Summary
Dit protocol beschrijft de reconstructie van nucleosomen die differentieel-isotoop gemerkte zus histonen. Tegelijkertijd asymmetrisch post-translationeel gemodificeerde nucleosomen worden gegenereerd na het gebruik van een histon premodified kopie. Deze preparaten kunnen gemakkelijk worden gebruikt om wijzigingen crosstalk mechanismen bestuderen, gelijktijdig op beide zus histonen, met behulp van hoge-resolutie NMR-spectroscopie.
Abstract
Asymmetrisch gemodificeerde nucleosomen bevatten de twee kopieën van een histon (zus histonen) versierd met verschillende sets van post-translationele modificaties (PTMs). Ze zijn recent ontdekte soorten met onbekende middelen van vestiging en functionele implicaties. De huidige analytische methoden zijn ontoereikend om de copy-specifieke optreden van PTMs op de nucleosomale zus histonen detecteren. Dit protocol geeft een biochemische werkwijze voor de in vitro reconstitutie van nucleosomen die verschillend isotoop gemerkte zuster histonen. De gegenereerde complex kan ook asymmetrisch gewijzigd, na waaronder een premodified histon zwembad tijdens het opnieuw vouwen van histon subes. Deze asymmetrische nucleosoom preparaten kunnen gemakkelijk worden omgezet met histon modificerende enzymen modificatie overspraak mechanismen die bij de asymmetrisch vooraf opgenomen PTM basis van kernspinresonantie (NMR) spectroscopie onderzoeken. In het bijzonder de modificatie reactiesreal-time kan onafhankelijk worden afgebeeld op de twee zuster histonen door het uitvoeren van verschillende NMR correlatie experimenten zijn afgestemd op de desbetreffende isotoop type. Deze methode biedt de mogelijkheid om overspraak mechanismen die bijdragen aan de vorming en verspreiding van asymmetrische PTM patronen op nucleosomale complexen bestuderen.
Introduction
Eukaryotische DNA is strak verpakt binnen celkernen in chromatine. De fundamentele bouwsteen van chromatine is de nucleosoom kerndeeltje dat ~ 147 bp van DNA gewikkeld rond een octamère complex bestaat uit twee exemplaren elk van de vier kern histonen (H3, H4, H2A, H2B) bevat. Histon-eiwitten haven een overvloed aan post-translationele modificaties (PTMs). Deze covalente substituties induceren veranderingen in de structuur van chromatine, zowel direct door het beïnvloeden van de fysische chemie van het systeem en indirect door het werven van chromatine remodeling activiteiten 1, 2, 3. Door deze middelen, histon fosforylatie controleren chromatine toegankelijkheid en daarmee regelen alle DNA-celfuncties 4.
PTMs worden geïnstalleerd door histon-modificerende enzymsystemen vooral op de ongestructureerde N-terminale segmenten (staarten) van nucleosomen opgenomen kern histones. Door de vele modificatieplaatsen op relatief korte sequentie van histone staarten, fosforylatie beïnvloeden elkaar door het induceren of blokkerende daaropvolgende modificatiereacties, een effect bekend als modificatie overspraak 5. Vanwege de symmetrische algehele architectuur van de nucleosoom, modificaties en overspraak mechanismen men dacht dat eveneens plaatsvinden op de twee kopieën van elk histon nucleosomale (zuster histonen). Dit concept werd onlangs uitgedaagd en vervolgens weerlegd. In het bijzonder, in vitro enzymatische assays op vrije histon H3 staart peptiden en nucleosomen aangetoond dat een reeks H3 kinases geïntroduceerd fosforylering in een asymmetrische wijze 6. Bovendien affiniteit-zuivering gebaseerde LC-MS / MS analyse bleek dat dit asymmetrisch H3 gemethyleerd nucleosomen in verschillende typen eukaryote cellen 7. Aldus asymmetrisch gemodificeerde nucleosomen vormen nieuwe soorten, engereedschappen nodig om de mechanismen die de vorming ervan te regelen en het overspraak effect dat deze asymmetrie kan uitoefenen analyseren onthullen.
Gewoonlijk hebben Western blotting (WB) en massaspectrometrie analyse (MS) gebruikt om histon fosforylatie detecteren. Ondanks de eenvoudige toepassing, WB lijdt aan specificiteit / cross-reactiviteit problemen. Op de top van dat, het is niet in staat om het uitvoeren van simultane multi-PTM analyse en directe kwantificering van de wijziging reacties 8. Anderzijds, MS analyse maakt gebruik van verfijnde instrumentatie hoog niveau training vereist, maar biedt een hoge specificiteit en gelijktijdig in kaart brengen en kwantificeren van meerdere PTMs 9. Beide methoden zijn storend en nucleosomale complexen zijn gedissocieerd voor de analyse, waardoor een mengsel van histonen en / of histon afgeleide peptides. Deze manipulatie verwijdert de mogelijkheid om onderscheid te maken onafhankelijkemodificatiereacties die plaatsvinden op elk van de twee zuster histonen en de kopie modificatie status van de nucleosomale histonen melden.
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopie ontwikkeld als alternatief voor PTM reacties kaart. NMR is niet-storende en aldus het toezicht PTM evenementen in een real-time wijze bereide mengsels, en ook in intacte cellen 10, 11. De ontwikkeling van routines voor snelle data acquisitie en voor hoge resolutie mapping op basis van 2D hetero-nucleaire correlatie methoden isotoop gemerkte (15 N en / of 13 C) monsters 12 toegelaten gelijktijdige toewijzing van verschillende PTMs dergelijke als serine / threonine / tyrosine fosforylering, acetylering lysine / methylatie en arginine methylatie 13. Afhankelijk van het doorvoermechanisme onderzochte 15 13 N- of C-labeling protocols kan worden toegepast om het eiwit functionele groep die als een modificatie reporter markeren. Bijgevolg kan PTM mapping worden uitgevoerd door de karakteristieke chemische verschuiving verplaatsing van de corresponderende functionele groep "sensing" de wijziging van de chemische omgeving. In de meeste gevallen, kunnen zowel NH en CH chemische groepen worden gebruikt om de ontwikkeling van het doorvoermechanisme plaats aangeven.
Het huidige protocol beschrijft de vorming van nucleosomen die differentieel-isotoop gemerkte zus histonen. Combineert de flexibiliteit van NMR-spectroscopie naar kaart PTMs met beide 1 H- 15 N en 1 H- 13 C correlatiespectra met het gebruik van verschillende eiwitten affiniteit tags voor zuivering van het geselecteerde gereconstitueerd histon complexen. Met name het protocol maakt gebruik van twee verschillende pools van een bepaald histon voor nucleosoom oplossen. Deze zwembaden zijn verschillend isotoop gemerkte (een met
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reconstitutie van Nucleosomen met Differentieel Isotopen-label (en Asymmetrisch Modified) Zus Histon
OPMERKING: Het huidige protocol beschrijft de reconstructie van nucleosomen met differentieel-isotoop gelabelde histon H3. Hiertoe werden twee verzamelingen van histon H3 gebruikt; was 15N gemerkt en bevatte een 6xHis-tag aan de N-terminus en de tweede was 13 C-gelabeld en bevatte de Strep peptide (WSHPQFEK) gefuseerd aan de N-terminus. Beide tags gescheiden van de natieve sequentie met een H3 Tobacco Etch Virus (TEV) proteaseherkenningplaats. Extra asymmetrisch gemodificeerde nucleosomen te bereiden, één van de twee H3 zwembaden is opgenomen in een premodified vorm. Premodification van een histon pool kan worden uitgevoerd door reactie van het isotoop-gemerkte histon plaats met de respectieve histonenmodificerende enzym in aanwezigheid van de voor elk type reactie cofactoren / PTM donoren 16. De efficiënte plaatsing van de respectievelijke PTM kan worden bepaald door NMR spectroscopie en massaspectrometrie. De bedragen van histonen / DNA die hier gebruikt zijn ruw aanbevelingen om een nucleosoom preparaat met een geschatte concentratie van 10 uM (gemeten als DNA-concentratie bij 260 nm) .Dit uiteindelijke opbrengst is voldoende om goede kwaliteit NMR-spectra op te nemen met een relatief korte overname tijden te verkrijgen.
- Reconstructie van een histon octameer met differentieel isotoop gemerkte (en asymmetrisch gemodificeerde) histon H3
OPMERKING: Recombinant histon eiwitten kunnen worden geproduceerd in mg hoeveelheden BL21 (DE3) pLysS cellen 14. Om isotoop gemerkte histonen verkrijgen, wordt dezelfde expressie / zuivering protocol gevolgd met uitzondering van het gebruik voor bacteriegroei een minimaal medium bevattende 15 NH4Cl en / of 13 C-glucose stikstof en koolstofbronnen voor 15 N- of 13 C-labeling onderscheidenlijktief. Gezuiverde histonen extensief gedialyseerd tegen 5 mM β-mercaptoethanol en gevriesdroogd opgeslagen voor gebruik.- Ontbinden gevriesdroogde histon aliquots gemaakt met ~ 5 mg van elk histone in 1 ml ontvouwing buffer (7 M Guanidinium-HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM DTT). Omvatten beide soorten histon H3. Meng door pipetteren en niet vortex. Houd de buizen op ijs gedurende 30 minuten om volledig ontvouwen.
- Bepaal de precieze concentratie van elk histon door meting van de absorptie bij 280 nm tegen ontvouwing buffer en gebruik extinctie coëfficiënten berekend met de ProtParam instrument van de ExPASy portal. 15
- Meng de kernhistonen equimolaire verhoudingen, rekening houdend met 50% elk van beide histonen H3 zwembaden omvatten. Begin met de volledige inhoud van de minder geconcentreerde histon en dienovereenkomstig doen alle anderen.
- Stel uiteindelijke eiwitconcentratie ongeveer 1 mg / ml met behulp ontvouwen buffer.
- transfer het mengsel tot een 6-kDa cutoff dialysemembraan en dialyseren tegen 1-2 L gekoelde hervouwingsbuffer (10 mM Tris pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) bij 4 ° C. Wijzig de buffer ten minste eenmaal na de dialyse is voortgegaan gedurende minimaal 3 uur. Voer een laatste dialyse O / N bij 4 ° C.
- Verzamel gedialyseerd materiaal en verwijder neerslagen door centrifugeren in een microfuge gedurende 5 minuten bij 4 ° C op maximale snelheid (normaliter geen neerslag worden waargenomen). Bepaal octameer concentratie door meting van de absorptie bij 280 nm. In de berekeningen, gebruik maken van de toegevoegde extinctie coëfficiënten van histonen, rekening houdend met dubbele elke waarde.
- Concentreer tot een eindvolume van ~ 2 ml met een 10 kDa cutoff centrifugale filtereenheid. Herberekenen octameer concentratie en schatting verlies. Op dit punt, een octameer concentratie tussen 50 - 100 uM moet worden verkregen.
- Sluit de gelfiltratiekolom (vermeld in de Tabel Materials) eenFPLC systeem equilibreren met 2 kolomvolumes (CV) van 0,22 urn gefiltreerd en ontgast hervouwen buffer bij een stroomsnelheid van 1 ml / min en een druk van maximaal 0,5 MPa.
NB: De gelfiltratie run moet worden uitgevoerd in de koude kamer of in een koude kast. - Injecteren geconcentreerde materiaal met een stroomsnelheid van 1 ml / minuut; 1,0-1,5 ml fracties.
- Volg de chromatografische profiel en observeren histon octameer elutie bij ~ 65-68 ml.
LET OP: Een kleine schouder van de elutiepiek en een piek bij ~ 80 ml wijst op het bestaan van de vrije H3-H4 tetrameren en H2A-H2B dimeren, respectievelijk. - Run 20 pi van elke opgevangen fractie in een 18% SDS-PAGE gel.
OPMERKING: Verdun de monsters met een factor van ten minste 2 met water voordat ze op de gel om de hoge zoutconcentratie te verminderen en dus geen verstoringen. Hetzelfde geldt voor de volgende SDS-PAGE analyses van monsters in hervouwingsbuffer. - Pool relevant fraCTIES met pure octameren beoordeeld door de gelijke verdeling van de 4 histonen op de gekleurde gel en bepaal de concentratie als voorheen (stap 1.1.7).
- Sluit een 1 ml Ni-NTA-kolom (Table of Materials) een FPLC systeem equilibreren met 10 CV van 0,22 urn gefiltreerd en ontgast hervouwen buffer bij een stroomsnelheid van 1 ml / minuut.
OPMERKING: De Ni-NTA chromatografie worden uitgevoerd in de koude kamer of in een koude kast. - Passeren octameer gezuiverd door Ni-NTA met een stroomsnelheid van 1 ml / minuut.
- Verzamel doorstroom en bewaar monsters voor SDS-PAGE / WB-analyse (20 pL en 4 uL, respectievelijk). Vervolgens waskolom met 10 CV van buffer hervouwing of totdat een basislijn signaal gevonden.
- Elueer met 10 CV van hervouwingsbuffer die 250 mM imidazool met een debiet van 1 ml / minuut. Houd monsters voor SDS-PAGE / WB-analyse (20 pL en 4 uL, respectievelijk).
- Equilibreer een 1 mL affiniteitskolom acommercial streptavidine (Table of Materials) met 10 CV hervouwingsbuffer die 250 mM imidazol met behulp van een batch / zwaartekracht setup.
LET OP: Deze chromatografische stap moet worden uitgevoerd in de koude kamer. - Pass Ni-NTA elutie via commerciële streptavidine affiniteitskolom.
- Verzamelen stroom door en bewaar monsters voor SDS-PAGE / WB-analyse (20 pL en 4 uL, respectievelijk). Vervolgens, was met 10 CV van hervouwingsbuffer.
- Elueer met 10 CV van hervouwing buffer die 2,5 mM desthiobiotine. Houd monsters voor SDS-PAGE / WB-analyse (20 en 4 pi respectievelijk).
- Meten octameer concentratie, voeg 10 keer minder TEV protease en laat de reactie verlopen gedurende de nacht bij 4 ° C in een standaard plastic centrifugebuis.
OPMERKING: De benodigde hoeveelheid TEV om volledige digestie (verwijdering van de affiniteitstags) te verkrijgen afhankelijk van de oorsprong (construct) en de activiteit (vers, recombinante TEV isactief vergeleken met die opgeslagen gedurende langere perioden bij - 80 ° C). Probeer aanvankelijk toevoegen van 10 keer minder TEV opzichte van de octameer (geschat eiwitconcentraties) en pas. - Controleer op efficiënte vertering door het uitvoeren van 20 pi van het mengsel vóór en na toevoeging TEV op een 18% SDS-PAGE gel. Als spijsvertering niet volledig is, voeg meer TEV protease en verder incubatie gedurende nog 3-4 uur.
- Dialyseren monster tegen hervouwingsbuffer met een 50 kDa-cutoff dialyse membraan TEV protease te verwijderen en buffer samenstelling aan te passen.
- Concentreer het gezuiverde asymmetrische octameer met een 10 kDa cutoff centrifugale filtereenheid (dezelfde filtereenheid uit stap 1.1.7 kan ook worden gebruikt) tot een volume van 1,0-2,0 ml. Meet de eindconcentratie. Gebruik ofwel kort na nucleosoom voor reconstitutie of aanpassen aan 50% (v / v) glycerol te bewaren bij -20 ° C voor langere perioden. Op dit punt verwacht ten minste 70% verlies tijdens de voorgaande stappen, the octameer concentratie dient in het traject van 20-50 uM.
- nucleosoom reconstructie
- Als octameer werd opgeslagen in 50% glycerol, dialyseren overnacht bij 4 ° C tegen hervouwingsbuffer alvorens nucleosoom reconstitutie.
- Stel DNA (dat een nucleosoom-sequentie positionering) zoutconcentratie tot 2 M NaCl onder toepassing van een 5 M NaCl voorraadoplossing.
Opmerking: De gezuiverde DNA hetzij geïsoleerd na zuivering van een plasmide met meerdere kopieën van de gewenste sequentie bevat of gesynthetiseerd door PCR-amplificatie moeten geconcentreerd worden opgeslagen ~ 50 uM in water of een standaard Tris-EDTA buffer. - Meng octameer en DNA met de optimale verhouding bepaald uit een kleinschalige proef. Gebruik hervouwingsbuffer het eindvolume aanpassen ~ 3,0 mL. Voeg altijd de octameer laatste om elke mogelijkheid van het mengen van de octameer en het DNA op <2 M zoutconcentraties te voorkomen.
- Voer de eerste small-scDNA verhouding die leidt tot optimale opbrengsten nucleosoom: ale reconstructies de octameer bepalen. Hiervoor monteren drie reacties van 0,9: 1,0, 1,0: 1,0 en 1,1: 1,0 DNA: octameer verhoudingen in een volume van 50-100 pl. Gewoonlijk gebruikt een concentratie van 5 uM DNA.
- Ga verder met reconstitutie zoals hieronder beschreven (stappen 1.2.4-1.2.8) en aan het eind schatten van de hoeveelheid oplosbare en goede kwaliteit gereconstitueerd nucleosoom door meting van de DNA-concentratie bij 260 nm en door het uitvoeren van een 6% natieve PAGE-gel van DNA , gekleurd met ethidium bromide, respectievelijk (figuur 5A).
- Breng het mengsel op een 6-kDa cutoff dialysemembraan en dialyseren tegen 1 liter hervouwingsbuffer nacht bij 4 ° C.
- Verminder de zoutconcentratie van de buffer dialyse in een stapsgewijze wijze van 2 tot 0,85, 0,64 en 0,2 M NaCl respectievelijk. Houd monster in elke buffer gedurende ten minste 3 uur. Soms neerslag wordt gevormd na de laatste overgang. In dit geval continue dialyse zoals gepland en verwijderen precipitaat door centrifugeren microfuge aan het einde van de volgende stap.
- Overdracht dialysemembraan in een bekerglas met 1 L testbuffer (25 mM NaH 2PO 4 / Na 2 HPO 4 pH 6,8, 25 mM NaCl, 2 mM DTT) en verder dialyse O / N bij 4 ° C.
- Verzamel monster verwijderen precipitaat gevormd bij stap 1.2.5 door centrifugatie in een microcentrifuge gedurende 5 minuten bij 4 ° C op maximale snelheid en concentreren onder toepassing van een 30 kDa cutoff centrifugale filtereenheid tot een eindvolume van 300 pi ~.
- Meet DNA-concentratie bij 260 nm, uitvoeren van een 18% SDS-PAGE eiwitgel (4 pl monster) en een 6% natieve PAGE-gel van DNA (0,2 pl monster) en bewaar monster bij 4 ° C gedurende enkele weken. De eindconcentratie moet in het traject van 10-20 uM.
2. NMR Analyse van Wijziging Reacties op de Two Sister Histon
LET OP: Toewijzing van2D-1 H- 15 N correlatie spectra van nucleosomale histone staarten is te vinden op referenties 16, 17, 18. Bovendien, opdrachten van CH x groepen van lysinen, serines en threoninen 2D 1 H- 13 C correlatie spectra kan worden gevonden op verwijzing 16.
- NMR setup en registratie van referentie spectra
OPMERKING: Enzymatische assays werden uitgevoerd met 140 pi van de nucleosoom monster in testbuffer in een 3-mm NMR buis bij 300 K. Verschillende NMR buizen met andere monstervolumes kan worden gebruikt. De hiervoor genoemde temperatuur is geschikt om een goede kwaliteit te verkrijgen 1 H- 15 N correlatie spectra van nucleosomale histone staarten en goede enzymatische activiteiten. 2D-SOFAST HMQC-1 H- 15 N en 2D HSQC-1 H- 13 C spectra werden respectievelijk opgenomen met een setup thoed verleent soortgelijke overname tijden. Typische opnameparameters 128 transiënten met 1,024 (1 H) x 128 (15 N) complexpunten en 32 transiënten met 1,024 (1 H) x 64 (13 C) complexpunten voor de twee verschillende soorten correlatiespectra. Voor beide 2D spectra, de overname tijd was ~ 30 min.- Stel 300 K als het monster temperatuur in de spectrometer. Voeg 10% D 2 O (v / v) om het monster te worden gebruikt voor de spectrometer frequentie lock.
- Plaats het monster in de spectrometer en het uitvoeren van basishandelingen (vergrendeling, tuning, shimming). Bovendien bepalen optimale pulslengten en algemene opnameparameters.
- Neem 1D en 2D 1 H- 15 N en 1 H- 13 C referentiespectra.
- Werkwijze referentiespectra en maken dat de signalen worden gebruikt voor het afbeelden van de wijziging zijn algemeen opgelost en hebben goede intensiteit.
- Recover monster en it een microfugebuis.
- Instellen van de enzymatische reactie, NMR monitoring en kwantitatieve analyse
- Kopieer en regelen een reeks van in elkaar geschoven 2D-1 H- 15 N en 1 H- 13C spectra. Streven naar een totale acquisitietijd van enkele uren en pas in een nieuwe run gebaseerd op de enzymatische tarieven verkregen uit de eerste reactie.
- Voeg aan het monster de vereiste cofactoren voor de respectieve soorten modificatiereactie (1 mM ATP / 2 mM MgCl2 voor fosforylatie, 1 mM acetyl-CoA voor acetylering, 1 mM SAM voor methylering, enz.).
- Voeg het enzym van belang, meng door pipetteren Breng het monster opnieuw in de NMR-buis en vervolgens in de spectrometer (Deze handelingen snel).
OPMERKING: Indien er geen gegevens over de verwachte enzymatische activiteit pas de substraat-tot-enzym molaire verhouding 10: 1. Voer een eerste proefrit en dienovereenkomstig aan te passen voorde echte run. - Voer een snelle automatische vulplaten en de rest van de parameters van de referentie-spectra.
- Start de reeks van de afwisselend 2D 1 H- 15 N en 1 H- 13 C spectra.
- Volg de voortgang van de reactie in real-time en stopt verkrijging wanneer de reactie voltooid of een gewenst niveau bereikt.
- Werkwijze spectra als hiervoor met dezelfde parameters.
- Herhaal de hele run met een andere overname order voor de twee types van correlatie spectra. Als in het eerste experiment een 1 H- 15 N correlatie eerste in de reeks, begint nu met 1 H- 13 C correlatie. Hierdoor en met dezelfde acquisitietijd beide spectra is het mogelijk te plotten en vergelijken PTM reacties zowel verschillend isotoop gemerkte histonen op dezelfde tijdschaal. Daarnaast is het mogelijk om gemiddelden en plot foutbalken berekenen.
LET OP: Een thorough beschrijving van de methoden voor NMR-signaal analyse en de daaropvolgende kwantificering van enzymatische reacties kunnen hier 19 te vinden. - Selecteer NMR-signalen van elke tijdsverloop NMR spectrum dat de voortgang van de reactie bericht en bereken de relatieve signaal intensiteit met een visualisatie en analyse software voor NMR-spectra. Doe dit voor signalen die de ongemodificeerde en de gewijzigde toestand aangeven. Extract wijzigingsniveaus.
- Plot de berekende waarden van de wijziging levels tegen de reactietijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behoorlijk opgevouwen octamère soorten worden geïsoleerd na een run van de reconstructie mengsel door een gelfiltratiekolom (figuur 2). De gereconstitueerde octamere zwembad met de drie verschillende soorten octameren wordt onderworpen aan de tandem affiniteit zuiveringsschema. Monsters worden genomen van alle stappen en geanalyseerd door SDS-PAGE en vervolgens WB. Verificatie van de correcte uitvoering van het protocol dat resulteert in de isolatie van asymmetrische soort wordt bereikt door de aanwezigheid van de twee affiniteitstags (His- en Strep-) in de verschillende monsters (figuur 3). Vervolgens worden de affiniteitstags verwijderd na TEV protease digestie (Figuur 4). Asymmetrische octameren verwijderd affiniteit tags worden gebruikt om asymmetrische nucleosomen reconstrueren. Eerst wordt een kleine test schaal reconstitutie gebruikt om de optimale molaire verhouding van DNA te bepalen: octameer dat resulteert in een hogeopbrengst vorming van een monodisperse complex. Vervolgens wordt de optimale mengverhouding gebruikt om nucleosomen te reconstitueren in een grote schaal. Nucleosoom reconstructies worden geanalyseerd door proteïne / DNA gels en NMR spectroscopie betreffende de montage en de aanwezigheid van de verschillend isotoop gemerkte zuster histonen H3 respectievelijk (Figuur 5). Een toepassingsvoorbeeld is weergegeven in figuur 6. Bijzonder verschillend isotoop gemerkte en asymmetrisch gefosforyleerd op nucleosomen H3S10 reageren met Gcn5 acetyltransferase en acetylering van H3 H3K14 beide kopieën gevolgd in real-time door NMR spectroscopie. Uit de analyse blijkt dat H3S10 fosforylering stimuleert H3K14 acetylering door Gcn5 in cis ten opzichte van in trans.
Figuur 1: Stroomdiagram voor de opstelling van differentieel Isotopen-labeled (en Asymmetrisch Gewijzigd) Nucleosomen. (A) Het oplossen en tandem affiniteitszuivering van differentieel-isotoop gemerkte (en asymmetrisch gewijzigd) histon octameren. (B) Nucleosome reconstitutie door het combineren van de gezuiverde asymmetrische octameren en een nucleosoom DNA-sequentie positionering. (C) NMR toezicht in cis-en trans-overspraak modificatie na het mengen van de asymmetrisch gemodificeerd en verschillend isotoop gemerkte nucleosomen met histon modificerende enzymen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Reconstructie van Histon octameren. Een gelfiltratie elutieprofiel van het hervouwen histon mengsel. De hoofdpiek bij ~ 70 ml komt overeen met het histon octameren. Een 14-20% gradiënt SDS-PAGE gel (Coomassie blauwkleuring) geëlueerde fracties overeenkomend met de octameer piek geeft de juiste histon stoichiometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Zuivering van asymmetrische Histon octameren. 14-20% gradiënt SDS-PAGE gel (Coomassie-kleuring) en WB tegen de His en Strep- affiniteit tags van monsters uit de verschillende stadia van het zuiveringsschema tandem affiniteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het verwijderen van de Affinity Tags. 18% SDS-PAGE gel (Coomassie kleuring) gezuiverd asymmetrische histon octameren vóór en na het mengen met de TEV protease. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Biochemische en NMR karakterisering van differentieel Isotopen-gelabeld Nucleosomen. (A) 6% natieve DNA-PAGE gel (ethidiumbromide kleuring) van een kleine test schaal nucleosoom reconstitutie met verschillende molaire verhoudingen van DNA: octameer (links). 6% natieve PAGE gel van DNA (ethidiumbromide kleuring) van een grootschalige nucleosoom reconstitutie met de geoptimaliseerde DNA: octameer molverhouding (rechts). (B) 18% SDS-PAGE eiwitgel (Coomassie kleuring) gereconstitueerd nucleosomen geeft de juiste stoïchiometrie van de vier kernhistonen. (C) 1 H- 15 N SOFAST HMQC-spectrum van de 15 N-gemerkte H3 kopie van differentieel isotoop gemerkte nucleosomen (alleen H3 staart resten zichtbaar - de eiwitkern onzichtbaar door de langzame tuimelende rate). (D) 1 H- 13 C HSQC spectrum van de 13-gelabeld H3 kopie van differentieel isotoop gemerkte nucleosomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: NMR Monitoring van In cis en in trans Modificatie Cross-talk opgelegd door Asymmetrische Fosforylering van H3S10 op de H3K14 Acetylation activiteit van Gcn5 Acétyltransférase. (A) Schematische weergave van differentieel-isotoop gelabeld en asymmetrisch gefosforyleerd op H3S10 nucleosomen reageerde met Gcn5 acetyltransferase en H3K14 acetylering mapping, in cis en in trans. (B) 1 H- 15 N SOFAST-HMQC en 1 H- 13 C HSQC spectra (geselecteerde regio's) van de asymmetrische nucleosomen voor en na de reactie met Gcn5. (C) Tijdopgeloste NMR monitoring van H3K14 acetylering door Gcn5 op asymmetrisch H3S10 gefosforyleerd nucleosomen. De gemiddelden en variatie (foutbalken) van twee onafhankelijke experimenten worden getoond. Overgenomen met toestemming 16. Klik hier om een grotere versie te bekijkendit figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor nucleosoom reconstitutie, het huidige protocol maakt gebruik van een 165 bp lange DNA-template die de 601-Widom nucleosoom positionering reeks 20, maar vergelijkbare prestaties zal naar verwachting met behulp van verschillende lengtes van DNA templates. Het protocol werd ontworpen en gebruikt met behulp van asymmetrische vormen van histon H3. Hetzelfde principe kan de werkwijze ook worden toegepast voor andere kernhistonen en bovendien kan worden gebruikt om complexen die twee verschillende kernhistonen met verschillende isotooplabels reconstitueren. Het protocol kan ook enigszins worden gewijzigd om in eerste instantie te reconstitueren histon subcomplexen en niet rechtstreeks octameren Histon. Naar aanleiding van deze wijziging, kan asymmetrische-H3 H4 tetrameren worden opgelost door gebruik te maken van dezelfde tandem zuiveringsschema. Laatstgenoemde worden gemengd met separaat bereide H2A-H2B dimeren en DNA nucleosomen 16 monteren. De uiteindelijke opbrengsten en de algemene prestaties van het gewijzigde protocol zijn vergelijkbaar met de oorspronkelijke.
Het protocol is sterk afhankelijk van het vermogen van de twee affiniteitkolommen om relevante soorten efficiënt binden en aldus verkregen eind hoogzuivere asymmetrische complexen. Het is lastig om direct en concreet bewijs dat de uiteindelijke gezuiverde complex is inderdaad enige asymmetrische bieden. Echter, WB van monsters uit de zuiveringsstappen van de relevante antilichamen betrouwbare indicatie voor het succes van de tandem zuiveringsschema (figuur 3). Dezelfde resultaten, en dus extra zekerheid werden verkregen door analyse van dezelfde monsters op de aanwezigheid van de affiniteitstags NMR methoden 16. Toch, als WB-analyse geeft verontreiniging van asymmetrische soorten met symmetrische degenen, een kleine variatie kan worden bij de eerste zuiveringsstap (Ni-NTA) dat de uitkomst kan verbeteren aangenomen. Met name in plaats van een isocratische elutie, een imidazool gradien t elutie (10-250 mM) kunnen worden toegepast en dan alleen de eerste elutiefracties die sterk verrijkt in de asymmetrische soorten samengevoegd en lopen door de affiniteitskolom. Dit kan worden bepaald door analyse van de WB elutiefracties op de aanwezigheid van het strep affiniteitslabel.
De keuze van de isotoop-label ten opzichte van de PTM plaats is vrij flexibel omdat de meeste gevallen, NMR kan afbeelden dezelfde doorvoermechanisme met beide 1 H- 15 N en 1 H- 13 Ccorrelation spectra. Voor sommige aminozuren, zoals lysinen, de chemische verschuiving dispersie voor de zijketen 1 H- 13 C resonanties nogal beperkt. Bovendien, wanneer de doelplaatsen van een lysine-modificerende enzym bekend, plaatsspecifieke uitlezen van lysine PTMs is niet eenvoudig. In deze gevallen alternatieve methoden maken gebruik van plaats-selectieve 13 C-labeling, samen met semi-synthetische productie histon"> 21 of het gebruik van nieuw gevestigde NMR pulssequenties die specifieke detectie van wijziging in staat stelt door selectieve excitatie routines 22. NMR spectroscopie geeft tamelijk lage gevoeligheid. Hierbij worden relatief veel nucleosomen (pM range) nodig voeren enzymreacties. Dit voorkomt de ontwikkeling van de methode om een hoge-doorvoer opstelling.
Tegelijkertijd heeft een nieuwe chemische werkwijze ingevoerd voor de synthese van chemisch zuivere asymmetrisch gemodificeerde nucleosomen met hoge opbrengsten, dragen gedefinieerd fosforylatie 23. Deze aanpak is gebruikt in combinatie met fluorografie, met PTM overspraak ondrzoeken. Als gevolg van de lage resolutie vermogen van fluorographic methoden bij het opsporen van PTMs, werden conclusies indirect afgeleid door het vergelijken van de totale enzymatische activiteiten op een reeks van nucleosomen dragen verschillende combinaties van symmetrische en asymmetrische PTM's, in plaats vandan door directe observatie van PTM reacties op de overeenkomstige plaatsen van iedere zuster histon. Echter, integratie van isotopisch gemerkte histonen en het gebruik van NMR-spectroscopie voor PTM uitlezing kan de hiervoor genoemde werkwijze moet een extra hulpmiddel voor hoge resolutie PTM analyse asymmetrisch gemodificeerde nucleosomen.
In verband met de identificatie van nieuwe soorten asymmetrisch gemodificeerde nucleosomen in de toekomst, de huidige methode is gericht op een hoge-resolutie hulpmiddel vormen voor het analyseren in cis en in trans PTM crosstalk reacties op nucleosomale substraten. In het bijzonder, van groot belang is het decoderen van crosstalk mechanismen die aanleiding geven tot bivalent nucleosomen 24 die asymmetrisch bevatten, zowel transcriptioneel actief en repressief PTMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteur bedankt Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlijn) voor het leveren van wet-lab ruimte en infrastructuur om experimenten en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) uit te voeren voor de financiering van het werk door middel van een onderzoeksbeurs (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2H2PO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6 - 8 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe | ||
| Buffer name | Component | ||
| Unfolding Buffer | 7 M Guanidinium HCl | ||
| 20 mM Tris, pH 7.5 | |||
| 10 mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10 mM Tris, pH 7.5 | ||
| 2 M NaCl | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 2 mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25 mM Na2H2PO4, pH 6.8 | ||
| 25 mM NaCl | |||
| 2 mM DTT |
References
- Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R.
- Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A.
- Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
- Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
- Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
- Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
- Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
- Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
- Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
- Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
- Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
- Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
- Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
- Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).
