Summary
Detta är en metod för att skapa en 3-dimensionell cellodling scaffold från pulmonell extracellulär matris. Intakt lunga bearbetas till hydrogeler som kan stödja tillväxten av celler i tre dimensioner.
Abstract
Här presenterar vi en metod för upprättande av multipla komponentcellodlings hydrogeler för in vitro-lungcellkultur. Från och med friska klump lungvävnad från svin, råtta eller mus, är vävnaden perfunderas och nedsänkt i efterföljande kemiska rengöringsmedel för att avlägsna cellrester. Histologisk jämförelse av vävnaden före och efter bearbetning bekräftar avlägsnande av över 95% av dubbelsträngat DNA och alfa galaktosidas-färgning antyder majoriteten av cellrester avlägsnas. Efter decellularisering är vävnaden lyofiliserades och sedan cryomilled till ett pulver. Grundmassepulvret digereras under 48 timmar i en sur pepsindigestion lösning och därefter neutraliseras för att bilda den förgelen lösning. Gelning av förgelen lösning kan induceras genom inkubation vid 37 ° C och kan användas omedelbart efter neutralisation eller lagras vid 4 ° C i upp till två veckor. Beläggningar kan bildas med användning av förgelen lösning på en icke-behandlad platta för cell fastsättning. Celler kan suspenderas i förgelen före självmontering för att uppnå en 3D-kultur, pläterade på ytan av en formad gel från vilken cellerna kan migrera genom ställningen, eller pläterade på beläggningarna. Ändringar den strategi som kan påverka gelningstemperaturen, styrka, eller proteinfragment storlekar. Bortom hydrogel formation, kan hydrogelen styvhet ökas med hjälp av genipin.
Protocol
| Lösning | sterilt filter | Avstånd |
| DIH 2 O | Ja | DIH 2 O; sterilfiltrerades |
| 0,1% Triton X-100-lösning | Ja | Enligt dragskåp tillsätt 100 | il Triton-X 100 Lösning till 100 ml DIH 2 O och skaka tills det är upplöst; sterilt filter. |
| 2% deoxicholat Lösning | Ja | Enligt dragskåp tillsätt 2 g natriumdeoxikolat lösning per 100 ml DIH 2 O och skaka tills det är upplöst; sterilt filter |
| 1 M NaCl | Ja | Lägg 58,44 g NaCl till en liter DIH 2 O; agitera tills det är upplöst; sterilt filter |
| DNas-lösning | Ja | lägga 12000enheter DNas till en L DIH 2 O; Lägga 0,156 g MgSO 4 (Vattenfritt), och 0,222 g CaCl2; agitera tills det är upplöst; sterilt filter |
| PBS | Ja | Kombinera 27,2 g Na 2 HPO 4 · 7 H2O (dibasisk heptahydrat), 80 g NaCl och 2 g KCl med 10 L DIH 2 O; agitera tills det är upplöst; justera pH till 7,4; sterilt filter |
Tabell 1: lösningar som krävs för Tissue decellularisering. Gör lösningarna ovan för decellularisering processen. Lagra vid 4 ° C. Cirka 2,5 L kommer att behövas för en svin lunga.
1. Hydrogel Bildning
- Porcine Lung decellularisering (anpassad från referenser 9,10)
- Erhålla en klump normal svin lunga, från ett slakteri, med hjärta och Vaseulature intakt.
- Använda vävnads sax eller en skalpell för att dissekera bort hjärtat, skär vaskulatur så nära som möjligt till hjärtat, kommer återstående vaskulaturen användas i senare steg för perfusion.
- Noggrant dissekera bort bindväv som omger luftstrupen, bronkerna och kärl med hjälp av en skalpell eller sax.
OBS: Bestäm bästa lunga att använda för resten av proceduren genom att välja en lunga utan stora nedskärningar eller punktering genom lungsäcken och stora mängder atelektaser eller vaskulär ocklusion som kan hindra effektiviteten i decellulariseringen processen. - Skär bort den suboptimala lungan lämnar så mycket bronker kopplade till luftstrupen som möjligt (hjärta, bindväv och lober bort lungan kan tas om hand). Det bör finnas en lunga förblir fäst till luftstrupen och kärl.
OBS: Behåll avsnitt för histologi om så önskas. 9 - Stäng kopplade bronkerna med klämmor eller sutur till pRevent överskott backflöde.
- Framställa de decellularisering lösningar och i kylskåp vid 4 ° C tills det behövs (tabell 1).
- Med hjälp av en handpump kanyl för att passa lungartären, BEGJUTA lungvävnaden 3 gånger med avjoniserat vatten genom både lungartären och luftstrupen. BEGJUTA vaskulatur först varje gång. Börja med omkring 1 L in vaskulatur och 1,5 L in luftstrupen för varje perfusion, men eftersom cellulärt skräp avlägsnas mer vätska kan perfuseras genom systemet.
- BEGJUTA både kärl och luftstrupen med Triton X-100 lösning.
- Dränka lungvävnad i Triton X-100-lösning under 24 h vid 4 ° C.
- BEGJUTA kärl och luftstrupe 3 gånger med avjoniserat vatten för att skölja.
- BEGJUTA både kärl och luftstrupen med deoxikolat lösning.
- Sänk avsnitten vävnads i deoxicholat under 24 h vid 4 ° C.
- BEGJUTA kärl och luftstrupe 3 gånger med avjoniserat vatten för att skölja.
- BEGJUTA både kärl och luftstrupen med NaCl-lösning.
- Dränka vävnad i filtrerad NaCl-lösning under 1 h vid 4 ° C.
- BEGJUTA kärl och luftstrupe 3 gånger med avjoniserat vatten för att skölja.
- Perfundera både vaskulatur och luftstrupe med DNas-lösning.
- Dränka vävnad i filtrerad DNas-lösning under 1 h vid 4 ° C.
- BEGJUTA både vaskulatur och luftstrupe 5 gånger med PBS.
- Dissekera bort märkbar broskvävnad, luftstrupe och alla tubuli 2 mm eller större i diameter (främst finns runt hilum och mediala delar av lungorna) från luftvägarna, vilket innebär att endast andnings zoner (främst de perifera områden).
- Dissekera vävnad i 1 tums sektioner eller mindre. Orienteringen av vävnaden spelar ingen roll för detta steg.
- Häll bort överskottsvätska och placera vävnaden i 50 ml koniska rör. Frysa vävnaden vid -80 ° C.
OBS: Behåll avsnitt för histologi att säkerställa avlägsnande av celler och cellulära debris, om så önskas. Vi använder H & E, α-galaktosidas, PicoGreen, hydroxiprolin, ninhydrin, Alcian blue, SDS-PAGE och masspektrometri för att karakterisera. 9
- Lung Processing
- Ta bort locken från frusna rör innehållande decellulariserade lungvävnad.
- Placera filterpapper över röret öppningen och säkra med gummiband.
OBS: Rör och innehållet bör fortfarande frysas på annat sätt försätta i -80 ° C tills fryst. - Lyofilisera vävnaden tills all överskottsvätska är borta, med användning av en frystorkare enligt tillverkarens anvisningar. Förvara vid -80 ° C tills den ska kvarn.
- Innan du börjar lägga flytande kväve till frys kvarn för att kyla isolering och interna komponenter arbetsvillkor.
- Ta magnetisk kvarn bar från kvarnen rör och tillsätt vävnad för att täcka botten.
- Byt kvarn fältet och lägga löst packad vävnad. Bruket bar bör fortfarande röra sig fritt.
- Stäng kvarnen röret och place i frys kvarn.
- Fyll flytande kväve till max fyllnadslinjen.
- Frys kvarn all vävnad till ett fint pulver (ungefär 5 min, impaktion hastighet av ~ 600 min -1), i en polykarbonat cylinder med en provkropp av rostfritt stål samt rostfritt end stålpluggar med användning av frys Kvarn enligt tillverkarens anvisningar. Förvara vid -80 ° C tills produkten ska användas.
- Mikroporös gelbildning (8 mg / ml) (anpassad från referenser 9,11)
- Lägg 1% (vikt / volym) av det decellulariserade pulver och 0,1% (vikt / volym) pepsin till 0,01 M HCl, under konstant omrörning (bör kunna se flödet vid den översta nivån i vätska), vid rumstemperatur, för 48 tim.
OBS: Pulvret statiskt laddad, så att lägga den HCl efter pulvret ger möjlighet att tvätta överskottet av rörväggarna. - Efter digerering under 48 timmar, placera lösningen och reagenser på is under 5 min.
- Med användning av kyld 10% (volym / volym) 0,1 M NaOH, end 11,11% (vol / vol) 10x PBS (för att bringa hela lösningen till 1x koncentration), ta med den digererade proteinlösningen till fysiologiskt pH på 7,4.
OBS: Lösningen kan nu lagras vid 4 ° C i upp till en vecka. Utför gelbildning kinetik använder rheometry 9 om så önskas.
- Lägg 1% (vikt / volym) av det decellulariserade pulver och 0,1% (vikt / volym) pepsin till 0,01 M HCl, under konstant omrörning (bör kunna se flödet vid den översta nivån i vätska), vid rumstemperatur, för 48 tim.
2. Tvärbindning Hydrogeler för att förbättra mekanisk hållfasthet
- Lösningar av 1%, 0,1% och 0,01% vikt / volym genipin tvärbindningslösning framställdes genom upplösning av den nödvändiga mängden genipin pulver i 10% DMSO.
- Vortexa lösningen var 15 min i 1 h.
- Lägg genipin lösning för att täcka ECM hydrogeler (100 mikroliter för varje brunn i en platta med 96 brunnar) som tidigare har samlats på del 1.3.4.
- Lämna varje ECM hydrogel att tvärbinda under 24 h vid 37 ° C.
- Skölj ECM hydrogel 3 gånger med PBS tills tvättlösningen är inte längre blå. De tvärbundna hydrogeler kommer då att vara redo för ytterligare karakterisering och cell kulturstudier.
3. Cell Culture med mikroporös Gel
- Tvådimensionell beläggning
- Användning av lösningen från 1.3.3, tillsätt 20 | il av förgelen lösning till varje brunn i en 96-brunnars icke-behandlad vävnadsodlingsplatta.
- Kyl över natt vid 4 ° C för att låta proteinadsorption till tallriken.
- Aspirera Pregel lösning och skölj med PBS.
- Passageceller 9.
- Lägg 10.000 celler / cm2 till brunnar.
- Öka media till 100 pl per brunn och inkubera vid 37 ° C.
- Tredimensionell cellodling 9
- Använda lösning från 1.3.3, resuspendera pelleterat celler till en koncentration av 1.000.000 celler / ml förgel lösning.
- Snabbt dispensera 16 | il av förgelen-cellsuspension i varje brunn i en platta med 96 brunnar, för att bilda en ~ 500 | im tjock hydrogel för 3D cellodling.
- Inkubera vid 37 ° C under 30min för gelen att bildas.
- Tillsätt 100 pl av media till toppen av bildade hydrogeler och inkubera vid 37 ° C.
- Tredimensionell cellodling med variabla styvhet geler
- Med användning av lösning från 1.3.3, pipett 100 pl förgelen lösning i varje brunn i en 96-brunnsplatta.
- Inkubera vid 37 ° C under 30 minuter för gelén för att skapa.
Obs: Tvärbindning steg från del 2 kan användas här. - Passageceller 9.
- Lägg 10.000 celler / cm2 till brunnar.
- Öka media till 100 pl per brunn och inkubera vid 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med denna metod har vi tagit fram hydrogeler från normal gris, råtta och mus lungorna (Figur 1). Bearbetade lungor tillhandahålla en uppskattad 5 mg, 40 mg och 10 g av ECM pulver respektive. En översikt av processen visas i Figur 2. Nyckel visualiseringar under processen inkluderar: vitt utseende i lungorna efter sköljning deoxicholat; efter förgelen bildningen ska lösningen vara ogenomskinliga och lösningen ska visas homogen månader vid förvaring vid 4 ° C. Vi har inkluderat en grundläggande felsökningstabellen för att identifiera felkällor genom hela processen (tabell 2). Efter gelning kan hydrogeler användas omedelbart eller lagras för framtida användning. Reologisk provning bekräftar att över 90% av det gelande inträffar under de första minuterna efter att ha nått 37 ° C (Figur 3). Bildade hydrogeler är stabila under långa perioder i PBS, men cellvidhäftning och proliferation kan förändras (figur 4).
Även om detta protokoll är skriven för svin lunga, utrymmesbegränsningar begränsa oss att använda endast en lunga när decellularizing gris lungor. Vi har använt samma förfarande med mindre modifiering för att decellularize båda lungorna för andra arter. För råttor och möss, kan lungorna lämnas intakt och hjärtat fäst, men bindväv bör ändå tas bort med en skalpell eller sax. Vi håller hjärtat intakt och fäst för råttor och möss och BEGJUTA lösningarna genom höger kammare i stället för lungartären. Perfusion av luftstrupen är fortfarande densamma; Men, kan kanylen sys i luftstrupen för lättillgänglighet för mindre arter.
Vi har lagt till flera celltyper, humana mesenkymala stamceller, 9 mus mesenkymala stamceller, mänskliga epitelcellinjer (A549s), humana primära mikrovaskulär Endothelial celler (HpuVECs), och humana navelsträngsven epitelceller (HUVEC) inom och på ytan av de lung ECM hydrogeler. Vi har inte stött på frågor om xenogena karaktär av de bildade gelerna. Vårt tidigare arbete har visat en signifikant minskning av α-galaktosidas i svin hydrogeler. 9 För-gellösningen kan också användas som en beläggning vid 4 ° C för att förbättra cellvidhäftning. Den förgel lösning förbättrar HpuVEC fäste och proliferation vid tillsats till lung ECM belagd vävnadsodlingsplattor. Belagda brunnarna visar signifikant förbättrad cellulär infästning jämfört med icke-behandlade brunnar (Figur 5).
Sätta genipin ökar hydrogel tvärbindning. Denna ökade tvärbindning kan ge en mer fysiologiskt relevant styvhet, samtidigt som man minskar nedbrytningen av ECM. Minskningen i nedbrytning, även om smärre in vitro, kan förekomma på grund av ökad bindning mellanproteiner och därmed större motstånd mot ECM ombyggnad av celler. Vi använde frekvenssvep på en reometer för att mäta de mekaniska egenskaperna hos den tvärbundna hydrogelen. Hydrogel styvhet befanns vara direkt korrelerad till genipin koncentration med medianen och mest relevanta koncentrationen är 0,01% (figur 6, naturlig vävnad ej visad). En MTT-analys användes för att kvantifiera cellproliferation och överlevnad på den tvärbundna hydrogelen. Cellförökning är högre på tvärbunden hydrogel (Figur 7). Detta stöder ökad celltillväxt på ökad styvhet från andra. 12 Varierande genipin tvärbindnings tid eller temperatur kan resultera i olika tvärbindningsgrader.
Figur 1: Bilder av lungor vi har decellulariserade. Bilder från (A) mus lunga efter decellularition och hjärta bort, (B) råtta efter Triton X-100 sköljas bort, (C) Pig, före den första sköljningen; de ger ~ 5 mg, 40 mg och 10 g av Lung ECM, respektive. (D) Mus lunga och intakt hjärta, efter decellularisering, med kanyl fortfarande sys på plats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Översikt över metoder. Detta är en översikt av metoden för att framställa hydrogeler från lungorna. Börjar med klump gris lung decellularisering sker vilket innebär att endast ogenomskinlig vit eller genomskinlig vävnad som består av ECM-proteiner. Sedan efter avlägsnande av eventuell kvarvarande vatten, och öka ytarean för att optimera syraupplösning vävnaden är solubiliserat. Neutralisering av acid och öka salt till fysiologiska nivåer skapar förgelen lösningen är färdig för gelning. När lösningen bildar en hydrogel vid 37 ° C, tar karakterisering plats med en gel reometer och svepelektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representant Reologisk Data för Gelning i temperaturinställnings. Efter en inledande amplitud svep för att bestämma linjära viskoelastiska intervallet, var en temperaturramp används för att bestämma gelning kinetik. Data presenteras som medelvärde +/- standardavvikelse. n = 4.
Figur 4: långsiktig stabilitet. en imålder av en gris lung ECM hydrogel lagras i PBS över 6 månader vid rumstemperatur.
Figur 5: Metabolic Analys av HpuVECs. MTT spridningsdata från mänskliga primära mikrovaskulära endotelceller (HpuVECs) odlats på icke-behandlade vävnadsodlingsplattor. Pregel lösning från 1.3.3 sattes till plattorna, kyldes över natten och sköljdes för att bilda pre-gel lung ECM belagda plattor. HpuVECs uppvisade högre MTT aktivitet på ECM belagda plattor jämfört med icke-belagda. * P <0,05 jämfört med kontroll. Data är medelvärde ± standardavvikelse för n = 3 per grupp.
Figur 6: Reologisk Data för Enhanced tvärbindning. Rheometry uppgifter för genipin tvärbindning. Styvheten ökar med ökade koncentrationer av Genistift till en platå på 1% genipin. Data normaliseras för att visa en faldig ökning av tvärbindning med genipin.
Figur 7; Cell Proliferation på Genipin Tvärbundna geler. Normaliserade MTT data för A549s om genipin tvärbundna hydrogeler. Ökad cellproliferation som ses med ökad styvhet. p <0,05 jämfört med kontroll. Data är medelvärden ± standardavvikelse. n = 3 per grupp.
| Problem | Problem | Upplösning |
| Röd / rosa färg kvar efter decellularisering | ineffektiv decellularisering | Börja om med nya lungor |
| Ta bort delar av ofullständig decellularisering </ Td> | ||
| vaskulär ocklusion | Börja om med nya lungor | |
| Ta bort delar av ofullständig decellularisering | ||
| Betydande cellrester behålls | ineffektiv decellularisering | Börja om med nya lungor |
| Ta bort delar av ofullständig decellularisering | ||
| vaskulär ocklusion | Börja om med nya lungor | |
| Ta bort delar av ofullständig decellularisering | ||
| atelektas | Börja om med nya lungor | |
| Ta bort delar av ofullständig decellularisering | ||
| Förstörelse av membran som finns i histologiska prover | Övertryck av fartyg under perfusion | Minska perfusionstryckav tvätt- och rengöringsmedel |
| Stor partikelkvarstår efter fräsning | För mycket lyofiliserat material i röret | Minska material i malningscylindern |
| Inte slipat tillräckligt länge | öka malningstiden | |
| Pregel lösning inte gelning | Lösning pH för högt | Göra pH 7,4 |
| Börja förgelen lösningen med nytt pulver | ||
| Lösning pH för lågt | Göra pH 7,4 | |
| Börja förgelen lösningen med nytt pulver | ||
| ECM över digererad | Börja förgelen lösningen med nytt pulver | |
| Celler överlever inte | Mikrober som införts efter HCI matsmältning | Börja igen med färskt pulver och använda sterila filtrerade lösningar |
| FOff | Börja förgelen lösning igen | |
| Göra pH 7,4 | ||
| celler brast | Fix salthalten i Pregel lösning |
Tabell 2: felsökning för att identifiera möjliga källor till fel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de integrerade delar av biologin är självorganisering av molekyler i hierarkiska strukturer som utför en specifik uppgift. 13 I labbet, självorganisering beror på flera faktorer, såsom saltkoncentration, pH, och matsmältning varaktighet. Såsom visas är en självorganiserande hydrogel bildas när solubiliserade proteiner återvänder till en fysiologisk temperatur. Hydrogelen som bildas är i stånd att befrämja cellulär infästning och proliferation in vitro.
Cellulärt svar på biofysiska signaler från ECM kan inte undersökas med hjälp av polymerer. Vävnadsspecifik cellulärt svar på biofysikaliska signaler kan inte undersökt med hjälp av andra vävnader. Regeneration forskare och kliniker tror använder decellulariserade byggnadsställningar förbättrar vävnadsregenerering och sårläkning. Kronisk sjuka lungsjukdom behöver terapeutiska förbättringar för att öka tillgången på organ och minska immunogenicitet. Organspecifika, cell-ECM interaktioner måste varaforskat ytterligare organ biologi.
Med hjälp av ECM som en cell byggnadsställning för lungceller har visat konsekventa resultat. 14,15 Använda lungskivor från sjuka modeller uppmuntrar förnyelse sjukdom 16 stam- eller progenitorceller, som finns i distala lungor, 17,18 och kräver speciella nischer för att förhindra bildning av teratom. Använda vävnadsspecifik ECM för att forsla kan regenerativa effekterna av stamceller förbättras. ECM hydrogel etablerar en mer tillämplig miljö för att utvärdera cellulära reaktioner på extracellulär matrix.
En stor mängd forskning finns att titta på stelhet som det hänför sig till cellulär signalering. Vår metod för genipin tvärbindning tillåter cell styvhet signalering liksom cell-ECM komponent interaktioner. Medan hydrogel styvhet kan manipuleras av ECM mängden och förhållandet mellan proteiner, användning av genipin tillåter hydrogel styvhetsförändringar något oberoende av ECM-innehåll. justering allmEPIN koncentration kan medge noggrann inställning av mekaniska egenskaper att de liknar naturligt lungvävnad 6. Från erhållna genipin data med hjälp av hydrogeler från perifera lungan i den aktuella studien var en 15-faldig ökning (från 5 Pa till 75 Pa) noteras. Baserat på reologiska data för biopsier normal råttlungvävnad som decellulariserade med samma metoder kan vi uppnå ungefärlig perifer lungvävnad styvhet (data visas ej) genom att tillsätta 1% genipin till perifera lung hydrogeler eller lägga 0,01% till hela lung hydrogeler (beräknat ). Använda den perifera lung ECM består av lungparenkym gjorde en betydligt mjukare gel jämfört med våra tidigare publicerade hela lung ECM hydrogel resultat 7. Därför förutom genipin, välja specifika regioner av lungvävnad att decellularize kan dramatiskt påverka styvhet.
Det finns möjligheter att förbättra denna metod, som kan innefatta ytterligare steg som vanligen används i perfusipå decellularisering av hela lungvävnad. Denna metod har använts på normal lungvävnad och kan kräva modifiering för decellularisering av sjuka lungor. Vi har ännu inte undersökt denna process i vissa sjukdomstillstånd. Vi får våra lungor levereras på is över natten från ett slakteri. Denna metod kan begränsa effekten av vår process på grund av atelektas eller vaskulär ocklusion; Men sällan har vi att ta bort delar av lungorna som inte har ordentligt decellulariserade. När framställning av färsk lungvävnad, rekommenderar vi att alla de lösningar som krävs innan det blir lungorna för att förhindra eventuella pauser i vävnadsbehandling. Tidigare forskning har funnit att användning av perättiksyra som ett slutligt steriliseringssteg att matrisproduktion orsakar en regenerativ M1 makrofag fenotypen i infiltrerande immunceller, 19 potentiellt förbättra proregenerative effekter av decellulariserade vävnaden. Annan forskning har gått till att använda andra rengöringsmedel för att slutföra processen, men de appear att vara lab specifika önskemål med i slutändan samma inverkan på decellularisering. De decellularisering förfarande och matsmältningen steg kan optimeras beroende på forskarens särskilda program. Till exempel, kan förändra de gel koktiden eller neutralisering metoder ändra proteinkompositionen, mekaniska egenskaper, eller gelningsproblem kinetik.
Alternativ till den metod som diskuteras här kan variera i grad av komplexitet beroende på önskad experimentella resultat. Till exempel, om målet var att hålla basalmembranet intakt så mycket som möjligt, kan en perfusion pump med en tryck begränsad kontroll minska barriärskada. Dessutom, om man hade ett laboratorium inställning tillgänglig för att hålla båda lungorna intakt för större arter kan decellulariseringen processen förbättra effektiviteten. Omvänt kan en hand malningsteknik med en mortel och mortelstöt appliceras på den frystorkade vävnaden för labs som inte har en cryomill. Vi förväntar handen Grinding för att framställa större fragment, vilket begränsar ytarean som är tillgänglig för syradigerering så att uppslutningstider kan behöva ändras i detta fall.
Alternativ är inte begränsade till de decellularisering steg och bildandet av hydrogeler. Gluteraldehyd har använts som ett tvärbindningsmedel för hydrogeler, vilket ger ett möjligt alternativ till att öka den mekaniska hållfastheten av biologiska hydrogeler som används för modellsystem. Andra modellsystem inkluderar intakta decellulariserade lungor som ett in vitro 3D odlingssystemet, eller mer allmänt tittar på lung skivor som modell 3D in vitro ställningen. 20 Vi har redan nämnt de begränsningar som kommer att arbeta med polymerstöd samt enskilda komponent ställningar, men de kvarstår som möjliga alternativ till förfarandet som presenteras här. Dessutom finns alternativa metoder till att bestämma decellularisering effekt (såsom DNA-isolering), gelning (kan använda grumlighet analyser), och cellvidhäftnings ennd proliferation (t.ex. användning av CCK8). Vi fann att de metoder som beskrivs här är mer än tillräcklig för att karakterisera hydrogeler för användning som modell 3D ställningar.
Lung ECM hydrogeler vi beskriver här ger en effektiv plattform för att studera cell ECM interaktioner. Den förgel lösning har potential som en beläggning för polymerläkemedelsbärare, medhjälp i leveransen av mesenkymala stamceller, eller som ett läkemedel leveransplattform av sig själv. Protokollet presenteras här ger de grundläggande stegen för att skapa en mångsidig hydrogel härrörande från lung ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka Smithfield lantgårdar för att donera den intakta svinlungvävnad. Vi vill också tacka Dr Hu Yang, Dr. Christina Tang och VCU plastikkirurgi Institutionen för att tillåta oss att använda sin utrustning. Hydrogel och vävnadsprover bereddes för SEM vid VCU Institutionen för anatomi och neurobiologi Mikroskopi Facility stöds delvis genom finansiering från NIH-NINDS Center Kärna Grant 5 P30 NS047463 och delvis genom finansiering formen NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30 CA016059. SEM avbildning av prover vid VCU Nanotechnology Kärna karakterisering Facility (NCC). Detta arbete har finansierats av National Science Foundation, CMMI 1.351.162.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
- Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
- Haycock, J. W. 3D Cell Culture. , Humana Press. (2011).
- Walker, J. M., Ed, Epithelial cell culture protocols. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).
- Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin. J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa. J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).
- Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS One. 5 (9), e12905 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. Biomaterials: where we have been and where we are going. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).
- Zhang, W. -J., et al. The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro. J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).
- Booth, A. J., et al. Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).
- Matsuda, A., et al. Evidence for human lung stem cells. N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).
- Zuo, W., et al. p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).
