापक्ष लगाव। प्रकोष्ठों pregel आत्म विधानसभा के लिए पहले एक 3 डी संस्कृति को प्राप्त करने के लिए, एक का गठन जेल जो कोशिकाओं से पाड़ के माध्यम से विस्थापित कर सकते हैं, या कोटिंग्स पर चढ़ाया की सतह पर चढ़ाया में निलंबित किया जा सकता है। रणनीति के लिए परिवर्तन जमाना तापमान, शक्ति, या प्रोटीन टुकड़ा आकार को प्रभावित कर सकता प्रस्तुत किया। हाइड्रोजेल गठन के अलावा, हाइड्रोजेल कठोरता genipin का उपयोग कर बढ़ाया जा सकता है।
Protocol
| उपाय | बाँझ फिल्टर | दिशा-निर्देश |
| Dih 2 ओ | हाँ | Dih 2 हे; बाँझ फ़िल्टर |
| 0.1% ट्राइटन X-100 समाधान | हाँ | धूआं हुड के तहत Dih 2 हे 100 मिलीलीटर के लिए 100 μl ट्राइटन एक्स 100 समाधान जोड़ें और जब तक भंग आंदोलन; बाँझ फिल्टर। |
| 2% deoxycholate समाधान | हाँ | धूआं हुड के तहत 2 ग्राम सोडियम deoxycholate समाधान जोड़ने 100 मिलीलीटर Dih 2 हे और जब तक भंग आंदोलन प्रति; बाँझ फिल्टर |
| 1 एम NaCl | हाँ | 58.44 छ NaCl Dih 2 ओ के 1 एल में जोड़े; आंदोलन जब तक भंग; बाँझ फिल्टर |
| DNase समाधान | हाँ | 12,000 जोड़ेइकाइयों DNase 1 एल Dih 2 ओ करने के लिए; जोड़े 0.156 जी MgSO 4 (निर्जल), और 0.222 जी CaCl 2; आंदोलन जब तक भंग; बाँझ फिल्टर |
| पीबीएस | हाँ | 27.2 जी ना 2 HPO 4 · 7H 2 ओ (द्विक्षारकीय heptahydrate) का मिश्रण है, 80 ग्राम सोडियम क्लोराइड, और 10 एल Dih 2 ओ के साथ 2 जी KCl; आंदोलन जब तक भंग; 7.4 पीएच को समायोजित; बाँझ फिल्टर |
तालिका 1: समाधान ऊतक Decellularization के लिए आवश्यक है। decellularization प्रक्रिया के लिए ऊपर समाधान करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। लगभग 2.5 एल एक सुअर का फेफड़ों के लिए आवश्यक हो जाएगा।
1. हाइड्रोजेल गठन
- सुअर फेफड़े Decellularization (संदर्भ 9,10 से अनुकूलित)
- प्राप्त है, एक गुट एन सामान्य सुअर का फेफड़ा, एक कसाईखाना से, दिल और vasc साथulature बरकरार।
- दिल दूर काटना करने के लिए, संभव के रूप में करीब दिल के वाहिका काटने ऊतक कैंची या एक छुरी का प्रयोग करें, शेष वाहिका छिड़काव के लिए बाद के चरणों में इस्तेमाल किया जाएगा।
- ध्यान से आसपास के श्वासनली, ब्रांकाई, और एक छुरी या कैंची का उपयोग वाहिका संयोजी ऊतक दूर काटना।
नोट: सबसे अच्छा फेफड़ों का निर्धारण करते फुस्फुस के माध्यम से बड़ी कटौती या punctures और श्वासरोध या संवहनी रोड़ा की बड़ी मात्रा में है कि decellularization प्रक्रिया की प्रभावशीलता में बाधा हो सकती बिना एक फेफड़ों का चयन करके प्रक्रिया के आराम के लिए उपयोग करें। - सबऑप्टिमल फेफड़ों दूर कट (का निपटारा किया जा सकता है दिल, संयोजी ऊतक और हटाया फेफड़ों की पालियों) के रूप में जितना संभव हो श्वासनली से जुड़ी श्वसनी जा रही है। वहाँ एक फेफड़े श्वासनली और वाहिका से जुड़ी शेष होना चाहिए।
ध्यान दें: ऊतक विज्ञान के लिए वर्गों रखें अगर वांछित। 9 - अकड़न या पी को सीवन के साथ काट दिया ब्रांकाई बंदrevent अतिरिक्त backflow।
- जब तक की जरूरत (तालिका 1) 4 डिग्री सेल्सियस पर decellularization समाधान और सर्द तैयार करें।
- एक हाथ पंप, फेफड़े के धमनी फिट दोनों फेफड़े के धमनी और श्वासनली के माध्यम से फेफड़े के ऊतकों छिड़कना डि पानी के साथ 3 बार cannulated का उपयोग करना। पहले हर बार वाहिका छिड़कना। वाहिका में लगभग 1 एल और प्रत्येक छिड़काव के लिए श्वासनली में 1.5 एल के साथ शुरू हो, लेकिन के रूप में सेलुलर मलबे हटा दिया जाता है और अधिक तरल प्रणाली के माध्यम से भरकर रखा जा सकता है।
- दोनों वाहिका और ट्राइटन X-100 के समाधान के साथ श्वासनली छिड़कना।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए ट्राइटन X-100 के घोल में फेफड़े के ऊतकों डूब।
- छिड़कना वाहिका और श्वासनली डि पानी के साथ 3 बार कुल्ला करने के लिए।
- दोनों वाहिका और deoxycholate समाधान के साथ श्वासनली छिड़कना।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए deoxycholate में ऊतक वर्गों डूब।
- छिड़कना वाहिका और श्वासनली डि पानी के साथ 3 बार कुल्ला करने के लिए।
- दोनों वाहिका और सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ श्वासनली छिड़कना।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए फ़िल्टर NaCl समाधान में ऊतक डूब।
- छिड़कना वाहिका और श्वासनली डि पानी के साथ 3 बार कुल्ला करने के लिए।
- दोनों वाहिका और DNase समाधान के साथ श्वासनली छिड़कना।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए फ़िल्टर DNase समाधान में ऊतक डूब।
- दोनों वाहिका और श्वासनली पीबीएस के साथ 5 बार छिड़कना।
- ध्यान देने योग्य उपास्थि ऊतक, श्वासनली और सभी नलिकाओं 2 मिमी या बड़ा व्यास में (मुख्य रूप से नाभिका और फेफड़ों की औसत दर्जे भागों के आसपास पाया) एयरवेज का आयोजन, केवल श्वसन क्षेत्र (मुख्य रूप से परिधीय क्षेत्रों) छोड़ने से दूर काटना।
- 1 इंच वर्गों या छोटे में ऊतक काटना। ऊतक के अभिविन्यास में इस कदम के लिए कोई फर्क नहीं पड़ता।
- 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में अतिरिक्त तरल और जगह ऊतक डालो। -80 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक रुक।
नोट: वर्गों के ऊतक विज्ञान कोशिकाओं और सेलुलर debri के हटाने सुनिश्चित करने के लिए बनाए रखनेएस, अगर वांछित। हम एच ई का उपयोग करें, α-galactosidase, PicoGreen, hydroxyproline, ninhydrin, Alcian नीले, एसडीएस पृष्ठ, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री को चिह्नित करने के लिए। 9
- फेफड़े प्रसंस्करण
- decellularized फेफड़े के ऊतकों युक्त फ्रोजन ट्यूब से पलकों निकालें।
- ट्यूब खोलने पर फिल्टर पेपर की जगह और रबर बैंड के साथ सुरक्षित है।
नोट: ट्यूब और सामग्री अभी भी अन्यथा -80 डिग्री सेल्सियस तक में जगह जमे हुए जमे हुए किया जाना चाहिए। - ऊतक Lyophilize जब तक सभी अतिरिक्त तरल चला गया है, एक फ्रीज ड्रायर का उपयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार। -80 डिग्री सेल्सियस मिल करने के लिए तैयार है जब तक पर स्टोर।
- फ्रीजर मिल को तरल नाइट्रोजन जोड़ने के काम करने की स्थिति के लिए इन्सुलेशन और आंतरिक घटकों को शांत करने के लिए शुरू करने से पहले।
- चक्की ट्यूब से चुंबकीय चक्की बार निकालें और नीचे कवर करने के ऊतक जोड़ें।
- चक्की बार बदलें और शिथिल पैक ऊतक जोड़ें। चक्की बार अभी भी स्वतंत्र रूप से बढ़ना चाहिए।
- चक्की ट्यूब और पीएलए बंदफ्रीजर चक्की में सीई।
- मैक्स भरने लाइन के लिए तरल नाइट्रोजन भरें।
- फ्रीज़र चक्की ठीक पाउडर में सभी ऊतक (लगभग 5 मिनट, ~ 600 मिनट की दर कसाव -1), एक स्टेनलेस स्टील impactor के साथ एक पॉली कार्बोनेट सिलेंडर के साथ ही स्टेनलेस स्टील एंड प्लग निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्रीजर चक्की का उपयोग करने में। -80 डिग्री सेल्सियस के उपयोग के लिए तैयार है जब तक पर स्टोर।
- सूक्ष्म झरझरा जेल गठन (8 मिलीग्राम / एमएल) (संदर्भ से अनुकूलित 9,11)
- 1% जोड़ें (w / v) decellularized पाउडर और 0.1% की (डब्ल्यू / वी) 0.01 एम एचसीएल को पेप्सिन की, लगातार आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर, (प्रवाह तरल के शीर्ष स्तर पर देखने के लिए सक्षम होना चाहिए) 48 घंटा।
नोट: पाउडर स्थिर रुप से शुल्क लिया जाता है, तो एचसीएल जोड़ने के बाद पाउडर ट्यूब दीवारों से अतिरिक्त धोने के लिए अवसर देता है। - 48 घंटे के लिए पाचन के बाद, 5 मिनट के लिए बर्फ पर समाधान और अभिकर्मकों जगह है।
- प्रशीतित 10% का उपयोग करना (वी / वी) 0.1 एम NaOH, एकघ 11.11% (वी / वी) 10x पीबीएस, 7.4 की शारीरिक पीएच को पचा प्रोटीन समाधान लाने (एकाग्रता 1x करने के लिए संपूर्ण समाधान लाने के लिए)।
नोट: समाधान अब एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। Rheometry 9 का उपयोग अगर वांछित जमाना कैनेटीक्स प्रदर्शन करना।
- 1% जोड़ें (w / v) decellularized पाउडर और 0.1% की (डब्ल्यू / वी) 0.01 एम एचसीएल को पेप्सिन की, लगातार आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर, (प्रवाह तरल के शीर्ष स्तर पर देखने के लिए सक्षम होना चाहिए) 48 घंटा।
2. क्रॉस को जोड़ने Hydrogels यांत्रिक शक्ति में सुधार करने के लिए
- 1%, 0.1%, और 0.01% w / v genipin crosslinking समाधान का समाधान 10% DMSO में genipin पाउडर के लिए आवश्यक राशि भंग द्वारा तैयार किए गए थे।
- 1 घंटे के लिए समाधान हर 15 मिनट भंवर।
- ईसीएम हाइड्रोजेल (एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 100 μL) है कि पहले हिस्से 1.3.4 में इकट्ठा किया गया है को कवर करने के genipin समाधान जोड़ें।
- प्रत्येक ईसीएम हाइड्रोजेल छोड़ दो 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए crosslink करने के लिए।
- ईसीएम हाइड्रोजेल कुल्ला पीबीएस के साथ 3 बार जब तक धोने के समाधान अब कोई नीला है। Crosslinked हाइड्रोजेल तो आगे लक्षण और सीई के लिए तैयार हो जाएगाडालूँगा संस्कृति अध्ययन करता है।
3. Microporous जेल के साथ सेल संस्कृति
- दो आयामी कोटिंग
- 1.3.3 से समाधान का उपयोग करना, एक 96 अच्छी तरह से गैर इलाज टिशू कल्चर प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए pregel समाधान के 20 μl जोड़ें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सर्द प्रोटीन सोखना थाली करने के लिए अनुमति देने के लिए।
- महाप्राण pregel समाधान और पीबीएस के साथ कुल्ला।
- पारित होने कोशिकाओं 9।
- 10,000 कोशिकाओं / 2 सेमी कुओं में जोड़े।
- अच्छी तरह से प्रति 100 μl के लिए मीडिया को बढ़ाने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- तीन आयामी सेल संस्कृति 9
- 1.3.3 से समाधान का उपयोग करना, pregel समाधान के 1,000,000 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए pelleted कोशिकाओं resuspend।
- जल्दी से 3 डी सेल संस्कृति के लिए एक ~ 500 माइक्रोन मोटी हाइड्रोजेल फार्म के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में pregel-सेल निलंबन के 16 μl बांटना।
- 30 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेतेजेल के लिए मिनट के रूप में।
- का गठन हाइड्रोजेल के शीर्ष करने के लिए मीडिया के 100 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- चर कठोरता जैल पर तीन आयामी सेल संस्कृति
- एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में 1.3.3 से समाधान का उपयोग करना, पिपेट pregel समाधान के 100 μl।
- जेल के रूप में करने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
नोट: पार्ट 2 से क्रॉस को जोड़ने कदम का यहां इस्तेमाल किया जा सकता है। - पारित होने कोशिकाओं 9।
- 10,000 कोशिकाओं / 2 सेमी कुओं में जोड़े।
- अच्छी तरह से प्रति 100 μl के लिए मीडिया को बढ़ाने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
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Representative Results
इस विधि का उपयोग करना, हम सामान्य सुअर, चूहे, और माउस फेफड़ों (चित्रा 1) से हाइड्रोजेल का उत्पादन किया है। प्रसंस्कृत फेफड़ों एक अनुमान के अनुसार क्रमश: 5 एमजी, 40 एमजी, और ईसीएम पाउडर के 10 ग्राम प्रदान करते हैं। प्रक्रिया का अवलोकन चित्रा 2 में दिखाया गया है। प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण दृश्यावलोकन में शामिल हैं: deoxycholate rinsing के बाद फेफड़ों के सफेद उपस्थिति; pregel गठन के बाद, समाधान अपारदर्शी होना चाहिए और अगर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत समाधान महीनों के लिए समरूप दिखाई देनी चाहिए। हम प्रक्रिया (तालिका 2) के दौरान त्रुटि के स्रोतों की पहचान करने में मदद करने के लिए एक बुनियादी समस्या निवारण तालिका को शामिल किया है। बीच बढ़िया तालमेल के बाद, हाइड्रोजेल तुरंत इस्तेमाल किया है या भविष्य में उपयोग के लिए भंडारित किया जा सकता है। Rheological परीक्षण की पुष्टि करता है कि बीच बढ़िया तालमेल का 90% से अधिक 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 3) तक पहुंचने के बाद पहले ही मिनट में होता है। गठित हाइड्रोजेल पीबीएस में लंबी अवधि, लेकिन सेल लगाव और proliferatio के लिए स्थिर रहेn (चित्रा 4) बदल सकता है।
इस प्रोटोकॉल सुअर का फेफड़ों के लिए लिखा है, जबकि अंतरिक्ष सीमाओं हमें सीमा जब सुअर फेफड़ों decellularizing केवल एक फेफड़े का उपयोग करने के लिए। हम अन्य प्रजातियों के लिए दोनों फेफड़ों decellularize को मामूली संशोधन के साथ ही प्रक्रिया का इस्तेमाल किया है। चूहों और चूहों के लिए, फेफड़ों बरकरार रह जा सकता है और दिल से जुड़ा है, लेकिन अभी भी संयोजी ऊतक एक छुरी या कैंची से हटाया जाना चाहिए। हम दिल बरकरार है और चूहों और चूहों के लिए संलग्न रखने के लिए और सही वेंट्रिकल की बजाय फेफड़े के धमनी के माध्यम से समाधान छिड़कना। श्वासनली के छिड़काव अभी भी वही है; हालांकि, प्रवेशनी छोटी प्रजातियों के लिए उपयोग में आसानी के लिए श्वासनली में sutured जा सकता है।
हम अनेक प्रकार की कोशिकाओं, मानव mesenchymal स्टेम सेल, 9 माउस mesenchymal स्टेम सेल, मानव उपकला कोशिका लाइनों (A549s), मानव प्राथमिक microvascular एंडो जोड़ लिया हैthelial कोशिकाओं (HpuVECs), और मानव नाल नस उपकला कोशिकाओं (HUVECs) के भीतर और फेफड़ों ईसीएम हाइड्रोजेल की सतह पर। हम गठन जैल के xenogenic प्रकृति के बारे में मुद्दों का सामना नहीं किया। हमारे पिछले काम सुअर का हाइड्रोजेल में α-galactosidase में एक महत्वपूर्ण कमी हुई है। 9 पूर्व जेल समाधान भी सेल लगाव में सुधार करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक परत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। जब फेफड़ों ईसीएम लेपित टिशू कल्चर प्लेटों को जोड़ा गया pregel समाधान HpuVEC लगाव और प्रसार में सुधार। लेपित कुओं काफी गैर इलाज कुओं (चित्रा 5) के साथ तुलना में सेलुलर लगाव में सुधार प्रदर्शित करता है।
genipin जोड़ना हाइड्रोजेल crosslinking बढ़ जाती है। इस वृद्धि crosslinking, एक और अधिक physiologically प्रासंगिक कठोरता प्रदान कर सकता है, जबकि ईसीएम की गिरावट कम। गिरावट में कमी है, हालांकि इन विट्रो में नाबालिग के बीच वृद्धि हुई संबंध के कारण हो सकताप्रोटीन और कोशिकाओं द्वारा ईसीएम remodeling के लिए इसलिए अधिक प्रतिरोध। हम एक rheometer पर आवृत्ति स्वीप इस्तेमाल किया crosslinked हाइड्रोजेल के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए। हाइड्रोजेल कठोरता सीधे मंझला और सबसे अधिक प्रासंगिक एकाग्रता 0.01% होने के साथ एकाग्रता genipin के लिए सहसंबद्ध किया जाना पाया गया था (चित्रा 6, देशी ऊतक दिखाया गया है)। एक MTT परख crosslinked हाइड्रोजेल पर सेल प्रसार और अस्तित्व यों इस्तेमाल किया गया था। सेल प्रसार crosslinked हाइड्रोजेल (चित्रा 7) पर अधिक है। यह दूसरों से बढ़कर कठोरता पर बढ़ा सेल प्रसार का समर्थन करता है। 12 परिवर्तनीय genipin समय या तापमान crosslinking अलग crosslinking डिग्री में परिणाम हो सकता है।
चित्रा 1: फेफड़ों की छवियाँ हम decellularized है। (ए) माउस फेफड़ों से चित्र decellulari के बादzation और दिल को हटा दिया, (बी) चूहा बाद ट्राइटन X-100 दूर rinsed, (सी) सुअर, प्रारंभिक कुल्ला पहले; वे क्रमशः उपज ~ 5 मिलीग्राम, 40 मिलीग्राम, और फेफड़ों ईसीएम के 10 ग्राम। (डी) माउस फेफड़ों और दिल बरकरार, decellularization के बाद, प्रवेशनी के साथ अभी भी जगह में sutured। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: के तरीके का अवलोकन। इस विधि फेफड़ों से हाइड्रोजेल का उत्पादन करने के एक सिंहावलोकन है। गुट एन सुअर फेफड़ों decellularization केवल अपारदर्शी सफेद या पारदर्शी ऊतक कि ईसीएम प्रोटीन के शामिल है छोड़ने होता है के साथ शुरुआत। तो फिर किसी भी शेष पानी को हटाने, और सतह के क्षेत्र में वृद्धि एसिड पाचन अनुकूलन करने के बाद ऊतक solubilized है। एसी के निराकरणआईडी और शारीरिक स्तर के लिए नमक बढ़ती pregel समाधान जमाना लिए तैयार बनाता है। एक बार जब समाधान 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हाइड्रोजेल रूपों, लक्षण एक जेल rheometer और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ जगह लेता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: प्रतिनिधि Rheological डेटा तापमान Ramping तहत जमाना लिए। बाद एक प्रारंभिक आयाम झाडू रैखिक viscoelastic सीमा निर्धारित करने के लिए, एक तापमान रैंप जमाना कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। डेटा मतलब +/- मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। एन = 4।
चित्रा 4: दीर्घकालिक स्थिरता। एक iMएक सुअर फेफड़ों ईसीएम कमरे के तापमान पर 6 महीने के लिए पीबीएस में संग्रहीत हाइड्रोजेल की उम्र।
चित्रा 5: HpuVECs के चयापचय परख। मानव प्राथमिक microvascular endothelial कोशिकाओं (HpuVECs) गैर इलाज टिशू कल्चर प्लेट पर हो से MTT प्रसार डेटा। 1.3.3 से Pregel समाधान प्लेटें, रात भर प्रशीतित और पूर्व जेल फेफड़ों ईसीएम लेपित प्लेट फार्म के लिए rinsed करने के लिए जोड़ा गया है। HpuVECs गैर लेपित की तुलना में ईसीएम लेपित प्लेटों पर उच्च MTT गतिविधि दिखाया। * पी <0.05 नियंत्रण की तुलना में। डेटा मतलब ± मानक विचलन एन = समूह प्रति 3 रहे हैं।
चित्रा 6: बढ़ी crosslinking के लिए Rheological डेटा। genipin crosslinking के लिए rheometry डेटा। GENI की वृद्धि की सांद्रता के साथ कठोरता बढ़ जाती है1% genipin पर एक पठार के लिए पिन। डेटा genipin साथ crosslinking में एक गुना वृद्धि दिखाने के लिए सामान्यीकृत है।
चित्रा 7; पर Genipin Crosslinked जैल सेल प्रसार। genipin crosslinked हाइड्रोजेल पर A549s के लिए सामान्यीकृत MTT डेटा। बढ़ सेल प्रसार वृद्धि की कठोरता के साथ देखा। पी <0.05 नियंत्रण की तुलना में। डेटा मतलब ± मानक विचलन कर रहे हैं। एन = समूह प्रति 3।
| मुसीबत | मुद्दा | संकल्प |
| लाल / गुलाबी रंग decellularization के बाद बरकरार रखा | अप्रभावी decellularization | नई फेफड़ों के साथ शुरू |
| अधूरा decellularization के क्षेत्रों हटाये </ Td> | ||
| संवहनी रोड़ा | नई फेफड़ों के साथ शुरू | |
| अधूरा decellularization के क्षेत्रों हटाये | ||
| उल्लेखनीय सेलुलर मलबे को बरकरार रखा | अप्रभावी decellularization | नई फेफड़ों के साथ शुरू |
| अधूरा decellularization के क्षेत्रों हटाये | ||
| संवहनी रोड़ा | नई फेफड़ों के साथ शुरू | |
| अधूरा decellularization के क्षेत्रों हटाये | ||
| श्वासरोध | नई फेफड़ों के साथ शुरू | |
| अधूरा decellularization के क्षेत्रों हटाये | ||
| ऊतकीय नमूनों में पाया झिल्ली का विनाश | छिड़काव के दौरान जहाजों की ओवर-दबाव | छिड़काव के दबाव को कमडिटर्जेंट की |
| बड़े कण मिलिंग के बाद बनी हुई है | ट्यूब में बहुत ज्यादा lyophilized सामग्री | सिलेंडर पीस में सामग्री में कमी |
| काफी लंबे समय के लिए milled नहीं | मिलिंग के समय में वृद्धि | |
| बीच बढ़िया तालमेल नहीं Pregel समाधान | समाधान पीएच बहुत अधिक | बनाओ 7.4 पीएच |
| ताजा पाउडर के साथ pregel समाधान शुरू | ||
| समाधान पीएच बहुत कम | बनाओ 7.4 पीएच | |
| ताजा पाउडर के साथ pregel समाधान शुरू | ||
| पचा खत्म ईसीएम | ताजा पाउडर के साथ pregel समाधान शुरू | |
| प्रकोष्ठों जीवित नहीं है | एचसीएल पाचन के बाद शुरू रोगाणुओं | ताजा पाउडर के साथ फिर से शुरू और बाँझ फ़िल्टर समाधान का उपयोग |
| पीएच ओएफएफ | pregel समाधान फिर से शुरू | |
| बनाओ 7.4 पीएच | ||
| प्रकोष्ठों फट | pregel समाधान में नमक की मात्रा को ठीक करें |
तालिका 2: समस्या निवारण गाइड संभावित त्रुटि के स्रोतों की पहचान करने के लिए।
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Discussion
जीव विज्ञान के अभिन्न पहलुओं में से एक hierarchal संरचनाओं कि एक विशिष्ट कार्य में अणुओं की आत्म संगठन है। 13 प्रयोगशाला में, आत्म विधानसभा में इस तरह के नमक एकाग्रता, पीएच, और पाचन अवधि के रूप में कई कारकों पर निर्भर करता है। दिखाया गया है, एक आत्म आयोजन हाइड्रोजेल रूपों जब solubilized प्रोटीन एक शारीरिक तापमान में लौटने। हाइड्रोजेल गठन सेलुलर लगाव और इन विट्रो में प्रसार को बढ़ावा देने के लिए सक्षम है।
ईसीएम से biophysical संकेतों के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया पॉलिमर का उपयोग शोध नहीं किया जा सकता। biophysical संकेतों के ऊतक विशिष्ट सेलुलर प्रतिक्रिया अन्य ऊतकों का उपयोग करके शोध नहीं किया जा सकता। पुनर्जनन शोधकर्ताओं और चिकित्सकों का मानना है decellularized मचानों का उपयोग ऊतक उत्थान और घाव भरने में सुधार। पुरानी फेफड़ों के रोग से ग्रस्त मरीजों के अंग उपलब्धता बढ़ाने के लिए और प्रतिरक्षाजनकता कम करने के लिए चिकित्सीय सुधार की जरूरत है। अंग विशेष, सेल ईसीएम बातचीत होना चाहिएआगे अंग जीव विज्ञान के लिए छानबीन की।
फेफड़ों की कोशिकाओं के लिए एक सेल पाड़ के रूप में उपयोग करते हुए ईसीएम अनुरूप परिणाम दिखाया गया है। 14,15 रोगग्रस्त मॉडल से फेफड़ों के स्लाइस का उपयोग कर 16 स्टेम या पूर्वज कोशिकाओं, बाहर का फेफड़ों में पाया 17,18 प्रोत्साहित करती रोग नवीकरण और teratomas के गठन को रोकने के लिए विशेष आलों की आवश्यकता है। एक डिलीवरी वाहन के रूप में ऊतक विशिष्ट ईसीएम का उपयोग करना, पूर्वज कोशिकाओं की पुनर्जन्म का प्रभाव बढ़ाया जा सकता है। ईसीएम हाइड्रोजेल अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक और अधिक लागू माहौल स्थापित करता है।
अनुसंधान का एक बड़ा शरीर की जकड़न को देख के रूप में मौजूद है यह सेलुलर संकेत से संबंधित है। genipin crosslinking की हमारी विधि सेल कठोरता संकेत के साथ ही सेल ईसीएम घटक बातचीत के लिए अनुमति देते हैं। जबकि हाइड्रोजेल कठोरता ईसीएम राशि और प्रोटीन के अनुपात से छेड़छाड़ की जा सकती है, genipin के उपयोग हाइड्रोजेल कठोरता परिवर्तन ईसीएम सामग्री की कुछ हद तक स्वतंत्र अनुमति देता है। जनरल का समायोजनepin एकाग्रता यांत्रिक गुणों के सटीक ट्यूनिंग सबसे निकट प्राकृतिक फेफड़े के ऊतकों 6 सदृश लिए अनुमति दे सकता। से genipin डेटा वर्तमान अध्ययन में परिधीय फेफड़ों से हाइड्रोजेल का उपयोग कर प्राप्त, एक 15 गुना वृद्धि (5 Pa Pa से 75 करने के लिए) का उल्लेख किया गया था। परिधीय फेफड़ों हाइड्रोजेल करने के लिए 1% genipin जोड़ने या (पूरे फेफड़ों हाइड्रोजेल को 0.01% का अनुमान जोड़ने द्वारा biopsied सामान्य चूहे फेफड़े के ऊतकों के rheological डेटा है कि एक ही तरीकों का उपयोग कर decellularized गया था, हम लगभग परिधीय फेफड़े के ऊतकों कठोरता (डेटा नहीं दिखाया गया है) प्राप्त कर सकते हैं के आधार पर )। फेफड़ों parenchyma से मिलकर परिधीय फेफड़ों ईसीएम का प्रयोग हमारे पहले प्रकाशित पूरे फेफड़ों ईसीएम हाइड्रोजेल परिणाम 7 के साथ तुलना में एक काफी नरम जेल बना दिया। इसलिए अलावा genipin करने के लिए, फेफड़े के ऊतकों के विशिष्ट क्षेत्रों का चयन करने के लिए नाटकीय रूप से decellularize कठोरता को प्रभावित कर सकते हैं।
इस विधि है, जो आमतौर पर अतिरिक्त कदम perfusi में इस्तेमाल शामिल हो सकते सुधार करने के लिए अवसर हैंपूरे फेफड़े के ऊतकों के decellularization पर। इस विधि सामान्य फेफड़े के ऊतकों पर इस्तेमाल किया गया है और रोगग्रस्त फेफड़ों के decellularization के लिए संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। हम अभी तक विशिष्ट रोग राज्यों में इस प्रक्रिया की जांच नहीं की है। हम हमारे फेफड़ों एक कसाईखाना से रात भर बर्फ पर भेज दिया प्राप्त करते हैं। इस विधि श्वासरोध या संवहनी रोड़ा के कारण हमारी प्रक्रिया की प्रभावकारिता को सीमित कर सकता है; हालांकि, हम शायद ही कभी फेफड़ों के क्षेत्रों है कि अच्छी तरह से decellularized नहीं किया गया है हटा दिया है। जब नए सिरे से फेफड़े के ऊतकों को प्राप्त करने के लिए, हम ऊतक प्रसंस्करण में किसी भी रुक जाता है को रोकने के लिए फेफड़ों हो रहा से पहले आवश्यक समाधान के सभी बनाने की सिफारिश करेंगे। पिछले अनुसंधान में पाया गया है कि एक अंतिम कदम के रूप में नसबंदी peracetic एसिड का उपयोग कर उत्पादन मैट्रिक्स के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं में घुसपैठ, 19 संभावित decellularized ऊतक के proregenerative प्रभाव में सुधार लाने में एक पुनर्योजी एम 1 बृहतभक्षककोशिका phenotype का कारण बनता है। अन्य अनुसंधान की प्रक्रिया को पूरा करने के लिए अन्य डिटर्जेंट का उपयोग करने में चला गया है, लेकिन उन appeaआर अंततः decellularization पर एक ही प्रभाव के साथ प्रयोगशाला विशेष पसन्द किया जाना है। decellularization प्रक्रिया और पाचन कदम शोधकर्ता विशिष्ट आवेदन के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, जेल पाचन समय या निराकरण के तरीकों में फेरबदल प्रोटीन संरचना, यांत्रिक गुणों, या जमाना कैनेटीक्स बदल सकता है।
विधि यहाँ पर चर्चा करने के लिए विकल्प वांछित प्रयोगात्मक परिणामों के आधार पर जटिलता के स्तर में भिन्न हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, लक्ष्य तहखाने झिल्ली बरकरार रखने के लिए जितना संभव हो उतना था, तो एक दबाव सीमित नियंत्रण के साथ एक छिड़काव पंप बाधा नुकसान कम हो सकती है। इसके अतिरिक्त, अगर एक एक प्रयोगशाला सेटअप दोनों फेफड़ों बड़ी प्रजाति के लिए बरकरार रखने के लिए उपलब्ध था, decellularization प्रक्रिया प्रभावकारिता में सुधार हो सकता। इसके विपरीत, एक हाथ एक मोर्टार और मूसल के साथ तकनीक पीस प्रयोगशालाओं जो एक cryomill नहीं है के लिए lyophilized ऊतकों को लागू किया जा सकता है। हम हाथ Grindin उम्मीद करेंगेजी बड़े टुकड़े का उत्पादन करने के लिए, सतह क्षेत्र एसिड पाचन के लिए उपलब्ध सीमित है ताकि पाचन बार इस मामले में बदले जाने की जरूरत हो सकती है।
अल्टरनेटिव्स decellularization कदम और हाइड्रोजेल के गठन के लिए ही सीमित नहीं हैं। Gluteraldehyde हाइड्रोजेल लिए एक crosslinker के रूप में इस्तेमाल किया गया है, जैविक मॉडल प्रणाली के लिए इस्तेमाल किया हाइड्रोजेल के यांत्रिक शक्ति में वृद्धि करने के लिए एक संभावित विकल्प प्रदान करते हैं। अन्य मॉडल प्रणाली एक मॉडल के 3 डी में इन विट्रो पाड़ के रूप में फेफड़ों के स्लाइस पर देख रहे हैं इन विट्रो 3 डी संस्कृति प्रणाली, या अधिक सामान्यतः के रूप में बरकरार decellularized फेफड़ों में शामिल हैं। 20 हम पहले से ही सीमाओं कि बहुलक scaffolds के साथ ही एकल घटक scaffolds के साथ काम करने से आने का उल्लेख किया है, लेकिन उन लोगों के यहाँ प्रस्तुत की प्रक्रिया के लिए संभव विकल्प के रूप में रहते हैं। इसके अतिरिक्त, वहाँ (जैसे डीएनए अलगाव के रूप में) decellularization प्रभावकारिता, जमाना (मैलापन assays का उपयोग कर सकते हैं) का निर्धारण करने के लिए वैकल्पिक तरीकों, और सेल लगाव एक हैंएन डी प्रसार (जैसे CCK8 के उपयोग के रूप में)। हमने पाया है कि यहाँ वर्णित विधियों पर्याप्त से अधिक मॉडल 3 डी scaffolds के रूप में उपयोग के लिए हाइड्रोजेल को चिह्नित करने के लिए कर रहे हैं।
फेफड़ों के ईसीएम हाइड्रोजेल हम यहाँ वर्णन सेल ईसीएम बातचीत के अध्ययन के लिए एक प्रभावी मंच प्रदान करते हैं। pregel समाधान बहुलक दवा वाहक के लिए एक कोटिंग के रूप में क्षमता है, mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के वितरण में सहायता के लिए, या अपने आप में एक दवा वितरण मंच के रूप में। इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक बहुमुखी हाइड्रोजेल फेफड़ों ईसीएम से निकाली गई बनाने के लिए बुनियादी कदम प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम बरकरार सुअर फेफड़े के ऊतकों दान के लिए Smithfield खेतों को धन्यवाद देना चाहूंगा। हम यह भी हमें अपने उपकरणों का उपयोग करने की अनुमति देने के लिए डॉ हू यांग, डॉ क्रिस्टीना तांग और VCU प्लास्टिक सर्जरी विभाग को धन्यवाद देना चाहूंगा। हाइड्रोजेल और ऊतकों के नमूनों, शरीर रचना विज्ञान और तंत्रिका जीव विज्ञान माइक्रोस्कोपी सुविधा के VCU विभाग में SEM के लिए तैयार किए गए समर्थित, भाग में भाग में एनआईएच-NINDS केंद्र कोर अनुदान 5 P30 NS047463 से धन और, द्वारा वित्त पोषण के रूप एनआईएच-NCI कैंसर केंद्र सहायता अनुदान द्वारा P30 CA016059। VCU नैनो कोर विशेषता सुविधा (एनसीसी) पर नमूने के SEM इमेजिंग। यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, सीएमएमआई 1351162 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
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