Abstract
अनैरोबिक जीवाणुओं के प्रति निर्देशित नई दवा के विकास के साथ एंटीबायोटिक कार्रवाई का आकलन कठिन और तकनीकी रूप से मांग है। संभव एमओए में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, एंटीबायोटिक एक्सपोज़र से जुडी हुई आकृति परिवर्तनों को स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग करके देखा जा सकता है। पारंपरिक मार घटता से एसईएम इमेजिंग को एकीकृत करना दवा की कार्रवाई में हमारी अंतर्दृष्टि को सुधार सकता है और दवा विकास प्रक्रिया को आगे बढ़ा सकता है। इस आधार का परीक्षण करने के लिए, ज्ञात लेकिन अलग-अलग एमओए (वैनोकॉइसिन और मेट्रोनिडाजाइल) के साथ ड्रग्स और एसईएम अध्ययनों को मार डालो। सी। स्फेसिइल कोशिकाएं (आर 20291) 48 घंटे तक एंटीबायोटिक के साथ या बिना उपस्थित थे। 48 घंटे के अंतराल के दौरान, एंटीबायोटिक प्रभावकारिता निर्धारित करने और एसईएम पर इमेजिंग के लिए कई समय बिंदुओं पर कोशिकाओं को एकत्र किया गया। पिछली रिपोर्ट, वैनकॉमिसिन और मेट्रोनिडाजोल के साथ संगत 24 घंटे के उपचार के बाद बृहदान्त्र संबंधी गतिविधि में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई गई थी, जिसे कॉलोनी-फॉर्मिंग यूनिट (सीएफयू) द्वारा मापा गया थाटिंग। एसईएम इमेजिंग का प्रयोग करके हमने निर्धारित किया है कि मेट्रोनिडाजोल के नियंत्रण और वैनकॉमिसिन की तुलना में सेल लंबाई (> प्रत्येक एंटीबायोटिक के लिए सेल लंबाई में 50% की कमी; पी <0.05) पर महत्वपूर्ण प्रभाव था। जबकि दवा के उपचार के प्ररूप प्रतिकृति इस तरीके से पहले प्रलेखित नहीं किए गए हैं, वे दवा के एमओए से इमेजिंग और मापन की बहुमुखी प्रतिभा और विश्वसनीयता और अन्य प्रयोगात्मक यौगिकों के लिए इस तकनीक के आवेदन का प्रदर्शन करने के अनुरूप हैं।
Introduction
क्लॉस्ट्रिडियम डिसिफेइल एक ग्राम पॉजिटिव है, बीजाणु बनाने वाला जीवाणु है, जो यूएस में सालाना लगभग 500,000 संक्रमणों का कारण बनता है और इसे केंद्र के रोग नियंत्रण और रोकथाम (सीडीसी) के लिए खतरे का स्तर तत्काल रोगजन्य माना जाता है, जो उच्चतम स्तर का जोखिम है। 1 पिछले दशक में सी। डीफिसिले के खिलाफ गतिविधि के साथ एंटीमाइकॉयलियल्स में काफी दवा का विकास हुआ है । 2 , 3 इन विट्रो अध्ययन में दवा के विकास की प्रक्रिया का एक आवश्यक घटक है। 4 परंपरागत रूप से, इन विट्रो संवेदनशीलता और समय मारने के अध्ययनों में भविष्य के पशु को प्रमाणित करने के लिए और विवो अध्ययन में अन्य के लिए उपयोग किया जाता है।
जबकि इन विधियों ने मारने की कार्रवाई के मूल्यांकन के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, लेकिन वे औषधीय उपचार के लिए कोशिकाओं के फेनोटाइपिक प्रतिक्रिया पर कब्जा नहीं करते हैं। स्टैंडर के साथ स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) को शामिल करकेमौत के गतिज अध्ययन, एंटीबायोटिक प्रत्यक्ष प्रभाव का अधिक संपूर्ण लक्षण वर्णन संभव है। 5 , 6 , 7 यहां, हम एक ऐसी विधि प्रस्तुत करते हैं जहां एसईएम को एंटीबायोटिक उपचार की प्रभावकारीता को प्रोफाइल करने के साधन के रूप में उपयोग किया जाता है।
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Protocol
1. अलग पर्यावरण या नैदानिक स्रोतों से सी difficile अलग
- पर्यावरण पृथक: पूर्व निर्बाध कपास गेज (हल्के से 0.85% NaCl के साथ गीला हो गया) का उपयोग करना, ब्याज के किसी भी क्षेत्र की सतह (मंजिल, दरवाजा, हैंडल, शेल्फ, आदि ) को छीनने के लिए। 8 बाँझ दस्ताने पहनना सुनिश्चित करें और पूरा होने के बाद स्टेबलाइज्ड ट्यूब में स्वास को रखें।
- क्लिनिकल आइसोलेट्स (स्टूल): स्याही एनारोबिक स्थितियों के तहत 48-72 घंटे के लिए एक टीका लूप का उपयोग करके सीफ़ोक्सिटिन-साइक्लोसेरिन-फ्रुक्टोज़ अजर (सीसीएफए) पर 10 से 100 मिलीग्राम क्लिनिकल स्टूल के नमूनों का प्रयोग किया जाता है। आगे के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर cryovials में सी difficile स्टॉक की पृथक कालोनियों की दुकान। 7 , 9 , 10
- मस्तिष्क दिल जलसेक (बीएचआई) में 0.05% सोडियम taurocholate और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक एनारोबिक कक्ष में जगह के साथ पर्यावरण झाड़ू के नमूने को समृद्ध।पांच दिनों के लिए। 10000 ग्राम में संस्कृति का 1 एमएल अपकेंद्रित्र और 100 μL इथेनॉल में गोली resuspend।
- प्लेट कोशिका cycloserinecefoxitin फ्रुक्टोज़ अजर (सीसीएफए) प्लेट्स पर और एक एनारोबिक चैम्बर में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 40 से 48 घंटे के बीच में सेते हैं (50 μL)। आगे के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर cryovials में सी difficile स्टॉक की पृथक कालोनियों की दुकान।
- लेटेक्स एग्लूटीनिंग अभिकर्मक या पीसीआर का उपयोग करते हुए सी। डीफिसिल कॉलोनियों का परीक्षण करें।
2. सिल्वरिंग सी। विलक्षण और किलिंग काइनेटिक प्रक्रियाएं
- शुद्ध पर्यावरणीय या नैदानिक सी में वृद्धि करें। एनायरोबिक चैंबर में 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रक्त एगर प्लेटों पर अलग-अलग तनाव।
- एक टीका लूप के साथ एक अलग कॉलोनी ले लो, इसे 15 एमएल ट्यूब में 5 एमएल बीएचआई माध्यम में ट्रांसफर करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर एनारोबिक चैम्बर में 24 घंटे के लिए बढ़ोतरी करें।
- पूर्व-संस्कृतियों 1: 100 को लगभग 10 6 कॉलोनी बनाने वाली इकाई में पतलाएस (CFU) / एमएल में ताजा पूर्व-कम बीएचआईएस (बीएचआई प्लस 5 जी / एल खमीर निकालने और 1% एल-सिस्टीन) 0.1% सोडियम taurocholate और एंटीबायोटिक (टी 0) के उचित एकाग्रता के साथ पूरक है।
- प्रत्येक समय बिंदु (टी 0, टी 6, टी 24, टी 48) पर विंदुक के साथ एक 1 एमएल नमूना लीजिए और रक्त / एक छोटे से विभाज्य (100 μL सीरियल बेलुअंस में) को रक्त की किरणों पर फैल गया। कोशिकाओं को रक्त एगर प्लेट पर बढ़कर 37 डिग्री सेल्सियस पर एनारोबिक चैंबर में 48 घंटे के लिए बढ़ो और सीएफयू निर्धारित करने के लिए कॉलोनियों की परिणामी संख्या की गणना करें।
3. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने तैयार करना
- 10 मिनट के लिए 10,000 xg पर माइक्रो-केंद्रीकृत ट्यूबों और अपकेंद्रित्र में प्रत्येक समय बिंदु से 1 एमएल कोशिकाओं को लीजिए पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और कोशिकाओं को धोएं।
- 10 मिनट के लिए 10,000 xg के नमूनों को अपकेंद्रित करें और सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें। 4% पैराफॉर्मालाइहाइड की 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: पतला करें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
- 1 मिनट में 10 मिनट के लिए फिर से अपकेंद्रित्र नमूने0,000 XG और सतह पर तैरनेवाला त्यागें डिस्टिल्ड वॉटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें और आसुत जल के 100 μL में रेडिल्यूट करें। समाधान की असभ्यता के आधार पर मात्रा समायोजित करें
नोट: कई धारावाहिक dilutions बनाना एक अच्छा विचार है। - कवरेज लेबल करें और उस पर नमूना के 40 μL जोड़ें। तरल लुप्त हो जाना और कोशिकाओं को कवरलिप का पालन करने की अनुमति देने के लिए एक प्रवाह हुड में 15 मिनट सेते हैं। यदि तरल अभी भी मौजूद है, तरल को हटाने के लिए एक धौंकनी का उपयोग करें।
- एक डेस्क स्पूटरिंग मशीन और टेप नीचे की कोशिकाओं के साथ कवरलाप रखें। स्पटरिंग मशीन में शुद्ध शुद्ध सोने। कम दबाव (50 मीटर टन) पर मशीन चालू करें और स्पुतरिंग शुरू करें। कोटे कोशिकाएं 30 एस पर 80 एमए हैं, जो सोने के कोटिंग के 20 एनएम का अनुवाद करती हैं।
- स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में लेपित कोशिकाओं को स्थानांतरित करें
4. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग सी। स्पिज़िल सेल
- जनसंपर्क द्वारा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) ठीक से वेंट करेंकंप्यूटर सॉफ़्टवेयर पर वेंट बटन टाइप करना
- कार्बन टेप का उपयोग करते हुए, धातु के चरण पर लेपित कवर लिप्स को सुरक्षित रखें। एक बार जब SEM निकाल दिया गया है, तो दरवाज़ा आसानी से खुलेगा। धातु के स्तर को एसईएम चैंबर में लॉक कर इसे स्क्यूइंग करके दबाएं।
- कंप्यूटर सॉफ्टवेयर पर पंप बटन पर क्लिक करें जब सिस्टम "रिक ओके" पढ़ता है तो SEM उपयोग करने योग्य होगा
- डिटेक्टर टैब के तहत एसई डिटेक्टर पर क्लिक करें। वोल्टेज को प्रदर्शित करने वाले बटन पर क्लिक करके बीम चालू करें वोल्टेज बढ़ने से पहले कम वोल्टेज (5 केवी) पर इमेजिंग प्रारंभ करें (15 केवी तक)। बीम चालू होने के बाद एक छवि दिखाई देगी।
- ट्रैकिंग फ़ंक्शन का उपयोग करना, छवि को लेपित कवरलेट पर एक क्षेत्र ढूंढें। क्षेत्र में ज़ूम करें और रॉड-आकार की संरचनाएं ढूंढें; ये क्लॉस्ट्रिडियम डिफ़िज़ील हैं
- सिस्टम को जांचने के लिए ज़ूम इन करें और फ़ोकस करें यह कई कार्य दूरी पर किया जाना चाहिए: 15, 9 और 5 मिमी। 5 मिमी की काम दूरी पर छवि
- यू पर स्विच करेंलेट्रा उच्च संकल्प इमेजिंग मोड और ध्यान केंद्रित करने और दृष्टिवैषम्यता का अनुकूलन करना शुरू करते हैं।
- उच्च बढ़ाई पर ध्यान केंद्रित करना शुरू करें इस के लिए मोटे और ठीक फ़ोकस टॉगल का प्रयोग करें स्पष्ट छवि प्राप्त करने के लिए भी दृष्टिवैषम्य समायोजित करें
- उच्च बढ़ाई पर दृष्टिवैषम्य समायोजित करें। ऐसा करने के लिए, दृष्टिवैषम्य टॉगल को समायोजित करें (वे ठीक / मोटे फोकस टॉगल के समान दिखते हैं) और डिजिटल सॉफ़्टवेयर पर ज़ूम इन करके स्पष्टता के लिए छवि की जांच करें
- एक उच्च गुणवत्ता वाली छवि को एकत्र करने के लिए धीमा स्कैन फ़ंक्शन से। एकत्रित छवि को एक टीआईएफएफ फ़ाइल के रूप में सहेजें, जिसका उपयोग विश्लेषण के लिए किया जाएगा। सुनिश्चित करें कि डेटा बार चुना जाता है यदि माप विश्लेषण के दौरान किया जाएगा।
- अलग-अलग कोणों पर छवियां एकत्रित करें (एसईएम पर मैन्युअल रूप से कोण को मैन्युअल रूप से घुमाने से एंजल छवियां अधिक गहराई से जानकारी प्रकट करती हैं।
- बीम वोल्टेज को उन कोशिकाओं के आधार पर बदलें, जिन्हें इमेजेट किया जा रहा है। इसे सभी प्रयोगों के लिए 5 से 15 केवी के बीच रखें। इमेजिंग पूरा होने के बाद, बीम बंद करें और कार्य दूरी को 20 मिमी तक बढ़ाएं। कक्ष तब निकाल दिया जा सकता है और मंच को हटाया जा सकता है। आगे के विश्लेषण के लिए ड्राइव पर सभी छवियों की प्रतिलिपि बनाएँ।
5. छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण
- कम्प्यूटर पर आसानी से उपलब्ध सॉफ्टवेयर, एफआईजीआई (http://fiji.sc) डाउनलोड और स्थापित करें।
- FIJI में छवि फ़ाइल खोलें
- लाइन फ़ंक्शन का उपयोग करना, स्केल बार को ठीक से ट्रेस करें।
- FIJI प्रोग्राम में विश्लेषण टैब पर क्लिक करें और अंत में चयन स्केल फ़ंक्शन का चयन करें। एक खिड़की दिखाई देगी, जिसे पैमाने पर बार के आधार पर ज्ञात दूरी की सेटिंग की आवश्यकता होगी। लंबाई की इकाई को भी बदलें और ठीक पर क्लिक करें।
- अब जब कार्यक्रम दूरी के लिए कैलिब्रेट किया गया है, तो सेल की लंबाई मापने के लिए लाइन फ़ंक्शन का उपयोग करें। लंबाई प्राप्त करने के लिए, सेल की संपूर्णता में पता लगाने के लिए लाइन फ़ंक्शन का उपयोग करें। विश्लेषण करें टैब फिर से चुनें और फिर माप पर क्लिक करें। लंबाई एप्लिकेशन चाहिएइकाइयों में कान पहले से चिह्नित है।
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Representative Results
क्लोस्ट्रिडियम डिसिफेइलिल एक बीजाणु बनाने वाला जीवाणु है और इस प्रकार यह किसी भी कार्यात्मक विश्लेषण से पहले वनस्पति और बीजाणु कोशिकाओं के बीच आकारिकी के अंतर को निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। चित्रा 1 वृहद कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियों को दर्शाता है जो विकास वक्र और बीजाणु कोशिकाओं के घातीय चरण के दौरान कब्जा किए गए थे। जैसा दर्शाया गया है, वनस्पति कोशिकाएँ लंबे, चिकनी, छड़ी के आकार के ढांचे हैं, जबकि बीजाणु छोटे, अंडाकार संरचनाएं हैं जो किसी न किसी बाह्य रूप में हैं। कार्यात्मक रूप से, वनस्पति कोशिकाओं को तेजी से विभाजित और विभाजित किया जाता है और सीज़ के स्राव के द्वारा सी। रोगी संक्रमण के खतरे के लिए जिम्मेदार होता है, जबकि बीजाणु सामान्य रूप से छोटी गतिविधि से निष्क्रिय होते हैं इसलिए, एंटीबायोटिक्स वनस्पति कोशिकाओं के विरुद्ध अधिकतर सक्रिय होते हैं, जबकि बीजाणु आमतौर पर नशीली दवाओं के उपचार के लिए प्रतिरोधी होते हैं, क्योंकि कई परत डीएनए के साथ कोर की रक्षा करते हैं, और शारीरिक गतिविधि की कमी है। इन तथ्यों के कारण, बहुमतMorphologic विश्लेषण के वनस्पति कोशिकाओं पर केंद्रित है 11 , 12
बढ़ते जीवाणुओं के खिलाफ एंटीबायोटिक प्रभावकारिता प्रदर्शित करने के लिए एक एंटीबायोटिक मारने की अवस्था मानक पद्धति है। सी। स्पिज़िल स्ट्रेन आर 20291 के साथ प्रयोग किया जाने वाला सांद्रता एमआईसी मूल्यों पर आधारित, वैनोकामिसिन के लिए 1 ग्राम / एमएल और मेट्रोनिडाजोल के लिए 0.51 माइक्रोग्राम / एमएल। 10 चित्रा 2 में दिखाया गया है, नियंत्रण कोशिकाओं का विकास होता है और एक पठार तक पहुंच जाता है, जबकि इलाज कोशिकाओं की कुल कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) में पहचान की सीमा (एलओडी) को कम होता है जो जीवाणुनाशक प्रभाव का प्रदर्शन करते हैं। जैसा कि दिखाया गया है, वैनोकामिसिन ( चित्रा 2 ए ) और मेट्रोनिडाजोल ( चित्रा 2 बी ) सी। डीफिज़ील को सुपरमिक सांद्रता (4xMIC) में मारने के लिए प्रभावी हैं। एक यह देख सकता है कि एंटीबायोटिक मारने की घटती समानताएं दिखती हैं, फिर भी दवाओं के एसी के अलग-अलग तंत्र हैंटीन (वैनोमॉइसिन सेल दीवार संश्लेषण को रोकता है, जबकि मेट्रोनिडाजोल डीएनए प्रतिकृति को प्रभावित करता है)। इसलिए, हम प्रस्ताव करते हैं कि एंटीबायोटिक की मारने वाले घटता में इन एंटीबायोटिक दवाओं के बीच विस्तृत मतभेद प्रदान करने के लिए पर्याप्त भेदभावपूर्ण शक्ति नहीं होनी चाहिए। हम अधिक भेदभाव प्रदान करने के लिए माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल करते हैं।
इसकी सूक्ष्म आकार के कारण, सी। Difficile उच्च बढ़ाई बिना छवि के लिए संभव नहीं है। इसने कोशिकाओं पर सीधे एंटीबायोटिक उपचार के विस्तृत प्रभावों का आकलन करने के लिए, एक इमेजिंग पद्धति स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) के उपयोग के लिए एक अवसर प्रदान किया है जो नैनोमीटर पैमाने पर संकल्प प्राप्त कर सकता है। इस दृष्टिकोण की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, कोशिकाओं को औषधि उपचार से पहले और बाद में चित्रित किया गया था ताकि यह पता लगाया जा सके कि आकारिकी कैसे बदल गया ( चित्रा 3 ए )। जैसा कि दिखाया गया है, कुछ कोशिकाओं की दीवारों को प्रभावित किया गया था, जैसे वैनोकामिसिन के मामले में, और कुछ कोशिका आकार में छोटे थे,जैसा कि मेट्रोनिडाजोल के लिए मामला था। यह पता लगाने के लिए कि सेल आकार प्रभावित था या नहीं, हमने कार्यक्रम FIJI का उपयोग करके सेल की लंबाई का विश्लेषण किया था। वनस्पति कोशिका का आकार नियंत्रण के मामले में कुछ भिन्न हो सकता है, लेकिन अधिकतर लगभग 6 माइक्रोन लंबाई ( चित्रा 3 बी ) हैं। नियंत्रण और इलाज की सेटिंग्स से कई कोशिकाओं पर विचार करते समय, एक जल्दी से नोट कर सकता है कि मेट्रोनिडाज़ोल में कोशिका की लंबाई प्राथमिकता से प्रभावित होती है, लेकिन वैन कॉमिसिन उपचार ( चित्रा -3 सी ) से प्रभावित नहीं है।
चित्रा 1: स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल प्रकार के बीच अंतर। क्लॉस्ट्रिडियम डिसिफिज़ील वनस्पति और बीजाणु कोशिकाओं की प्रतिनिधि चित्रित हैं । वनस्पति कोशिकाएं छड़ी संरचनाएं हैं जो लंबी और ध्वस्त हैं इसके विपरीत, बीजाणु कोशिकाएं छोटे हैं और एक मोटा और ऊबड़ कोट है। स्पोर्स छद्म रंग का लाल रंग के लिए शुद्ध हैएसईएस केवल छवियों पर स्केल बार दिखाए गए हैं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: एंटीबायोटिक समय-कर्क वक्रता सुपरमिक हत्या की घटती चार अलग-अलग एंटीबायोटिक दवाओं के लिए किया गया: vancomycin (ए) , मेट्रोनिडाजोल (बी) । इन एंटीबायोटिक दवाओं में सी। प्रतिरोधक तनाव R20291 के खिलाफ महत्वपूर्ण हत्या कार्रवाई की गई थी और कॉलोनी गठन इकाइयों (सीएफयू) की गणना के लिए पता लगाने की सीमा (एलओडी) से संपर्क किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: एंटीबायोटिक उपचार के औषधीय प्रभावों की जांच। हत्या की गतिज अध्ययन (ए) के दौरान इलाज किए गए और गैर-इलाज वाली कोशिकाओं की छवियों को कई समय बिंदुओं पर लिया गया। दिखाया गया एक नियंत्रण वनस्पति कोशिका का एक प्रतिनिधि उदाहरण है जो लंबाई (बी) के लिए मापा गया था। इलाज किए गए और गैर-इलाज वाली कोशिकाओं को मापा गया और तुलना की गई (सी) । प्रयोगों को कम से कम डुप्लिकेट में प्रदर्शन किया गया और> 17 कोशिकाओं को प्रति समूह मापा गया। * नियंत्रण और वैन कॉमिसिन उपचार समूहों की तुलना में पी <0.05। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
वर्तमान अध्ययन का लक्ष्य सी। विघटनकारी को अलग करने और एंटीबायोटिक की औषधीय क्रियाओं के अधिक संपूर्ण लक्षण वर्णन के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग कर एंटीबायोटिक संवेदनशीलता का परीक्षण करने के लिए एक उच्च-थ्रिपुट पद्धति का निर्माण करना था। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया है कि एंटीबायोटिक उपचार के सेल की फेनोटाइपिक प्रतिक्रिया इमेजिंग दवा के औषधीय कार्रवाई में अंतर्दृष्टि प्रकट कर सकती है। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल का इमेजिंग भाग कोशिकाओं को इकट्ठा करने के बाद अवधि में लगभग 2 घंटे लेता है, लेकिन अकेले ही मारने वाले सामान्य अध्ययनों से ज्यादा भेदभावपूर्ण हो सकता है। जबकि एक एसईएम का इस्तेमाल करना सीखना तकनीकी रूप से मांग कर सकता है, नमूनों की तैयारी अपेक्षाकृत सरल और तेज है हम मानते हैं कि यहां दिए गए ये प्रोटोकॉल एंटीबायोटिक उपचार की औषधीय कार्रवाई के मूल्यांकन के लिए एक उद्देश्य दृष्टिकोण प्रदान करेंगे।
टी के बीच समानता को ध्यान में रखते हुएवह एंटीबायोटिक मारने वाले घटता ( चित्रा 2 ), हमने यह निर्धारित करने की मांग की कि क्या औषधीय उपचार के सेल की प्रतिक्रिया में अंतर है या नहीं। एसईएम का उपयोग करना, हमने निर्धारित किया है कि मेट्रोनिडाजोल दवा की सूपैमिक सांद्रता पर सेल की लंबाई पर प्रभाव था। हालांकि इन फेनोटाइप को पहले से सूचित नहीं किया गया है, वे क्रियाओं के एंटीबायोटिक तंत्र के अनुरूप हैं और सेल चयापचय और विकास पर प्रभाव का सुझाव देते हैं। इसके विपरीत, वैनकॉमिसिन का सेल की दीवार पर महत्वपूर्ण प्रभाव था, जो क्रिया के अपने तंत्र के अनुरूप भी है। 13 जबकि इन एंटीबायोटिक दवाओं के बीच कैनेटीक्स की हत्या में समानताएं हैं, यह एसईएम चित्रों से स्पष्ट है कि महत्वपूर्ण फेनोटाइपिक अंतर हैं एक एंटीबायोटिक फ़नोटाइप लाइब्रेरी बनाने से दवाओं के अधिक संपूर्ण लक्षण वर्णन की अनुमति होगी, जिनकी पहचान की गई कार्रवाई का स्पष्ट तंत्र नहीं हो सकता है, जैसे कि रिमिनेलज़ोल का मामला है।
becausई यह पद्धति तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, सोना कोटिंग के sputtering में लगातार सेल तैयारी और परिवर्तन सहित वैज्ञानिक प्रश्न को हल करने के लिए संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है। बहुत ज्यादा कोटिंग कोशिकाओं के बाहरी हिस्सों में किसी भी प्रभाव को धुंधला कर सकती है, लेकिन पर्याप्त कोटिंग के परिणामस्वरूप किरणों को चार्ज करने और छवियों को बिगाड़ सकता है। इससे बचने के लिए, स्पूटरिंग समय को अनुकूलित करने के लिए विभिन्न प्रकार के सोने के कोटिंग के साथ नमूने तैयार करें। अंत में, अध्ययन के बीच लगातार पद्धतियां अंतर-प्रायोगिक तुलना करने की अनुमति देगा।
एसईएम का उपयोग करने की एक सीमा यह है कि यह सेल आकारिकी परिवर्तनों को देखने के लिए प्रतिबंधित है; इसलिए किसी भी संदिग्ध प्रतिक्रिया की पुष्टि करने के लिए कार्यात्मक अध्ययन आवश्यक हैं। इस वजह से, हम मानते हैं कि इस इमेजिंग प्रोटोकॉल को कार्यात्मक अध्ययन निर्देशन के साधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस सीमा के बावजूद, प्रोटीन की तस्करी या एकत्रीकरण में किसी भी संशयित परिवर्तन की पुष्टि के लिए, एसईएम का उपयोग करके immunogold लेबलिंग किया जा सकता है;हालांकि, हमने अभी तक इन प्रयोगों का आयोजन नहीं किया है
सी। के लिए नए एंटीबायोटिक दवाओं की सक्रिय पाइपलाइन की वजह से रोग निवारण, दवा की कार्रवाई का अधिक गहन मूल्यांकन आवश्यक है। जैसा कि यहां प्रस्तुत किया गया है, एसईएम औषधीय कार्रवाई की विशेषता के लिए एक अनूठा, उच्च-थ्रुपुट और विश्वसनीय अवसर प्रदान करता है। सी। की अलग-अलग प्रजातियों में कई अलग-अलग एंटीबायोटिक प्रभावों को इमेजिंग करके, हम यह समझ पाएंगे कि 027 / एनएपी 1 / बीआई महामारी तनाव जैसे विशिष्ट रोगजन्य तनावों के कारण कुछ एंटीबायोटिक दवाइयां दूसरों की तुलना में अधिक प्रभावी हैं। 14 इसके अलावा, एसआईएम विश्लेषण रिबाटोइप या उपभेदों के बीच एंटीबायोटिक प्रभावों को भेद करने के लिए सहायक हो सकता है और इसका उपयोग अन्य व्यापक जीवाणु प्रजातियों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो इसकी व्यापक प्रयोज्यता का प्रदर्शन करता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
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