Summary
Detta protokoll beskriver beredning av nukleosomer innehållande differentiellt isotopmärkta syster histoner. Samtidigt, kan asymmetriskt posttranslation modifierade nukleosomer genereras efter att ha använt en premodified histon kopia. Dessa preparat kan lätt användas för att studera modifieringen hörningsmekanismer, samtidigt på båda syster histoner, genom användning av högupplösande NMR-spektroskopi.
Abstract
Asymmetriskt modifierade nukleosomer innehåller två kopior av en histon (syster histoner) dekorerad med distinkta uppsättningar av posttranslationella modifikationer (PTMs). De nyligen identifierade arter med okända medel för etablering och funktionella konsekvenser. Aktuella analysmetoder är otillräckliga för att detektera kopian specifika förekomsten av PTMs på nukleosomala syster histoner. Detta protokoll utgör en biokemisk metod för beredning av nukleosomer innehållande differentiellt isotopmärkta syster histoner in vitro. Den genererade komplexa kan också vara asymmetriskt modifieras efter bland annat en premodified histon pool under återvikning av histon subcomplexes. Dessa asymmetriska nukleosomen beredningar kan lätt bringas att reagera med histonmodifierande enzym att studera modifierings överhöringsmätare mekanismer som åläggs av asymmetriskt förväg införlivad PTM med användning av kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Bestämt är modifieringsreaktioner irealtid kan mappas självständigt på de två syster histoner genom att utföra olika typer av NMR-korrelationsexperiment, skräddarsydda för respektive isotop typ. Denna metod ger möjlighet att studera överhörning mekanismer som bidrar till bildandet och utbredningen av asymmetriska PTM mönster på nukleosomala komplex.
Introduction
Eukaryot DNA är tätt förpackad i cellkärnor i kromatin. Den grundläggande byggstenen i kromatin är nukleosomen kärnpartikeln som innehåller ~ 147 bp DNA virad runt en octameric komplex består av två exemplar vardera av de fyra kärnhistonerna (H3, H4, H2A, H2B). Histonproteiner hyser en uppsjö av posttranslationella modifikationer (PTMs). Dessa kovalenta substitutioner medföra förändringar i kromatinstrukturen, både direkt genom att påverka fysikalisk kemi i systemet och indirekt genom att rekrytera kromatin-remodeling aktiviteter 1, 2, 3. Genom dessa medel, histon PTMs kontrollera kromatin tillgänglighet och därmed reglera alla DNA-baserade cellulära funktioner 4.
PTMs installeras av histon-modifierande enzymsystem i huvudsak på de ostrukturerade N-terminala segment (svansar) av nukleosomen införlivade kärn histones. På grund av de många modifieringsställen på relativt kort sekvens av histon svansar, PTMs påverkar varandra genom att inducera eller blockera efterföljande modifieringsreaktioner, en effekt som kallas modifiering överhörning 5. På grund av den totala symmetriska arkitektur nukleosomen var modifieringsreaktioner och överhörningsmekanismer tros ske på samma sätt på de två kopior av varje nukleosomal histon (syster histoner). Detta koncept har nyligen utmanade och därefter motbevisas. Särskilt in vitro enzymatiska analyser om fri histon H3 svans peptider och på nukleosomer visade att en uppsättning av H3 kinaser infört fosforylering på ett asymmetriskt sätt 6. Dessutom avslöjade affinitetsrening baserad LC-MS / MS-analys förekomsten av asymmetriskt H3-metylerade nukleosomer i flera typer av eukaryota celler 7. Således, asymmetriskt modifierade nukleosomer utgör nya arter, ochverktyg behövs för att avslöja de mekanismer som styr deras bildning och analysera överhörning effekter som denna asymmetri kan utöva.
Vanligen, Western Blotting (WB) och masspektrometri (MS) -analys har använts för att detektera histon PTMs. Trots sin enkel applicering, WB lider specificitet / Korsreaktivitet problem. Ovanpå det, är den oförmögen att utföra samtidig multi-PTM analys och direkt kvantifiering av modifieringsreaktioner 8. Å andra sidan, använder MS-analys sofistikerad instrumentering som kräver hög nivå utbildning, men ger hög specificitet såväl som samtidig kartläggning och kvantifiering av multipla PTMs 9. Dock båda metoderna är störande och de nukleosomala komplexen dissocieras före analys, vilket ger upphov till en blandning av histoner och / eller histon-härledda peptider. Denna manipulation tar bort förmågan att särskilja oberoendemodifieringsreaktioner som inträffar på var och en av de två syster histoner och rapportera kopian specifika modifiering status nukleosomala histoner.
Kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi utvecklats som en alternativ metod för att kartlägga PTM reaktioner. NMR är nondisruptive och sålunda tillåter övervakning av PTM evenemang i en realtids sätt på rekonstituerade blandningar, och även i intakta celler 10, 11. Utvecklingen av rutiner för snabb datainsamling såväl som för hög upplösning kartläggning baserad på 2D heteronukleära korrelationsmetoder för isotopmärkta (15 N och / eller 13 C) prover 12 tillät samtidig kartläggning av olika typer av PTMs, såsom som serin / treonin / tyrosinfosforylering, lysin acetylering / metylering, och arginin metylering 13. Beroende på PTM under utredning, 15 N- eller 13 C-märkning protocols kan användas för att markera det protein funktionell grupp som tjänar som en modifikation reporter. Följaktligen kan PTM kartläggning utföras genom att följa den karakteristiska kemiska skift förskjutning av motsvarande funktionella gruppen "avkänning" förändringen på den kemiska miljön. I de flesta fall kan både NH och CH kemiska grupper användas för att rapportera utvecklingen av PTM av intresse.
Den nuvarande protokollet beskriver genereringen av nukleosomer innehållande differentiellt isotopmärkta syster histoner. Den kombinerar flexibiliteten hos NMR-spektroskopi för att kart PTMs med användning av både en H- 15 N och 1 H- 13 C-korrelationsspektra med användning av olika proteinaffinitetsmarkörer för rening av de utvalda rekonstituerade histonkomplex. Noterbart använder protokollet två olika pooler av en viss histon för nukleosomen beredning. Dessa pooler är differentiellt isotopmärkt (ett med
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Nukleosomer med Differentiellt Isotopmärkt (och asymmetriskt Ändrad) Sister Histoner
OBS: Den nuvarande protokollet beskriver beredning av nukleosomer med differentiellt isotopmärkt histon H3. För detta ändamål har två pooler av histon H3 används; en var 15 N-märkt och innehöll en 6xHis-tag vid N-terminalen och den andra var 13 C-märkt och innehöll Strep peptiden (WSHPQFEK) smält vid N-terminalen. Båda taggar separerades från den nativa H3-sekvens med en Tobacco Etch Virus (TEV) proteasigenkänningsställe. För att förbereda ytterligare asymmetriskt modifierade nukleosomer, är en av de två H3 pooler ingår i en premodified formulär. Premodification av en histon poolen kan utföras genom omsättning av isotopmärkt histon av intresse med den respektive histon-modifierande enzym i närvaro av de nödvändiga för varje typ av reaktions kofaktorer / PTM givare 16. Den effektiva placeringen av respektive PTM kan bedömas genom NMR-spektroskopi eller masspektrometri. Mängderna av histoner / DNA som används här är grova rekommendationer för att få en nukleosomen preparat med en ungefärlig koncentration av 10 ^ M (mätt som DNA-koncentration på 260 nm) .Detta slutliga utbytet är tillräckligt för att spela bra kvalitet NMR-spektra med relativt korta hämtningstider.
- Beredning av en histon oktamer med differentiellt isotopmärkt (och asymmetriskt modifierad) histon H3
NOT: Rekombinant histonproteiner kan produceras i mg kvantiteter i BL21 (DE3) pLysS-celler 14. För att erhålla isotopmärkta histoner, är samma uttryck / reningsprotokoll följdes med undantag av användning av för bakterietillväxt ett minimalt medium innehållande 15 NH4CI och / eller 13 C-glukos som kväve- och kolkällor, under 15 N- eller 13 C-märkning respectitivt. Renade histoner stor utsträckning dialyseras mot 5 mM β-merkaptoetanol och lagras lyofiliserades före användning.- Upplösa lyofiliserade histon alikvoter, innehållande ~ 5 mg av varje histon i 1 ml utvikning buffert (7 M Guanidinium-HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM DTT). Inkludera båda typerna av histon H3. Blanda genom pipettering och inte virvel. Håll rören på is i 30 minuter för att möjliggöra fullständig utfällning.
- Bestämma den exakta koncentrationen av varje histon genom mätning av absorbansen vid 280 nm mot utvikning buffert och med användning av extinktionskoefficienter beräknade med ProtParam verktyget i ExPASy portalen. 15
- Blanda kärnhistonerna till ekvimolära förhållanden, med tanke på att inkludera 50% vardera av de två histon H3 pooler. Börja med att använda hela innehållet i mindre koncentrerad histon och lägga till alla de andra i enlighet därmed.
- Anpassa den slutliga proteinkoncentrationen till cirka 1 mg / ml med användning av uppveckling buffert.
- överfr blandningen till en 6 kDa-cutoff dialysmembran och dialysera mot 2/1 L kyld återveckningsbuffert (10 mM Tris pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) vid 4 ° C. Ändra bufferten åtminstone en gång efter dialys har fortskridit under minst 3 timmar. Utföra en slutlig dialys O / N vid 4 ° C.
- Samla dialys material och ta bort eventuella fällningar genom centrifugering i en mikrofug under 5 minuter vid 4 ° C på högsta hastighet (normalt ingen nederbörd bör observeras). Bestämma oktamer koncentration genom mätning av absorbansen vid 280 nm. I beräkningarna använder tillsatta utsläckningskoefficienterna av histoner, med tanke på att fördubbla varje värde.
- Koncentrera till en slutlig volym på ~ 2 ml med användning av en 10 kDa-cutoff centrifugal filterenhet. Räkna oktamer koncentration och uppskattning förlust. Vid denna punkt, en oktamer koncentration mellan 50 - bör 100 iM erhållas.
- Anslut gelfiltreringskolonn (anges i tabellen för material) till enFPLC-system och i jämvikt med 2 kolonnvolymer (CV) av 0,22 | j, m-filtrerad och avgasad återveckningsbuffert vid en flödeshastighet av 1 ml / min och ett tryck gräns på 0,5 MPa.
OBS: Den gelfiltrering försök utförs i kylrummet eller i en kall skåp. - Injicera koncentrerade materialet med användning av en flödeshastighet av 1 ml / min och samla 1,0 - 1,5 ml fraktioner.
- Följ kromatografiska profilen och observera histon oktamer eluering vid ~ 65 - 68 ml.
OBS: En liten skuldra elueringstoppen och en topp vid ~ 80 ml indikerar förekomsten av fria H3-H4 tetramerer och H2A-H2B dimerer respektive. - Köra 20 | il av varje insamlad fraktion i en 18% SDS-PAGE-gel.
OBS: Späd proverna med en faktor av åtminstone två med vatten innan du lägger dem på gel för att minska den höga saltkoncentrationen och därmed undvika snedvridning. Detsamma gäller för efterföljande SDS-PAGE-analyser av prover i återveckningsbuffert. - Pool relevant fraTGÄRDER innehåller rena oktamerer bedöms av en jämn fördelning av de 4 histoner på den färgade gelén och bestämma koncentration som tidigare (steg 1.1.7).
- Ansluta en 1 ml Ni-NTA-kolonn (Table of Materials) till ett FPLC-system och jämvikt med 10 CV av 0,22 | j, m-filtrerad och avgasad återveckningsbuffert vid en flödeshastighet av 1 ml / min.
OBS: Den Ni-NTA-kromatografi bör utföras i det kalla rummet eller i en kall skåp. - Passerar renad oktamer genom Ni-NTA med användning av en flödeshastighet av 1 ml / min.
- Samla genomströmning och hålla prover för SDS-PAGE / WB-analys (20 | il och 4 | il, respektive). Därefter, tvätta kolonnen med 10 CV av återveckningsbuffert eller tills en baslinje signal uppnås.
- Eluera med 10 CV av återveckningsbuffert innehållande 250 mM imidazol med användning av en flödeshastighet av 1 ml / min. Hålla prover för SDS-PAGE / WB-analys (20 | il och 4 | il, respektive).
- Jämvikt en 1 ml affinitetskolonn av acommercial streptavidin (Table of Materials) med 10 CV återveckningsbuffert innehållande 250 mM imidazol med hjälp av en inställnings parti / gravitationsflöde.
OBS: Detta kromatografiska steg bör utföras i kylrummet. - Pass Ni-NTA eluering genom den kommersiella streptavidin affinitetskolonnen.
- Samla flödet genom och hålla prover för SDS-PAGE / WB-analys (20 mikroliter och 4 mikroliter, respektive). Därefter, tvätta med 10 CV återveckningsbuffert.
- Eluera med 10 CV återveckningsbuffert innehållande 2,5 mM destiobiotin. Håll prover för SDS-PAGE / WB-analys (20 och 4 mikroliter respektive).
- Mäta oktamer koncentration, tillsätt 10 gånger mindre TEV-proteas och låt reaktionen fortgå över natten vid 4 ° C i en standard centrifugrör av plast.
OBS: Den nödvändiga mängden TEV att erhålla fullständig nedbrytning (avlägsnande av affinitetsmarkörer) beror på ursprung (konstruera) och aktiviteten (nygjorda, är rekombinant TEV meraktiv jämfört med en lagras under långa perioder vid - 80 ° C). Försök inledningsvis lägga 10 gånger mindre TEV jämfört med oktamer (beräknad som proteinkoncentrationer) och justera därefter. - Kontrollera för effektiv spjälkning genom att köra 20 | il av blandningen före och efter TEV tillsats på en 18% SDS-PAGE-gel. Om matsmältningen inte är fullständig, tillsätt mer TEV proteas och fortsätta inkubation under ytterligare 3-4 timmar.
- Dialysera prov mot återveckningsbuffert med hjälp av en 50 kDa-cutoff dialysmembran för att avlägsna TEV proteas och justera buffertkomposition.
- Koncentrera den renade asymmetrisk oktameren med användning av ett 10 kDa-cutoff centrifugal filterenhet (samma filterenhet från steg 1.1.7 kan också användas) till en volym av 1,0-2,0 ml. Mäta den slutliga koncentrationen. Antingen använda snart efter för nukleosomen rekonstituering eller anpassa sig till 50% (volym / volym) glycerol för att lagra vid -20 ° C under längre perioder. Vid denna tidpunkt och förväntar sig åtminstone 70% förlust under de tidigare stegen, the oktamer koncentrationen bör vara i området från 20 till 50 ^ M.
- nukleosomen rekonstitution
- Om oktamer lagrades i 50% glycerol, dialys över natten vid 4 ° C mot återveckningsbuffert innan du fortsätter med nukleosomen beredning.
- Justera DNA (innehållande en nukleosomen-positionering sekvens) saltkoncentrationen till 2 M NaCl med hjälp av en 5 M NaCl stamlösning.
OBS: Det renade DNA isoleras antingen efter rening av en plasmid som innehåller flera kopior av den önskade sekvensen eller syntetiseras genom PCR-amplifiering bör lagras koncentrerades till ~ 50 ^ M i vatten eller en standard Tris-EDTA-buffert. - Blanda oktamer och DNA med det optimala förhållandet bestäms från en småskalig test. Använd återveckningsbuffert för att justera den slutliga volymen till ~ 3,0 ml. Tillsätt alltid oktameren sist för att förhindra möjligheten att blanda oktamer och DNA på <2 M saltkoncentrationer.
- Utför inledande små scale reconstitutions att bestämma oktamer: DNA-förhållande som leder till optimala nukleosomen avkastning. För detta montera tre reaktioner av 0,9: 1,0, 1,0: 1,0 och 1,1: 1,0 DNA: oktamer förhållanden i en volym mellan 50-100 mikroliter. Normalt använder en koncentration av 5 pM DNA.
- Fortsätta med rekonstitution såsom beskrives nedan (steg 1.2.4-1.2.8) och i slutet, uppskatta mängden lösliga och god kvalitet rekonstituerade nukleosomen genom mätning av DNA-koncentrationen vid 260 nm och genom att köra en 6% nativ-PAGE-DNA-gel , färgades med etidiumbromid, respektive (figur 5A).
- Överföra blandningen till en 6 kDa-cutoff dialysmembran och dialysera mot en L av återveckningsbuffert över natten vid 4 ° C.
- Reducera saltkoncentrationen av dialysbuffert i en stegvis sätt från 2, till 0,85, 0,64, och 0,2 M NaCl respektive. Hålla provet i varje buffert under minst 3 timmar. Ibland fällning bildas efter den sista övergången. I det här fallet continue dialys som planerat och avlägsna fällningen genom mikrocentrifugering vid slutet av nästa steg.
- Överföring dialysmembran i en bägare med ett L av analysbuffert (25 mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 pH 6,8, 25 mM NaCl, 2 mM DTT) och fortsätt dialys O / N vid 4 ° C.
- Samla provet, avlägsna eventuell fällning bildades vid steg 1.2.5 genom centrifugering i en mikrofug under 5 minuter vid 4 ° C på maximal hastighet och koncentrera med användning av en 30 kDa-cutoff centrifugal filterenhet till en slutlig volym av ~ 300 mikroliter.
- Mät DNA-koncentrationen vid 260 nm, köra en 18% SDS-PAGE-protein-gel (4 mikroliter av provet) och en 6% nativ-PAGE-DNA-gel (0,2 mikroliter av provet) och lagra provet vid 4 ° C under flera veckor. Den slutliga koncentrationen bör vara i intervallet 10 till 20 ^ M.
2. NMR-analys av modifieringsreaktioner på två syster Histoner
OBS: Tilldelning av2D 1 H- 15 N korrelationsspektra av nukleosomala histon svansar kan hittas på referenser 16, 17, 18. Dessutom uppdrag av CH x grupper av lysiner, seriner och treoniner 2D 1 H- 13C korrelationsspektra kan hittas på referens 16.
- NMR inställning och registrering av referensspektra
OBS: Enzymatiska analyser utfördes med användning av 140 mikroliter av nukleosomen provet i analysbuffert till en 3-mm NMR-rör vid 300 K. Olika NMR-rör med andra provvolymer kan användas också. Den tidigare nämnda temperaturen är lämplig för att uppnå god kvalitet 1 H- 15 N korrelationsspektra av nukleosomala histon svansar och goda enzymatiska aktiviteter. 2D-SOFAST-HMQC en H- 15 N och 2D-HSQC en H- 13C-spektra registrerades respektive med en inställnings thatt ger liknande hämtningstider. Typiska förvärvsparametrar är 128 transienter med 1.024 (1 H) x 128 (15 N) komplexa punkter och 32 transienter med 1.024 (1 H) x 64 (13 C) komplexa punkter för två olika typer av korrelationsspektra. För både 2D spektra förvärvstiden var ~ 30 min.- Ställ in 300 K som provtemperaturen i spektrometern. Tillsätt 10% D2O (volym / volym) till provet som ska användas för spektrometern frekvenslåsning.
- Placera provet i spektrometern och utföra grundläggande operationer (låsning, tuning, mellanlägg). Dessutom bestämma optimala pulslängder och allmänna ackvisitionsparametrar.
- Spela 1D och 2D en H- 15 N och en H- 13C referensspektra.
- Processreferensspektra och säkerställa att de signaler som skall användas för att kartlägga de modifieringsreaktioner är väl löst och har bra intensiteter.
- Återskapa prov och överför jagt till ett mikrofugrör.
- Installationen av den enzymatiska reaktionen, NMR övervakning och kvantitativ analys
- Kopiera och ordna en serie av interfolierade 2D 1 H- 15 N och en H- 13C spektra. Sikta på en total förvärvstid för flera timmar och justera därefter i en ny körning baserat på de enzymatiska satser erhållna från den första reaktionen.
- Lägg till provet erforderliga kofaktorer för respektive typ av modifieringsreaktionen (1 mM ATP / 2 mM MgCl2 för fosforylering, 1 mM acetyl-CoA för acetylering, 1 mM SAM för metylering, etc.).
- Tillsätta enzymet av intresse, blanda genom pipettering, överförs prov tillbaka i NMR-röret och därefter i spektrometern (utföra dessa operationer snabbt).
OBS: Om det inte finns någon data om den förväntade enzymatisk aktivitet, justera substratet-till-enzym molförhållande till 10: 1. Gör en första provkörning och justera förden verkliga körningen. - Gör en snabb automatisk mellanlägg och använda resten av parametrar från referensspektra.
- Initiera serie av interfolierade 2D 1 H- 15 N och en H- 13C spektra.
- Följa framskridandet av reaktionen i realtid och stoppa förvärv när reaktionen når fullbordan eller en önskad nivå.
- Processspektra som förut med exakt samma parametrar.
- Upprepa hela körningen med användning av en annan förvärvs För att de båda typerna av korrelationsspektra. Om i det första experimentet en 1 H- 15 N korrelation var första i serien, börjar nu med en 1 H- 13 C korrelation. Genom denna och som har samma uppsamlingstiden för båda spektra, är det möjligt att plotta och jämföra PTM reaktioner på båda differentiellt isotopmärkta histoner på samma tidsskala. Dessutom är det möjligt att beräkna medelvärden och barer tomt fel.
OBS: En thorough beskrivning av metoder för NMR signalanalys och efterföljande kvantifiering av enzymatiska reaktioner kan hittas här 19. - Välja NMR-signaler från varje tidsförlopp-NMR-spektrum som rapporterar fortskridandet av reaktionen och beräkna deras relativa signalintensiteterna med användning av en visualisering och analys programvara för NMR-spektra. Göra detta för signaler som rapporterar den omodifierade liksom det modifierade tillståndet. Extrahera modifieringsnivåer.
- Rita de beräknade värdena för modifiering nivåer mot reaktionstiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Korrekt återveckade octameric arter isoleras efter en körning av beredning blandningen genom en gelfiltreringskolonn (Figur 2). Den färdigberedda octameric pool som innehåller tre olika typer av oktamerer utsätts för tandem affinitetsreningsschemat. Prover samlas från alla steg och analyserades genom SDS-PAGE och därefter WB. Kontroll av korrekt genomförande av protokollet som resulterar i isolering av asymmetriska arter uppnås genom att följa närvaron av de två affinitetsmarkörer (His- och Strep-) i de olika proverna (Figur 3). Därefter är de affinitetsmarkörer bort efter TEV-proteas klyvning (figur 4). Asymmetriska oktamerer avyttrats affinitetsmarkörer används för att rekonstruera asymmetriska nukleosomer. Inledningsvis görs ett litet test skala rekonstituering som används för att bestämma den optimala molära förhållandet av DNA: oktamer som resulterar i en högge bildning av en monodispers komplex. Därefter optimerade blandningsförhållande används för att rekonstruera nukleosomer i en storskalig. Nukleosomen reconstitutions analyseras av protein / DNA-geler och NMR-spektroskopi för korrekt montering och närvaron av de differentiellt isotopmärkta syster H3 histoner respektive (Figur 5). Ett tillämpningsexempel visas i figur 6. Bestämt differentiellt isotopmärkt och asymmetriskt fosforylerade på H3S10 nukleosomer omsattes med Gcn5 acetyltransferas, och acetylering av H3K14 på båda H3 kopior följs i realtid genom NMR-spektroskopi. Analysen visar att H3S10 fosforylering stimulerar H3K14 acetylering av Gcn5 i cis jämfört med i trans.
Figur 1: Flödesschema för framställning av Differentiellt Isotope-labeled (och asymmetriskt Ändrad) Nukleosomer. (A) Beredning och tandem affinitetsrening av differentiellt isotopmärkt (och asymmetriskt modifierad) histon oktamerer. (B) nukleosomen beredning genom att kombinera de renade asymmetriska oktamerer och en DNA nukleosomen positionering sekvens. (C) NMR övervakning av i-cis och trans modifiering överhörning efter blandning av asymmetriskt modifierade och differentiellt isotopmärkta nukleosomer med histonmodifierande enzym. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Beredning av Histon oktamerer. En gelfiltrering elueringsprofilen för den återveckade histon blandning. Den huvudtopp vid ~ 70 mL motsvarar histon oktamerer. En 14 - 20% gradient SDS-PAGE-gel (Coomassie Blue-färgning) av eluerade fraktioner motsvarande den oktamer toppen visar korrekt histon stökiometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Rening av Asymmetric Histon oktamerer. 14-20% gradient SDS-PAGE-gel (Coomassie-färgning) och WB mot de His- och Strep- affinitetsmarkörer av proven från de olika stegen i tandem affinitetsreningsschema. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Borttagning av affiniteten Taggar. 18% SDS-PAGE-gel (Coomassie-färgning) av renade asymmetrisk histon oktamerer före och efter blandning med TEV-proteaset. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Biokemisk och NMR karaktärisering av differentiellt Isotopmärkt Nukleosomer. (A) 6% nativ-PAGE-DNA-gel (etidiumbromidfärgning) av en liten test skala nukleosomen rekonstituering med användning av olika molära förhållanden av DNA: oktamer (vänster). 6% nativ-PAGE-DNA-gel (etidiumbromidfärgning) av en storskalig nukleosomen rekonstituering med användning av optimerade DNA: oktamer molförhållande (höger). (B) 18% SDS-PAGE proteingel (Coomassie-färgning) av rekonstituerad nukleosomer visar korrekt stökiometri av de fyra kärnhistonerna. (C) en H- 15 N SOFAST-HMQC-spektrum för 15 N-märkt H3 kopia av differentiellt isotopmärkta nukleosomer (endast H3 tail rester är synliga - proteinkärnan är osynlig på grund av den långsamma tumlande hastigheten). (D) en H- 13 C HSQC-spektrum för 13 C-märkt H3 kopia av differentiellt isotopmärkta nukleosomer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: NMR Övervakning av i OSS och i träns Ändring Cross-talk infördes genom asymmetrisk Fosforylering av H3S10 på H3K14 Acetylering aktivitet av Gcn5 acetyltransferas. (A) Schematisk bild av differentiellt isotopmärkt och asymmetriskt fosforylerade på H3S10 nukleosomer reagerade med H3K14 acetylering kartläggning Gcn5 acetyltransferas och i cis och träns. (B) en H- 15 N SOFAST-HMQC och en H- 13C HSQC spektra (utvalda områden) av de asymmetriska nukleosomer före och efter reaktion med Gcn5. (C) Tids löst NMR övervakning av H3K14 acetylering av Gcn5 på asymmetriskt H3S10 fosforylerade nukleosomer. Medelvärden och variations (felstaplar) från två oberoende experiment visas. Återges med tillstånd 16. Klicka här för att se en större version avden här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För nukleosomen beredning utnyttjar det nuvarande protokollet en 165 bp lång DNA-mall innehållande 601-Widom nukleosomen positioneringssekvens 20, men liknande resultat förväntas med hjälp av olika längder av DNA-mallar. Protokollet designades och anställda som använder asymmetriska typer av histon H3. Med samma princip kan metoden tillämpas även för de övriga kärnhistonerna och dessutom kan användas för att rekonstruera komplex som har två distinkta kärnhistonerna med olika isotopetiketter. Protokollet kan också lätt modifieras för att initialt rekonstituera histon under komplex och inte direkt Histon oktamerer. Efter denna modifiering, kan asymmetriska H3-H4 tetramerer beredas genom att använda samma tandem reningsschemat. Den senare blandas med separat ombildade H2A-H2B dimerer och DNA att montera nukleosomer 16. De slutliga avkastning och det totala resultatet av den modifierade protocol liknar den ursprungliga.
Protokollet är starkt beroende av förmågan hos de två affinitetskolonner för att effektivt binda de berörda arterna och därmed ge i slutet högrena asymmetriska komplex. Det är besvärligt att ge direkt och konkret bevis på att den slutliga renade komplexet är verkligen och endast asymmetrisk. Men ger WB analys av prover från alla reningsstegen med relevanta antikroppar tillförlitliga indikationer för att lyckas med tandemreningsschemat (Figur 3). Samma resultat, och därmed ytterligare försäkran, erhölls genom att analysera samma prover med avseende på närvaro av de affinitetsmarkörer genom NMR-metoder 16. Men om WB-analys indikerar kontaminering av asymmetriska arter med symmetriska sådana, en liten variation kan antas vid första reningssteget (Ni-NTA) som kan förbättra resultatet. Särskilt, i stället för en isokratisk eluering, en imidazol gradien t eluering (10-250 mM) kan användas och då endast de första elueringsfraktionerna som är mycket anrikade på de asymmetriska arter slås samman och kör genom affinitetskolonnen. Detta kan bedömas genom WB-analys av elueringsfraktionerna för närvaron av strep affinitetsmärkning.
Valet av den isotopmärke i förhållande till PTM av intresse är ganska flexibelt, eftersom i de flesta fall, är NMR i stånd att kartlägga samma PTM med användning av både en H- 15 N och 1 H- 13 Ccorrelation spektra. För vissa aminosyror, som lysiner, är relativt begränsat det kemiska skiftet dispersionen för sidokedjan 1 H- 13 C-resonanser. Dessutom, när de målplatser av en lysin-modifierande enzym är okända, är inte okomplicerat platsspecifik avläsning av lysin PTMs. I dessa fall, alternativa metoder utnyttjar ställesselektiv 13 C-märkning, i kombination med halvsyntetisk histon produktion"> 21 eller användning av nybildade NMR pulssekvenser som möjliggör specifik detektion av modifiering stater genom selektiv excitation rutiner 22. NMR-spektroskopi ger ganska låg känslighet. I detta avseende är relativt höga halter av nukleosomer (iM range) som krävs för att utföra enzymatiska reaktioner. Detta förhindrar utvecklingen av metoden till en hög genomströmning setup.
Samtidigt har en ny kemisk metod införts för syntes av kemiskt rena, asymmetriskt modifierade nukleosomer, med höga utbyten, bärande definierade PTMs 23. Denna metod har använts i kombination med fluorografi, studera PTM överhörning mekanismer. På grund av den låga upplösningsförmåga fluorografiska metoder i detektera PTMs ades slutsatser härledd indirekt genom att jämföra de totala enzymatiska aktiviteter på en uppsättning av nukleosomer bär olika kombinationer av symmetriska och asymmetriska PTMs, snarareän genom direkt observation av PTM reaktioner på motsvarande platser i varje syster histon. Men inkorporering av isotopmärkta histoner och användningen av NMR-spektroskopi för PTM avläsning kan utgöra ovan nämnda metod ytterligare ett verktyg för hög upplösning PTM analys av asymmetriskt modifierade nukleosomer.
I samband med identifieringen av nya typer av asymmetriskt modifierade nukleosomer i framtiden, syftar den nuvarande metoden att utgöra en hög upplösning verktyg för att analysera i cis och trans PTM överhörning reaktioner på nukleosomala substrat. Särskilt av stor betydelse är avkodning av hörn mekanismer som ger upphov till bivalenta nukleosomer 24 som innehåller asymmetriskt, både transkription aktiva och repressiva PTMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författaren tackar Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlin) för att ge våt-lab utrymme och infrastruktur för att utföra experiment och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) för att finansiera arbetet genom ett forskningsbidrag (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2H2PO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6 - 8 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe | ||
| Buffer name | Component | ||
| Unfolding Buffer | 7 M Guanidinium HCl | ||
| 20 mM Tris, pH 7.5 | |||
| 10 mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10 mM Tris, pH 7.5 | ||
| 2 M NaCl | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 2 mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25 mM Na2H2PO4, pH 6.8 | ||
| 25 mM NaCl | |||
| 2 mM DTT |
References
- Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R.
- Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A.
- Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
- Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
- Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
- Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
- Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
- Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
- Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
- Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
- Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
- Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
- Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
- Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).
