Abstract
Vurdering av antibiotisk virkning med ny medisinutvikling rettet mot anaerobe bakterier er vanskelig og teknisk krevende. For å få innblikk i mulig MOA, kan morfologiske endringer assosiert med antibiotisk eksponering visualiseres ved hjelp av skanningelektronmikroskopi (SEM). Integrering av SEM-bildebehandling med tradisjonelle drepekurver kan forbedre innsiktet i narkotikahandlingen og fremme utviklingsprosessen for stoffet. For å teste denne premissen ble drepekurver og SEM-studier utført ved bruk av legemidler med kjent, men forskjellig MOA (vancomycin og metronidazol). C. difficile celler (R20291) ble dyrket med eller uten tilstedeværelse av antibiotika i opptil 48 timer. Gjennom 48 h intervallet ble cellene samlet på flere tidspunkter for å bestemme antibiotisk effekt og for avbildning på SEM. I overensstemmelse med tidligere rapporter hadde vankomycin og metronidazol signifikant baktericid aktivitet etter 24 timers behandling målt ved kolonidannende enhet (CFU) landTing. Ved bruk av SEM-bildebehandling bestemte vi at metronidazol hadde signifikante effekter på cellelengden (> 50% reduksjon i cellelengde for hvert antibiotika, P <0,05) sammenlignet med kontroller og vankomycin. Selv om fenotypisk respons på medikamentbehandling ikke er dokumentert tidligere på denne måten, er de konsistente med stoffets MOA som demonstrerer allsidigheten og påliteligheten til avbildning og målinger og anvendelsen av denne teknikken for andre eksperimentelle forbindelser.
Introduction
Clostridium difficile er en gram positiv, sporeformende bakterie, som forårsaker ca. 500.000 infeksjoner årlig i USA, og betraktes som et helsepatient for trusselsnivå ved Sentrum for sykdomskontroll og forebygging (CDC), det høyeste risikonivået. 1 Det siste tiåret har hatt betydelig medisinutvikling i antimikrobielle stoffer med aktivitet mot C. difficile . 2 , 3 In vitro- studier er en nødvendig del av stoffutviklingsprosessen. 4 Tradisjonelt brukes in vitro- følsomhet og tidsdempende studier for å validere fremtidige dyr og andre in vivo- studier.
Selv om disse metodene tjener en viktig rolle for evaluering av drap, oppfanger de ikke cellernes fenotypiske respons på farmakologisk behandling. Ved å inkludere skanningelektronmikroskopi (SEM) med standarD killing kinetiske studier, er en mer grundig karakterisering av antibiotika direkte effekter mulig. 5 , 6 , 7 Her presenterer vi en metode hvor SEM brukes som et middel til å profilere effekten av antibiotisk behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering C. difficile fra ulike miljømessige eller kliniske kilder
- Miljøisolater: Bruk en presterilisert bomullsmåler (lett fuktet med 0,85% NaCl), tørk overflaten av et område av interesse (gulv, dør, håndtak, hylle, etc. ). 8 Pass på at du bærer sterile hansker og plasser vattpinnen i et sterilisert rør etter ferdigstillelse.
- Kliniske isolater (avføring): Plate 10 til 100 mg klinisk avføring på cefoxitin-cykloserin-fruktosagar (CCFA) ved bruk av en inokuleringssløyfe og inkuber under strenge anaerobe forhold i 48 - 72 timer. Oppbevar isolerte kolonier av C. difficile-stamme i cryovials ved -80 ° C for videre analyser. 7 , 9 , 10
- Beregn miljøvoksprøver i hjerneinfusjonsvæske (BHI) med 0,05% natriumtaurocholat og plasser i et anaerobt kammer ved 37 ° CI 5 dager. Sentrifuger 1 ml av kulturen ved 10 000 xg og resuspender pelleten i 100 ul etanol.
- Plater de resuspenderte cellene (50 μl) på sykloserincefoxitin fruktose agar (CCFA) plater og inkuber i et anaerobt kammer ved 37 ° C i 40-48 timer. Oppbevar isolerte kolonier av C. difficile-stamme i cryovials ved -80 ° C for videre analyser.
- Test mistenkte C. difficile kolonier ved bruk av latexagglutineringsreagenset eller PCR.
2. Culturing C. difficile og Killing Kinetic Procedures
- Voks renset miljø eller kliniske C. difficile stammer på blodagarplater i et anaerobt kammer ved 37 ° C i 48 timer.
- Ta en isolert koloni med en inokuleringssløyfe, overfør den til 5 ml BHI-medium i et 15 ml rør, og vokse i 24 timer i et anaerobt kammer ved 37 ° C.
- Fortynk prekulturene 1: 100 til ca. 10 6 kolonidannende enhetS (CFU) / ml i fersk, pre-redusert BHIS (BHI pluss 5 g / l gjærekstrakt og 1% L-cystein) tilsatt 0,1% natriumtaurokolat og passende konsentrasjon av antibiotika (T0).
- Samle en 1 ml prøve med en pipette på hvert tidspunkt (T0, T6, T24, T48) og plate / spre en liten alikvot (100 μl i serielle fortynninger) på en blodagarplate. La cellene vokse på blodagarplaten i 48 timer i et anaerobt kammer ved 37 ° C og telle det resulterende antall kolonier for å bestemme CFU.
3. Forberedelse av prøver for skanning av elektronmikroskopi
- Samle 1 ml celler fra hvert tidspunkt i mikrocentrifugerør og sentrifuger ved 10 000 xg i 10 minutter. Kast supernatanten og vaske celler i PBS.
- Sentrifuger prøvene ved 10.000 xg i 10 minutter igjen og kast supernatanten. Re-fortynnede celler i 1 ml 4% paraformaldehyd og inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Sentrifuger prøvene igjen i 10 minutter ved 10,000 xg og kast supernatant. Vask celler to ganger med destillert vann og redilute i 100 μl destillert vann. Juster volumet avhengig av løsningens turbiditet.
MERK: Å lage flere serielle fortynninger er en god ide. - Etikett deksel og legg til 40 μL av prøven på den. Inkubér i 15 minutter i en hette for å fordampe væsken og la cellene klebe seg til dekslet. Hvis væske fortsatt er tilstede, bruk en vifte for å fjerne væsken.
- Plasser merkede dekselglass med celler i en pultputeringsmaskin og tape ned. Sikre rent gull i forstøvningsmaskinen. Slå på maskinen og start sputtering ved lavt trykk (50 mTorr). Frakkceller i 30 s ved 80 mA, som oversetter til 20 nm av gullbelegg.
- Overfør belagte celler til skanningelektronmikroskopet.
4. Imaging C. difficile celler på et skanning elektronmikroskop
- Vent skannelektronmikroskopet (SEM) riktig ved hjelp av prEssing vent-knappen på dataprogrammet.
- Ved hjelp av karbonbånd festes de belagte dekselplatene til metallfasen. Når SEM er ventilert, bør døren lett åpnes. Lås metallfasen i SEM-kammeret ved å skru den inn.
- Klikk på PUMP-knappen på datamaskinprogramvaren. SEM vil være nyttig når systemet leser "Vac OK".
- Klikk på SE-detektoren under detektorer-fanen. Slå på strålen ved å klikke på knappen som viser spenningen. Start avbildning ved lavere spenning (5 kV) før du øker spenningen (opptil 15 kV). Et bilde vises etter at strålen er slått på.
- Bruk sporingsfunksjonen, finn et område på de belagte dekselene til bildet. Zoom inn i regionen og finn stangformede strukturer; Disse er clostridium difficile .
- Zoom inn og fokus på bildet for å kalibrere systemet. Dette skal gjøres på flere arbeidsavstander: 15, 9 og 5 mm. Bilde i en arbeidsavstand på 5 mm.
- Slå på degLtra høyoppløselig bildebehandling modus og begynner å fokusere og optimalisere astigmatisme.
- Begynn å fokusere ved høy forstørrelse. Bruk det grove og fine fokuset til å bytte til dette. Juster astigmatisme for å få et klarere bilde.
- Juster astigmatisme ved høy forstørrelse. For å gjøre dette, må du justere astigmatismeveksjonene (de ser ut som de fine / grove fokusbryterne) og sjekker bildet for klarhet ved å zoome inn digitalt på datamaskinprogramvaren.
- Se funksjonen langsom skanning for å samle inn et bilde av høy kvalitet. Lagre det samlede bildet som en. TIFF-fil, som skal brukes til analyse. Kontroller at datafeltet er valgt hvis det skal gjøres målinger under analysen.
- Samle bilder i forskjellige vinkler (opptil 52 ° ved å vri vinkelen manuelt på SEM. Vinklede bilder har en tendens til å avsløre mer dybdeinformasjon.
- Bytt strålespenning avhengig av cellene som blir avbildet. Hold dette mest mellom 5-15 kV for alle eksperimenter. Etter at bildet er fullført, skru av bjelken og øk arbeidsavstanden til 20 mm. Kammeret kan deretter ventileres og scenen kan fjernes. Kopier alle bildene på en stasjon for videre analyse.
5. Bildebehandling og analyse
- Last ned og installer den fritt tilgjengelige programvaren, FIJI (http://fiji.sc), til datamaskinen.
- Åpne bildefilen i FIJI.
- Ved hjelp av linjelfunksjonen sporer du målestokken nøyaktig.
- Klikk på Analyser-fanen i FIJI-programmet, og velg deretter Select Scale-funksjonen. Det vises et vindu som vil kreve innstillingen av den kjente avstanden basert på skalaen. Endre lengdenheten og klikk OK.
- Nå som programmet er kalibrert for avstand, bruk linjelfunksjonen til å måle cellelengden. For å få lengden, bruk linjelfunksjonen til å spore cellen i sin helhet. Velg Analyser-fanen igjen, og klikk deretter på Mål. Lengden skal appØret i enhetene som tidligere er nevnt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Clostridium difficile er en sporeformende bakterie, og det er derfor viktig å bestemme morfologiske forskjeller mellom vegetative og spore celler før enhver funksjonell analyse. Figur 1 viser representative bilder av vegetative celler som ble fanget under eksponensiell fase av vekstkurven og sporceller. Som vist er vegetative celler lange, glatte, stangformede strukturer, mens sporer er små, ovale strukturer som har et grovt utvendig. Funksjonelt vokser vegetative celler og deler seg raskt og er ansvarlige for virulensen av C. difficile- infeksjoner ved å utskille toksiner, mens sporer normalt er sovende med liten aktivitet. Derfor er antibiotika hovedsakelig aktive mot vegetative celler, mens sporer vanligvis er resistente mot rusmiddelbehandling, på grunn av flere lag som beskytter kjernen med DNA, og mangel på fysiologisk aktivitet. På grunn av disse fakta, flertalletAv den morfologiske analysen er fokusert på de vegetative cellene. 11 , 12
En antibiotisk drapskurve er standardmetoden for å demonstrere antibiotisk effekt mot voksende bakterier. Konsentrasjoner brukt med C. difficile stamme R20291 ble basert på MICs-verdiene, 1 μg / mL for vancomycin og 0,51 μg / ml for metronidazol. 10 Som vist i figur 2 vokser kontrollcellene og når et platå, mens de behandlede cellene reduseres i totale kolonidannende enheter (CFU) til detektionsgrensen (LOD) som demonstrerer bakteriedrepende effekt. Som vist er vankomycin ( figur 2A ) og metronidazol ( figur 2B ) effektive ved å drepe C. difficile ved supraMIC konsentrasjoner (4xMIC). Man kan legge merke til at antibiotika-drapkurver ser lik ut, men stoffene har forskjellige mekanismer for ac(Vankomycin hindrer celleveggsyntese mens metronidazol påvirker DNA-replikasjon). Derfor foreslår vi at antibiotiske drapkurver kanskje ikke har nok av diskriminerende kraft til å gi detaljerte forskjeller mellom disse antibiotika. Vi brukte mikroskopi for å gi mer diskriminering.
På grunn av sin mikroskopiske størrelse er C. difficile ikke mulig å bilde uten høy forstørrelse. Dette har gitt mulighet for bruk av skanningelektronmikroskopi (SEM), en avbildningsmetode som kan oppnå oppløsning på nanometer skalaen, for å vurdere de detaljerte effektene av antibiotikabehandling direkte på cellene. For å demonstrere nytten av denne tilnærmingen ble celler avbildet før og etter legemiddelbehandling for å bestemme hvordan morfologien endret seg ( Figur 3A ). Som vist var noen av cellens vegger påvirket, som for vancomycin, og noen av cellene var mindre i størrelse,Som det var tilfelle for metronidazol. For å teste om cellestørrelsen ble påvirket analyserte vi cellelengden ved hjelp av programmet FIJI. Vegetativ cellestørrelse kan variere noe i kontrollhuset, men de fleste er omtrent 6 μm i lengde ( figur 3B ). Når man vurderer mange celler fra kontroll og behandlede innstillinger, kan man raskt merke seg at cellelengden påvirkes fortrinnsvis i metronidazol, men påvirkes ikke av vancomycinbehandling ( figur 3C ).
Figur 1: Differensiering mellom celletyper ved å skanne elektronmikroskopi. Vist er representative bilder av Clostridium difficile vegetative og spore celler. Vegetative celler er stangstrukturer som er lange og flagellerte. I motsetning er sporceller små og har en grov og humpete frakk. Sporer er pseudo-farget rødt for bilde purpoKun ses. Skalestenger vises på bildene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Antibiotiske Time-Kill-kurver. SupraMIC-drapkurver ble båret for fire forskjellige antibiotika: vancomycin (A) , metronidazol (B) . Disse antibiotika hadde betydelig drepende virkning mot C. difficile stamme R20291 og nærmet seg deteksjonsgrensen (LOD) for telling av kolonidannende enheter (CFU). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Undersøkelse av farmakologiske effekter av antibiotisk behandling. Bilder av behandlede og ikke-behandlede celler ble tatt på flere tidspunkter i løpet av de killingskinetiske studier (A) . Vist er et representativt eksempel på en kontroll vegetativ celle som ble målt for lengde (B) . Behandlede og ikke-behandlede celler ble målt og sammenlignet (C) . Eksperimenter ble utført i minst duplikat og> 17 celler ble målt per gruppe. * P <0,05 sammenlignet med kontroll- og vankomycinbehandlingsgrupper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med den nåværende studien var å skape en høy gjennomstrømmingsmetode for isolering av C. difficile og testing av antibiotikaresistens ved bruk av skanningelektronmikroskopi (SEM) som et middel for en mer grundig karakterisering av antibiotikas farmakologiske virkning. Ved hjelp av protokollene som er skissert her, har vi vist at avbildning av cellens fenotypiske respons på antibiotikabehandling kan avsløre innsikt i stoffets farmakologiske virkninger. Samlet tar bildet av denne protokollen omtrent 2 timer i varighet etter å ha samlet cellene, men kan være mye mer diskriminerende enn typiske killingkinetiske studier alene. Mens du lærer å bruke en SEM, kan det være teknisk krevende, er forberedelsen av prøver relativt enkel og rask. Vi mener at disse protokollene som er skissert her, vil gi en objektiv tilnærming til å evaluere den farmakologiske virkningen av antibiotisk behandling.
Tatt i betraktning likhetene mellom tHans antibiotiske drapkurver ( Figur 2 ), vi søkte å avgjøre om det var forskjeller mellom cellens respons på farmakologisk behandling. Ved bruk av SEM bestemte vi at metronidazol hadde effekter på cellelengde ved supraMIC konsentrasjoner av stoffet. Selv om disse fenotypene ikke har blitt rapportert tidligere, er de konsistente med antibiotikernes virkemekanismer og foreslår en effekt på cellemetabolisme og vekst. I kontrast hadde vankomycin betydelige effekter på cellevegget, som også er i samsvar med virkningsmekanismen. 13 Mens det er likheter mellom drapekinetikken mellom disse antibiotika, er det tydelig fra SEM-bildene at det er betydelige fenotypiske forskjeller. Opprette et antibiotisk fenotypebibliotek vil tillate en mer grundig karakterisering av legemidler som kanskje ikke har en klar virkningsmekanisme identifisert, som det er tilfelle av ridinilazol.
becausE denne metoden er teknisk utfordrende, kan det bli nødvendig med modifikasjoner for å ta opp det vitenskapelige spørsmålet, inkludert konsistent cellepreparasjon og endringer i forstøvning av gullbelegg. For mye belegg kan utrydde eventuelle effekter på utsiden av cellene, men ikke nok belegg kan resultere i lading av strålen og forvrengning av bildene. For å unngå dette, lag prøver med forskjellige mengder gullbelegg for å optimalisere sputteringstiden. Til slutt vil konsistent metodikk mellom studier muliggjøre inter-eksperimentelle sammenligninger.
En begrensning av bruk av SEM er at den er begrenset til å observere cellemorfologiske endringer; Derfor er funksjonelle studier nødvendige for å bekrefte enhver mistanke om respons. På grunn av dette tror vi at denne bildebehandlingsprotokollen kan brukes til å styre funksjonsstudier. Til tross for denne begrensningen kan immunogold-merking gjøres ved bruk av SEM for å bekrefte eventuelle mistenkte endringer i proteinhandel eller aggregering;Vi har imidlertid ikke utført disse forsøkene ennå.
På grunn av den aktive rørledningen av nye antibiotika for behandling med C. difficile, er det nødvendig med en grundigere vurdering av narkotikavirkningen. Som presenteres her, tilbyr SEM en unik, høy gjennomstrømning og pålitelig mulighet for å karakterisere farmakologisk virkning. Ved å avdekke mange forskjellige antibiotiske effekter mellom forskjellige stammer av C. difficile , vil vi kunne forstå hvorfor noen antibiotika er mer effektive enn andre mot spesifikke patogene stammer som 027 / NAP1 / BI-epidemisk belastning. 14 SEM-analyse kan dessuten være nyttig for å diskriminere antibiotiske effekter mellom ribotyper eller stammer, og kan brukes til å studere andre bakteriearter som viser sin brede anvendelighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
