Protocolo para Caracterizar as Alterações Morfológicas Clostridium difficile Em resposta ao tratamento antibiótico

O objetivo geral deste método de imagem microbiológica é fornecer um meio mais descritivo para distinguir os efeitos fenotípicos do tratamento farmacológico. Portanto, esse método pode realmente ajudar na área de doenças infecciosas. Olhando especificamente para os efeitos morfológicos de certos antibióticos e como ele mata C.Difficile.

A principal vantagem dessa técnica é que ela combina imagens de alta resolução com técnicas de cultura de células in vitro para fornecer uma visão detalhada da ação de morte farmacêutica. A implicação dessa técnica pode se estender à terapia para infecção por Clostridium difficile, ou CDI em resumo. A razão é que essa técnica pode fornecer um meio para identificar como um antibiótico pode ser benéfico no tratamento da CDI.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a ação farmacológica, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como modelo de cultura mista ou estudos em animais in vivo. Geralmente, os indivíduos lutam com esse novo método porque cultivar C. difficile e operar um microscópio eletrônico de varredura é um desafio. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos tentando distinguir entre os diferentes modos de ação dos antibióticos.

Gostaria de apresentá-lo à equipe de pesquisa que você conhecerá hoje. Jahangir Alam é professor e microbiologista. Ele coordena todas as atividades de laboratório que você verá hoje.

Tasnuva Rashid é uma estudante de pós-graduação no laboratório. Ela faz muito da microbiologia do dia-a-dia. Eugenie Bassere é bolsista de pós-doutorado.

Ela realmente ensinou a Tasnuva muitas das habilidades e também auxilia no laboratório. Brad Endres é outro pós-doutorado no laboratório. Ele fará muita microscopia com a ajuda de Long Chang.

Para preparar isolados de ambiente usando luvas estéreis, use uma gaze de algodão pré-esterilizada para esfregar a superfície de qualquer área de interesse, como piso, porta, maçaneta ou prateleira. Em seguida, coloque o cotonete em um tubo esterilizado. Troque as luvas entre as amostras.

Para preparar isolados clínicos, use uma alça de inoculação para plaquear 10 a 100 miligramas de amostras clínicas de fezes em ágar cefoxitina cicloserina frutose, ou CCFA, e intubar as amostras sob condições anaeróbicas estritas por 48 a 72 horas. Armazene colônias isoladas do estoque de C. Difficile em frascos criogênicos a 80 graus Celsius negativos para análises posteriores. Enriqueça as amostras de swab ambiental em infusão cérebro-coração, ou caldo BHI, com taurocolato de sódio a 05% e coloque as amostras em uma câmara anaeróbica a 37 graus Celsius por cinco dias.

Centrifugue um mililitro da cultura a 10.000 vezes G e use 100 microlitros de etanol para ressuspender o pellet. Coloque 50 microlitros das células ressuspensas em placas CCFA e incube as culturas em uma câmara anaeróbica a 37 graus Celsius por 40 a 48 horas. Armazene as colônias isoladas de estoque de C. difficile em frascos criogênicos a 80 graus Celsius negativos para análises posteriores.

Use o reagente de aglutinação em látex, ou PCR, para testar as colônias suspeitas de C. difficile. Cultive cepas de C.difficile ambientais ou clínicas purificadas em placas de ágar sangue em uma câmara anaeróbica a 37 graus Celsius por 48 horas. Use um loop de inoculação para pegar uma colônia isolada e transferi-la para cinco mililitros de meio BHI em um tubo de 15 mililitros.

Em seguida, cultive a cultura em uma câmara anaeróbica a 37 graus Celsius por 24 horas. Usando BHIS fresco e pré-reduzido suplementado com taurocolato de sódio e a concentração apropriada de antibiótico para diluir as pré-culturas de 1 a 100 a aproximadamente 10 elevado à sexta UFC por mililitro. Com uma pipeta, recolher uma amostra de um mililitro em cada ponto de tempo e colocar em placas ou espalhar uma pequena alíquota sobre uma placa de ágar sangue.

Incubar a placa durante 48 horas numa câmara anaeróbia a 37 graus Celsius e contar o número de colónias resultante para determinar as UFC. Coletar um mililitro de células de cada ponto de tempo em tubos de microcentrífuga e centrifugar a 10.000 vezes G por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e use PBS para lavar as células.

Gire as amostras novamente e descarte o sobrenadante. Em seguida, use um mililitro de paraformaldeído a 4% para diluir novamente as células e incubar os tubos em temperatura ambiente por uma hora. Depois de girar as amostras novamente e descartar o sobrenadante, use água destilada para lavar as células duas vezes antes de diluir novamente as células em 100 microlitros de água destilada.

Ajuste o volume dependendo da turbidez da solução. Depois de rotular as lamínulas, adicione 40 microlitros da amostra sobre elas. Sob uma coifa de fluxo, incube as lamínulas por 15 minutos para evaporar o líquido e permitir que as células adiram ao vidro.

Se o líquido ainda estiver presente, use um soprador para removê-lo. Coloque as lamínulas em uma máquina de pulverização catódica de mesa e prenda-as com fita adesiva. Prenda ouro puro na máquina de pulverização catódica.

Em seguida, ligue a máquina e comece a engasgar em baixa pressão. Cubra as células por 30 segundos a 80 microamperes, o que se traduz em 20 nanômetros de revestimento de ouro. Para iniciar a imagem, primeiro ventile o SEM corretamente no software do computador pressionando o botão Ventilar.

Depois de revestir as células, transfira-as para o microscópio eletrônico de varredura ou SEM. Usando a fita de carbono, prenda as lamínulas revestidas no metal stage. Uma vez que o SEM é ventilado, a porta deve abrir facilmente.

Trave o metal stage na câmara SEM aparafusando-o. Em seguida, clique no botão Pump no software. Quando o sistema ler corretamente, o SEM estará pronto para uso.

Na guia Detector, clique no detector SE. Ligue o feixe clicando no botão que exibe a tensão. Comece a criar imagens em uma tensão mais baixa antes de aumentar a tensão.

Uma imagem aparecerá depois que o feixe for ligado. Usando a função de rastreamento, encontre uma área nas lamínulas revestidas para criar a imagem. Amplie a região e encontre estruturas em forma de bastonete, que representam Clostridium difficile.

Para calibrar o sistema, aumente o zoom, foque grosseiramente a imagem e vincule Z à distância de trabalho livre. Isso deve ser feito em várias distâncias de trabalho, como 15, 9 e 5 milímetros. Em seguida, mude para o modo de imagem de resolução ultra-alta.

Use as alternâncias de foco grosso e fino para começar a focar em alta ampliação. Ajuste as alternâncias de astigmatismo para obter uma imagem mais nítida e verifique a clareza da imagem usando o software do computador para ampliar digitalmente a imagem. Use a varredura lenta para coletar uma imagem de alta qualidade.

Salve a imagem coletada como um arquivo tiff para análise posterior, garantindo que a barra de dados seja selecionada se as medições forem feitas durante a análise. Colete imagens em diferentes ângulos para revelar informações mais detalhadas inclinando a platina no SEM. Otimize o foco e o astigmatismo antes de coletar uma imagem de varredura lenta.

Após a conclusão da imagem, desligue o feixe e aumente a distância de trabalho para 20 milímetros. Em seguida, ventile a câmara e remova o palco. Processe as imagens, abra os arquivos de imagem em Fiji.

Usando a função de linha, trace com precisão a barra de escala. Clique na guia Analisar; e escolha a função Selecionar escala. Aparecerá uma janela que exigirá a configuração da distância conhecida com base na barra de escala.

Altere também a unidade de comprimento e clique em OK. Finalmente, para medir o comprimento da célula, use a função de linha para rastrear a célula em sua totalidade. Selecione a guia Analisar novamente e clique em medir.

O comprimento deve aparecer nas unidades indicadas anteriormente. Essas imagens mostram células vegetativas de C. difficile que foram capturadas durante a fase exponencial da curva de crescimento, bem como células de esporos. As células vegetativas são estruturas longas, lisas e em forma de bastonete; Considerando que, os esporos são pequenas estruturas ovais que têm um exterior áspero.

Conforme mostrado nesta figura, as células de controle crescem e atingem um platô; enquanto as células tratadas com os antibióticos vancomicina e metronidazol diminuem em UFC total até o limite de detecção, indicando um efeito bactericida. Como demonstrado, a vancomicina e o metronidazol são eficazes em matar C. difficile em concentrações de super MIC. Para demonstrar a utilidade do uso de MEV para imagens de C. difficile, as células foram fotografadas antes e depois do tratamento medicamentoso para determinar como a morfologia mudou.

No caso da vancomicina, algumas das paredes das células foram afetadas e algumas células tratadas com metronidazol eram menores em tamanho. Para testar se o tamanho da célula foi afetado, o comprimento da célula foi analisado usando o programa Fiji. Conforme demonstrado nesta imagem, o tamanho da célula vegetativa pode variar um pouco no caso de controle; mas a maioria tem cerca de 6 micrômetros de comprimento.

No entanto, como mostrado neste gráfico, o comprimento celular foi afetado em células tratadas com metronidazol, mas não em células tratadas com vancomicina. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em menos de dois dias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que sua amostra está fixa e completamente seca antes de revestir e fazer a imagem.

Seguindo este procedimento, podemos realizar métodos adicionais para responder a perguntas adicionais, como como as bactérias responderão aos tratamentos com antibióticos; E isso pode nos dar mais informações sobre a compreensão da mecânica de ação dos antibióticos, por exemplo. Esta técnica tem imenso potencial e pode abrir caminho para pesquisadores no campo da microbiologia explorarem ainda mais a fisiologia e a farmacologia em Clostridium difficile. Espero que você tenha gostado de assistir a este vídeo hoje.

Espero que o que você tenha ganhado com isso seja como cultivar e caracterizar células de C.difficile, como observar a cinética de morte de antibióticos contra C.Difficile e, em seguida, como avaliar as mudanças morfológicas associadas a esses padrões de morte usando microscopia de alto nível. Enquanto estamos trabalhando com Clostridium difficile, devemos tomar precauções extras e usar todos os protetores