Name: Protocolo para Caracterizar as Alterações Morfológicas Clostridium difficile Em resposta ao tratamento antibiótico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Aprenda a caracterizar alterações morfológicas em Clostridium difficile após tratamento antibiótico usando microscopia eletrônica de varredura. Este método combina imagens de alta resolução com cultura in vitro para avaliar efeitos farmacológicos.

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Esses experimentos foram apoiados por bolsas de pesquisa da Merck and Co. e da Summit, PLC.

1. Isolamento de C. difficile a partir de diferentes fontes ambientais ou clínicas <ol><li> Isolados ambientais: Utilizando um indicador de algodão pré-esterilizado (ligeiramente molhado com NaCl a 0,85%), limpe a superfície de qualquer área de interesse (chão, porta, pega, prateleira, etc. ). 8 Certifique-se de usar luvas estéreis e coloque o cotonete em um tubo esterilizado após concluído. </li><li> Isolados clínicos (fezes): Placa de 10 a 100 mg de amostras clínicas de fezes em cefoxitina-cicloserina-frutose ágar (CCFA), utilizando um ciclo de inoculação e incubar sob condições anaeróbicas rigorosas durante 48-72 h. Armazenar colônias isoladas de C. difficile estoque em cryovials a -80 ° C para análises adicionais. 7 , 9 , 10 </li><li> Enriqueça as amostras de esfregaços ambientais em infusão de coração cerebral (BHI) com 0,05% de taurocolato de sódio e coloque em câmara anaeróbica a 37 ° CDurante 5 dias. Centrifugar 1 mL da cultura a 10.000 xg e ressuspender o sedimento em 100 mL de etanol. </li><li> Plantar as células ressuspensas (50 μL) em placas de cicloserinecefoxitina frutose agar (CCFA) e incubar numa câmara anaeróbica a 37 ° C durante 40-48 h. Armazenar colônias isoladas de C. difficile estoque em cryovials a -80 ° C para análises adicionais. </li><li> Teste as colônias suspeitas de C. difficile usando o reagente de aglutinação de látex ou PCR. </li></ol> 2. Culturing C. difficile e Killing Kinetic Procedures <ol><li> Cultivar estirpes ambientais ou clínicas de C. difficile em placas de agar de sangue numa câmara anaeróbica a 37 ° C durante 48 h. </li><li> Tomar uma colónia isolada com um ciclo de inoculação, transferi-la para 5 mL de meio BHI num tubo de 15 mL e crescer durante 24 h numa câmara anaeróbica a 37 ° C. </li><li> Diluir as pré-culturas 1: 100 a aproximadamente 10 6 unidades formadoras de colónias(CFU) / mL em BHIS pré-reduzido fresco (BHI mais 5 g / L de extracto de levedura e 1% de L-cisteína) suplementado com taurocolato de sódio a 0,1% e a concentração apropriada de antibiótico (T0). </li><li> Recolher uma amostra de 1 mL com uma pipeta em cada ponto de tempo (T0, T6, T24, T48) e espalhar uma pequena alíquota (100 μL em diluições em série) numa placa de agar de sangue. Deixar as células crescerem sobre a placa de agar de sangue durante 48 h numa câmara anaeróbica a 37 ° C e contar o número resultante de colónias para determinar CFU. </li></ol> 3. Preparação de amostras para Microscopia Eletrônica de Varredura <ol><li> Recolher 1 mL de células de cada ponto de tempo em tubos de microcentrífuga e centrifugar a 10.000 xg durante 10 min. Descartar o sobrenadante e lavar as células em PBS. </li><li> Centrifugar as amostras a 10 000 xg durante 10 min novamente e descartar o sobrenadante. Re-diluir as células em 1 mL de paraformaldeído a 4% e incubar durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar novamente as amostras durante 10 min a 10,000 xg e descartar sobrenadante. Lavar as células duas vezes com água destilada e redilutar em 100 μL de água destilada. Ajuste o volume dependendo da turbidez da solução. NOTA: Fazer várias diluições em série é uma boa idéia. </li><li> Rotule os lamínulas e adicione 40 μL da amostra nele. Incubar durante 15 min em uma capa de fluxo para evaporar o líquido e permitir que as células aderem à lamela. Se ainda houver líquido, use um ventilador para remover o líquido. </li><li> Coloque lamínulas rotuladas com células em uma máquina de pulverização de mesa e fita para baixo. Secure ouro puro na máquina de pulverização. Ligue a máquina e comece a pulverização a baixa pressão (50 mTorr). Revestir as células durante 30 s a 80 mA, o que se traduz em 20 nm de revestimento de ouro. </li><li> Transferência de células revestidas para o microscópio eletrônico de varredura. </li></ol> 4. Imagens de células C. difficile em um microscópio eletrônico de varredura <ol><li> Ventilar o microscópio eletrônico de varredura (SEM) corretamente por prEssing o botão de ventilação no software do computador. </li><li> Usando fita de carbono, fixe os lamínulas revestidas para o estágio de metal. Uma vez que o SEM é ventilado, a porta deve abrir facilmente. Bloqueie o estágio de metal na câmara de SEM, aparafusando-o. </li><li> Clique no botão PUMP no software do computador. O SEM será utilizável quando o sistema lê &quot;Vac OK&quot;. </li><li> Clique no detector SE na guia de detectores. Ligue o feixe clicando no botão que exibe a tensão. Iniciar imagens com uma tensão mais baixa (5 kV) antes de aumentar a tensão (até 15 kV). Uma imagem será exibida após o feixe estar ligado. </li><li> Usando a função de rastreamento, encontre uma área nos lamínulas revestidos para a imagem. Zoom para a região e encontrar em forma de haste estruturas; Estes são clostridium difficile . </li><li> Amplie e focalize a imagem para calibrar o sistema. Isto deve ser feito em várias distâncias de trabalho: 15, 9 e 5 mm. Imagem a uma distância de trabalho de 5 mm. </li><li> Ligue o uLtra modo de imagem de alta resolução e começar a focar e otimizar o astigmatismo. </li><li> Comece a focar em alta ampliação. Utilize os botões de foco fino e grosseiro para isso. Ajustar o astigmatismo também para obter uma imagem mais clara. <ol><li> Ajuste o astigmatismo com alta ampliação. Para fazer isso, ajuste as alternâncias de astigmatismo (elas se parecem com as alternâncias de foco fino / grosseiro) e verifique a imagem para obter clareza digitando zoom no software do computador. </li></ol></li><li> A função de leitura lenta para coletar uma imagem de alta qualidade. Salve a imagem coletada como um arquivo .TIFF, que será usado para análise. Certifique-se de que a barra de dados esteja selecionada se as medições forem feitas durante a análise. </li><li> Colecione imagens em diferentes ângulos (até 52 °, girando manualmente o ângulo diretamente no SEM.) As imagens angulares tendem a revelar mais informações de profundidade. </li><li> Altere a tensão do feixe dependendo das células que estão sendo visualizadas. Manter este principalmente entre 5 - 15 kV para todas as experiências. </li&gt; <li> Após completar a imagem, desligue o feixe e aumente a distância de trabalho para 20 mm. A câmara pode então ser ventilada e a fase pode ser removida. Copie todas as imagens em uma unidade para uma análise mais aprofundada. </li></ol> 5. Processamento e Análise de Imagens <ol><li> Faça o download e instale o software disponível gratuitamente, FIJI (http://fiji.sc), no computador. </li><li> Abra o arquivo de imagem em FIJI. </li><li> Usando a função de linha, traçar com precisão a barra de escala. </li><li> Clique na guia Analisar no programa FIJI e finalmente selecione a função Selecionar Escala. Aparecerá uma janela que exigirá a definição da distância conhecida com base na barra de escala. Altere também a unidade de comprimento e clique em OK. </li><li> Agora que o programa é calibrado para a distância, use a função de linha para medir o comprimento da célula. Para obter o comprimento, use a função de linha para rastrear a célula na sua totalidade. Selecione a guia Analisar novamente e clique em Medir. O comprimento deve serNas unidades indicadas anteriormente. </li></ol>

<ol><li>Lessa, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+infection+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile infection in the United States.</a> N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).</li>
<li>Vickers, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ridinilazole%3A+a+novel+therapy+for+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection.</a> Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+update+on+emerging+antibiotic+treatment+options+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).</li>
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<li>Bassères, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+imaging+the+pharmacological+effects+of+antibiotic+treatment+on+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 40, 10-14 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Effects+of+Surotomycin+Treatment+on+Clostridium+difficile+Toxin+A+and+B+Production%2C+Immune+Response%2C+and+Morphological+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).</li>
<li>Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+potentially+pathogenic+Clostridium+difficile+contamination+in+household+environs%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs.</a> Anaerobe. 27, 31-33 (2014).</li>
<li>Aitken, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+Endemic+Setting%2C+Clostridium+difficile+Ribotype+027+Is+Virulent+But+Not+Hypervirulent%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).</li>
<li>Basseres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapse+of+antibiotic+associated+colitis%3A+endogenous+persistence+of+Clostridium+difficile+during+vancomycin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy.</a> Gut. 24 (3), 206-212 (1983).</li>
<li>Chilton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+oritavancin+on+Clostridium+difficile+spore+germination%2C+outgrowth+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery.</a> J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).</li>
<li>Ofosu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+a+review+of+current+and+emerging+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies.</a> Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).</li>
<li>McDonald, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidemic%2C+toxin+gene-variant+strain+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng+J+Med%22%5BJournal%5D)">An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile.</a> New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).</li>
</ol>

A KWG recebeu apoio de pesquisa anterior e atual da Merck & Co. e da Summit, PLC.

O objetivo do presente estudo foi criar um método de alto rendimento para isolar C. difficile e testar a susceptibilidade aos antibióticos usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) como meio para uma caracterização mais completa da ação farmacológica do antibiótico. Usando os protocolos aqui delineados, demonstrámos que imaginar a resposta fenotípica da célula ao tratamento com antibióticos pode revelar uma visão da acção farmacológica do fármaco. No total, a porção de imagem deste protocolo leva aproxim...

Clostridium difficile é uma bactéria gram-positiva, formadora de esporos, causando cerca de 500.000 infecções anualmente nos EUA e é considerada um patógeno urgente de ameaça pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), o maior nível de risco. A década passada tem visto um desenvolvimento considerável de fármacos em antimicrobianos com atividade contra C. difficile . 2 , 3 Os estudos in vitro são um componente necessário do processo de desenvolvimento do fármaco. 4 Tradicionalmente, estudos de susceptibilidade in vitro e morte são usados ​​para validar futuros estudos animais e outros in vivo . Embora estes métodos desempenhem um papel importante na avaliação da acção de morte, não capturam a resposta fenotípica das células ao tratamento farmacológico. Ao incorporar microscopia eletrônica de varredura (MEV) comD matando estudos cinéticos, uma caracterização mais completa dos efeitos diretos do antibiótico é possível. 5 , 6 , 7 Aqui, apresentamos um método em que o SEM é utilizado como um meio para perfilar a eficácia do tratamento antibiótico.

<table><tbody><tr><td>gaze de algodão&nbsp;</td><td>Caring</td><td>PRM21408C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron</td><td>7532</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 mL Falcon</td><td></td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Infusão de Cérebro e Coração (BHI)&nbsp;</td><td>Critério</td><td>C5141</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10389</td><td></td></tr><tr><td>extrato de levedura</td><td>Critério</td><td>C741</td><td></td></tr><tr><td>taurocolato de sódio</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18346</td><td></td></tr><tr><td>câmara anaeróbica</td><td>Coy</td><td></td><td>vinil câmara anaeróbica</td></tr><tr><td>cicloserinecefoxitina placas de ágar frutose (CCFA)</td><td>Sistemas anaeróbios</td><td>AS-213</td><td></td></tr><tr><td>placas de ágar sangue</td><td>Diagnósticos Hardy</td> Reagente de aglutinação de látex <td>A-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Oxoid</td><td>DR1107A</td><td>C. diff kit de teste</td></tr> tubos <tr><td>de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>222363204</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>4% de paraformaldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-259-98</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de microscópio</td><td>J. Melvin liberado marca</td><td>7525M</td><td>75 x 25mm</td></tr><tr><td>capuz de fluxo</td><td>Labconco</td><td>Classe II tipo A2&nbsp;</td><td>armário de biossegurança</td></tr><tr><td>máquina de pulverização catódica</td><td>de mesa Denton Vacuum</td><td>Desk II</td><td></td></tr><tr><td>fita</td><td>Plastic Core</td><td>05072-AB</td><td>SPI Fita de carbono adesiva de dupla face</td></tr><tr><td>ouro</td><td>Denton Vacuum</td><td>TAR001-0158</td><td>2.375 " Diâmetro x 0,002" Microscópio</td></tr><tr><td>eletrônico de varredura</td> de folha de ouro grosso <td>FEI</td><td>XL-30</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para caracterizar as alterações morfológicas<em&gt; clostridium difficile</em&gt; em resposta ao tratamento antibiótico

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A avaliação da ação antibiótica com o desenvolvimento de novos fármacos voltados para as bactérias anaeróbias é difícil e tecnicamente exigente. Para se ter uma ideia do possível MOA, as alterações morfológicas associadas à exposição aos antibióticos podem ser visualizadas utilizando microscopia electrónica de varrimento (SEM). Integrar a imagem de SEM com as curvas tradicionais de morte pode melhorar nossa visão sobre a ação da droga e avançar no processo de desenvolvimento da droga. Para testar esta premissa, as curvas de morte e os estudos de SEM foram conduzidos utilizando fármacos com MOA conhecidos mas diferentes (vancomicina e metronidazol). As células de C. difficile (R20291) foram cultivadas com ou sem a presença de antibiótico até 48 h. Ao longo do intervalo de 48 h, as células foram recolhidas em múltiplos pontos de tempo para determinar a eficácia de antibióticos e para imagens no SEM. De acordo com os relatórios anteriores, a vancomicina eo metronidazol apresentaram uma actividade bactericida significativa após 24 h de tratamento, tal como medido pela unidade de formação de colónias (UFC)Ting Usando a imagem SEM, determinou-se que o metronidazol teve efeitos significativos sobre o comprimento celular (&gt; 50% de redução no comprimento celular para cada antibiótico, P &lt;0,05) em comparação com os controles e vancomicina. Embora a resposta fenotípica ao tratamento com fármaco não tenha sido previamente documentada desta forma, são consistentes com o MOA do fármaco demonstrando a versatilidade e fiabilidade da imagem e medições e a aplicação desta técnica para outros compostos experimentais.

Clostridium difficile é uma bactéria formadora de esporos e, portanto, é essencial para determinar as diferenças morfológicas entre células vegetativas e esporos antes de qualquer análise funcional. A Figura 1 demonstra imagens representativas de células vegetativas que foram capturadas durante a fase exponencial da curva de crescimento e células de esporos. Conforme ilustrado, as células vegetativas são longas, lisas, em forma de haste estruturas enqua...

A eficácia dos antibióticos é mais comumente determinada pela realização de estudos cinéticos de morte e medição de unidades formadoras de colônias (UFCs). Ao integrar a microscopia eletrônica de varredura (MEV) com esses métodos padrão, podemos distinguir os efeitos farmacológicos do tratamento entre diferentes antibióticos.

Protocolo para Caracterizar as Alterações Morfológicas<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Em resposta ao tratamento antibiótico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

O objetivo geral deste método de imagem microbiológica é fornecer um meio mais descritivo para distinguir os efeitos fenotípicos do tratamento farmacológico. Assim, este método pode realmente ajudar na área de doenças infecciosas. Especificamente, analisando os efeitos morfológicos de certos antibióticos e como eles matam o C.Difficile.A principal vantagem desta técnica é que ela combina imagens de alta resolução com técnicas de cultura celular in vitro para fornecer uma visão detalhada da ação letal de fármacos. A implicação desta técnica pode estender-se ao tratamento da infecção por Clostridium difficile, ou CDI, em sua forma abreviada. O motivo é que esta técnica pode fornecer um meio para identificar como um antibiótico pode ser benéfico no tratamento da CDI.Embora este método possa fornecer informações sobre a ação farmacológica, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como modelos de culturas mistas ou estudos em animais in vivo. Geralmente, as pessoas têm dificuldade com este novo método porque o cultivo de C.difficile e a operação de um microscópio eletrônico de varredura são desafiadores. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método quando estávamos tentando distinguir entre os modos de ação de diferentes antibióticos.Gostaria de apresentar a você a equipe de pesquisa que você conhecerá hoje. Jahangir Alam é professor e microbiologista. Ele coordena todas as atividades laboratoriais que você verá hoje.Tasnuva Rashid é uma estudante de pós-graduação no laboratório. Ela realiza grande parte da microbiologia do dia a dia. Eugenie Bassere é uma pesquisadora pós-doutora.Ela realmente ensinou a Tasnuva muitas das habilidades e também auxilia no laboratório. Brad Endres é outro pós-doutorando no laboratório. Ele fará muita microscopia com a ajuda de Long Chang.Para preparar isolados ambientais usando luvas estéreis, utilize uma gaze de algodão pré-esterilizada para esfregar a superfície de qualquer área de interesse, como um piso, porta, maçaneta ou prateleira. Em seguida, coloque a haste com o material coletado em um tubo esterilizado. Troque as luvas entre as amostras.Para preparar isolados clínicos, use um alça de inoculação para semear de 10 a 100 miligramas de amostras clínicas de fezes em ágar cefoxitina cicloserina frutose, ou CCFA, e incubar as amostras sob condições estritamente anaeróbicas por 48 a 72 horas. Armazene colônias isoladas do estoque de C. Difficile em tubos criogênicos a menos 80 graus Celsius para análises posteriores. Enriqueça as amostras de swab ambiental em caldo infusão cerebral coração, ou BHI, com 0,5% de taurocolato de sódio e coloque as amostras em câmara anaeróbica a 37 graus Celsius por cinco dias.Centrifugue um mililitro da cultura a 10.000 × g e use 100 microlitros de etanol para ressuspender o precipitado. Plaque 50 microlitros das células ressuspensas em placas de CCFA e incube as culturas em câmara anaeróbica a 37 graus Celsius por 40 a 48 horas. Armazene as colônias isoladas de C. difficile em tubos criogênicos a menos 80 graus Celsius para análises posteriores.Utilize o reagente de aglutinação com látex ou PCR para testar as colônias suspeitas de C.difficile. Incube cepas purificadas de C.difficile de origem ambiental ou clínica em placas de ágar sangue em câmara anaeróbia a 37 graus Celsius por 48 horas. Use um alça de inoculação para coletar uma colônia isolada e transfira-a para cinco mililitros de meio BHI em um tubo de 15 mililitros.Em seguida, cultive a cultura em câmara anaeróbia a 37 graus Celsius por 24 horas. Utilize BHIS fresco, pré-reduzido, suplementado com taurocolato de sódio e a concentração apropriada de antibiótico para diluir as pré-culturas de 1 para 100 até aproximadamente 10 elevado à sexta UFC por mililitro. Com uma pipeta, colete uma amostra de um mililitro em cada ponto temporal e plaque ou espalhe uma pequena alíquota em uma placa de ágar sangue.Incube a placa por 48 horas em uma câmara anaeróbica a 37 graus Celsius e conte o número resultante de colônias para determinar as UFCs. Colete um mililitro de células de cada ponto temporal em tubos de microcentrífuga e centrifugue a 10.000 × g por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e use PBS para lavar as células.Centrifugue as amostras novamente e descarte o sobrenadante. Em seguida, use um mililitro de paraformaldeído a 4% para re-suspender as células e incube os tubos à temperatura ambiente por uma hora. Após centrifugar as amostras novamente e descartar o sobrenadante, lave as células duas vezes com água destilada antes de re-suspender as células em 100 microlitros de água destilada.Ajuste o volume conforme a turbidez da solução. Após rotular as lamínulas, adicione 40 microlitros da amostra sobre elas. Em uma câmara de fluxo laminar, incube as lamínulas por 15 minutos para evaporar o líquido e permitir que as células adiram ao vidro.Se ainda houver líquido presente, use um soprador para removê-lo. Coloque as lamínulas em uma máquina de pulverização catódica de bancada e fixe-as com fita. Prenda ouro puro na máquina de pulverização catódica.Em seguida, ligue a máquina e inicie a pulverização sob baixa pressão. Revesta as células por 30 segundos a 80 microamperes, o que corresponde a um revestimento de ouro de 20 nanômetros. Para iniciar a obtenção de imagens, primeiro ventile adequadamente o MEV no software do computador pressionando o botão Vent.Após revestir as células, transfira-as para o microscópio eletrônico de varredura, ou MEV. Usando a fita de carbono, fixe as lamínulas revestidas na platina metálica. Uma vez que o MEV seja ventilado, a porta deve abrir facilmente.Fixe a platina metálica na câmara do MEV apertando o parafuso. Em seguida, clique no botão Bomba no software. Quando o sistema indicar que está tudo certo, o MEV estará pronto para uso.Na guia Detector, clique no detector SE. Ligue o feixe clicando no botão que exibe a tensão. Inicie a obtenção de imagens em uma tensão mais baixa antes de aumentar a tensão.Uma imagem aparecerá após o feixe ser ativado. Utilizando a função de rastreamento, localize uma área nas lamínulas revestidas para obter a imagem. Aproxime a região e encontre estruturas em forma de bastão, que representam Clostridium difficile.Para calibrar o sistema, aumente o zoom, foque a imagem grosseiramente e vincule Z à distância de trabalho livre. Isso deve ser feito em várias distâncias de trabalho, como em 15, 9 e 5 milímetros. Em seguida, mude para o modo de imagem de resolução ultralevada.Use os controles de foco grosso e fino para começar a focar em alta magnificação. Ajuste os controles de astigmatismo para obter uma imagem mais nítida e verifique a clareza da imagem utilizando o software do computador para ampliar digitalmente a imagem. Utilize a varredura lenta para obter uma imagem de alta qualidade.Salve a imagem coletada como um arquivo tiff para análise posterior, garantindo que a barra de dados esteja selecionada caso sejam realizidas medições durante a análise. Colete imagens em diferentes ângulos para revelar mais informações de profundidade, inclinando a platina no MEV. Otimize o foco e o astigmatismo antes de coletar uma imagem de varredura lenta.Após a conclusão da imagem, desligue o feixe e aumente a distância de trabalho para 20 milímetros. Em seguida, ventile a câmara e remova o estágio. Processe as imagens, abrindo os arquivos de imagem no Fiji.Utilizando a função de linha, trace com precisão a barra de escala. Clique na aba Analisar; em seguida, escolha a função Selecionar Escala. Uma janela aparecerá solicitando a definição da distância conhecida com base na barra de escala.Altere também a unidade de comprimento e clique em OK. Por fim, para medir o comprimento da célula, use a função de linha para traçar a célula por completo. Selecione novamente a guia Analisar e, em seguida, clique em medir.O comprimento deve aparecer nas unidades indicadas anteriormente. Essas imagens mostram células vegetativas de C.difficile capturadas durante a fase exponencial da curva de crescimento, bem como células esporuladas. As células vegetativas são estruturas longas, lisas e com formato de bastão; por outro lado, os esporos são estruturas pequenas e ovais que possuem uma superfície externa rugosa.Como mostrado nesta figura, as células controle crescem e atingem uma platô; por outro lado, as células tratadas com os antibióticos vancomicina e metronidazol apresentam redução no número total de UFCs até o limite de detecção, indicando um efeito bactericida. Como demonstrado, vancomicina e metronidazol são eficazes na eliminação de C.difficile em concentrações superiores à MIC. Para demonstrar a utilidade do uso de MEV para o imageamento de C.difficile, as células foram imagiadas antes e após o tratamento com o fármaco para determinar como a morfologia mudou.No caso da vancomicina, algumas das paredes celulares foram afetadas e algumas células tratadas com metronidazol eram menores em tamanho. Para testar se o tamanho celular foi afetado, o comprimento celular foi analisado utilizando o programa Fiji. Como demonstrado nesta imagem, o tamanho da célula vegetativa pode variar um pouco no caso controle; mas a maioria tem aproximadamente 6 micrômetros de comprimento.No entanto, como mostrado neste gráfico, o comprimento celular foi afetado nas células tratadas com metronidazol, mas não nas células tratadas com vancomicina. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de dois dias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que sua amostra deve estar fixada e completamente seca antes da cobertura e da obtenção de imagens.Após este procedimento, podemos realizar métodos adicionais para responder outras perguntas, como a forma como as bactérias responderão aos tratamentos com antibióticos; isso pode nos fornecer uma compreensão mais profunda sobre os mecanismos de ação dos antibióticos, por exemplo. Esta técnica possui um potencial imenso e pode abrir caminho para que pesquisadores na área de microbiologia explorem mais a fisiologia e a farmacologia do Clostridium difficile. Espero que tenham gostado de assistir a este vídeo hoje.Espero que o que você tenha aprendido aqui seja como cultivar e caracterizar células de C. difficile, como analisar a cinética de morte de antibióticos contra C. difficile e, em seguida, como avaliar as alterações morfológicas associadas a esses padrões de morte utilizando microscopia de alto nível. Embora estejamos trabalhando com Clostridium difficile, devemos tomar precauções extras e usar todos os equipamentos de proteção

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Winston, J. A. et al. Modelo de camundongo tratado com cefoperazona da cepa clinicamente relevante de Clostridium difficile R20291. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a quantificação de Clostridium difficile em amostras fecais de um modelo de camundongo infectado usando técnicas de cultivo seletivo. Ele descreve os procedimentos para coleta de amostras, processamento anaeróbico, diluição serial e enumeração de colônias para avaliar a colonização bacteriana e as interações...

Quantificação de Clostridium difficile em Amostras Fecais de um Modelo de Camundongo Infectado

Este vídeo demonstra um ensaio para medir o acúmulo de uma sonda antibiótica fluorescente em células bacterianas. A exposição a um inibidor da bomba de efluxo interrompe o gradiente de prótons transmembrana nas células bacterianas, sobre o qual um antibiótico conjugado com fluoróforo é adicionado. A inibição das bombas de efluxo devido ao gradiente de prótons interrompido causa acúmulo do antibiótico dentro da bactéria. As células bacterianas são lisadas e a intensidade da fluorescência é...

Um ensaio para medir o acúmulo de uma sonda antibiótica fluorescente em células bacterianas

Clostridium difficile é uma bactéria patogênica que é um anaeróbio estrito e causa diarreia associada a antibióticos (DAA). Aqui, os métodos para o isolamento, a cultura e manter C. As células vegetativas difficile e esporos são descritos. Essas técnicas necessitam de uma câmara de anaerobiose, o que requer uma manutenção regular para garantir condições adequadas para melhor C. cultivo difficile.

Cultivar e Manter<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Em um ambiente anaeróbico

Este protocolo descreve o modelo do rato cefoperazona de infecção por Clostridium difficile (CDI), utilizando uma estirpe clinicamente relevante e geneticamente-tratável, R20291. Ênfase na monitorização clínica da doença, C. difficile enumeração bacteriana, a citotoxicidade de toxinas, e alterações histopatológicas em todo CDI em um modelo de rato estão detalhadas no protocolo.

tratados com Cefoperazone Rato Modelo de clinicamente relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain

Este artigo descreve um método de microarray de proteína simples para perfilação humorais respostas imunes a um painel de 7-plex de altamente purificado antígenos de Clostridium difficile em soros humanos. O protocolo pode ser estendido para a determinação de respostas de anticorpos específicos em preparações de imunoglobulina intravenosa policlonal.

Um ensaio de Microarray da proteína para determinação sorológica do antígeno-específicas anticorpo respostas seguintes Clostridium difficile infecção

Antibióticos fluorescentes são ferramentas poderosas que podem ser usadas para estudar múltiplos aspectos da resistência antimicrobiana. Este artigo descreve a preparação de antibióticos fluorescentes e sua aplicação para estudar a resistência a antibióticos em bactérias. As sondas podem ser usadas para estudar mecanismos de resistência bacteriana (por exemplo, efflux) por espectrofotometria, citometria de fluxo e microscopia.

Visualização da resistência bacteriana usando sondas de antibióticos fluorescentes

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer o modelo de camundongo com colite induzida por sódio com sulfato de dextrano livre de germes induzido por antibióticos para investigar o papel da microbiota intestinal na regulação dos efeitos positivos do Bacillus cereus na colite.

Investigando os efeitos aliviadores da administração de Bacillus cereus na colite por meio da modulação da microbiota intestinal

A persistência de antibióticos descreve a capacidade de pequenas subpopulações dentro de uma população isogênica sensível de tolerar transitoriamente altas doses de antibióticos bactericidas. O presente protocolo combina abordagens para caracterizar o fenótipo de persistência do antibiótico em nível molecular e celular após exposição de Escherichia coli a doses letais de ofloxacina.

Análise Populacional e Unicelular da Persistência de Antibióticos em Escherichia coli

Testes de susceptibilidade antimicrobiana Atualmente, o diagnóstico baseia-se no crescimento planctônico dos isolados em ricas em nutrientes, condições aeróbicas. Aqui, nós utilizamos um meio de escarro alternativa artificial para estudar susceptibilidade antimicrobiana de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa em ambas as condições de aerobiose e microaerofilia mais representativas do pulmão da fibrose cística.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

Este artigo centra-se na identificação de conjuntos de dados de interação de alta confiança entre hospedeiro e as proteínas do patógeno usando uma combinação de dois métodos ortogonais: levedura de dois híbridos seguido de um ensaio de interação de alto rendimento em células de mamíferos chamada HT-GPCA.

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Aprenda a caracterizar alterações morfológicas em Clostridium difficile após tratamento antibiótico usando microscopia eletrônica de varredura. Este método combina imagens de alta resolução com cultura in vitro para avaliar efeitos farmacológicos.

Protocolo para Caracterizar as Alterações Morfológicas

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