Abstract
Оценка действия антибиотиков при разработке новых лекарств, направленная на анаэробные бактерии, сложна и технически сложна. Чтобы получить представление о возможном MOA, морфологические изменения, связанные с воздействием антибиотиков, можно визуализировать с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Интеграция СЭМ-изображений с традиционными кривыми убийства может улучшить наше понимание действия лекарств и ускорить процесс разработки лекарственного средства. Чтобы проверить это предположение, кривые убивания и исследования SEM проводились с использованием препаратов с известными, но разными MOA (ванкомицин и метронидазол). C. difficile cells (R20291) выращивали с или без присутствия антибиотика в течение 48 часов. В течение 48-часового интервала клетки собирали в различные моменты времени, чтобы определить эффективность антибиотиков и визуализацию на SEM. В соответствии с предыдущими сообщениями, ванкомицин и метронидазол проявляли значительную бактерицидную активность после 24 ч лечения, измеряемого колониеобразующей единицей (КОЕ) странытин. С помощью СЭМ-изображений мы определили, что метронидазол оказывает значительное влияние на длину клетки (> 50% уменьшение длины клетки для каждого антибиотика, Р <0,05) по сравнению с контролем и ванкомицином. Хотя фенотипический ответ на лечение наркотиками ранее не был описан в этом документе, они согласуются с MOA лекарственного средства, демонстрируя универсальность и надежность изображений и измерений, а также применение этого метода для других экспериментальных соединений.
Introduction
Clostridium difficile является грамположительной спорообразующей бактерией, ежегодно вызывающей около 500 000 инфекций в США, и считается Центром по контролю и профилактике заболеваний (CDC), который является самым опасным уровнем риска. 1 За последнее десятилетие было отмечено значительное развитие лекарств в противомикробных препаратах с активностью против C. difficile . 2 , 3 Исследования in vitro являются необходимым компонентом процесса разработки лекарственного средства. 4 Традиционно исследования in vitro чувствительности и время убивают используются для проверки будущих животных и других исследований in vivo .
Хотя эти методы и играют важную роль для оценки действия убийства, они не учитывают фенотипический ответ клеток на фармакологическое лечение. Путем включения сканирующей электронной микроскопии (SEM) со стандартнымD убийство кинетических исследований, более тщательная характеристика прямого воздействия антибиотиков возможна. 5 , 6 , 7 Здесь мы представляем метод, в котором SEM используется для определения эффективности лечения антибиотиками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение C. difficile из различных экологических или клинических источников
- Экологические изоляты: Используя предварительно стерилизованный хлопок (слегка смачиваемый 0,85% NaCl), протрите поверхность любой интересующей области (пол, дверь, ручка, полка и т . Д.). 8 Обязательно надевайте стерильные перчатки и поместите тампон в стерилизованную пробирку после завершения.
- Клинические изоляты (стул): от 10 до 100 мг клинических образцов стула на цефокситин-циклосерин-фруктозный агар (CCFA), используя цикл инокуляции и инкубировать в строгих анаэробных условиях в течение 48-72 часов. Сохраняйте изолированные колонии запаса C. difficile в криопробирках при -80 ° C для дальнейших анализов. 7 , 9 , 10
- Обогащайте пробирки с окружающей средой в бульоне для инфузии мозга (BHI) с 0,05% таурохолатом натрия и помещайте его в анаэробную камеру при 37 ° CВ течение 5 дней. Центрифуга 1 мл культуры при 10000 мкг и ресуспендируют осадок в 100 мкл этанола.
- Пластинку ресуспендированных клеток (50 мкл) на чашки циклосеринецефикитинового фруктозного агар (CCFA) и инкубируют в анаэробной камере при 37 ° C в течение 40-48 часов. Сохраняйте изолированные колонии запаса C. difficile в криопробирках при -80 ° C для дальнейших анализов.
- Тестировали подозрительные колонии C. difficile, используя реагент агглютинации латекса или ПЦР.
2. Культивирование кинетических процедур C. difficile и Killing
- Выращивают очищенные экологические или клинические штаммы C. difficile на пластинах кровяного агара в анаэробной камере при 37 ° С в течение 48 часов.
- Возьмите одну изолированную колонию с петлей для инокуляции, перенесите ее в 5 мл BHI-среду в 15-мл пробирку и растите в течение 24 часов в анаэробной камере при 37 ° C.
- Разбавьте прекультуры 1: 100 примерно до 10 6 колониеобразующей единицыС (CFU) / мл в свежих предварительно восстановленных BHIS (BHI плюс 5 г / л дрожжевого экстракта и 1% L-цистеина) с добавлением 0,1% таурохолата натрия и соответствующей концентрации антибиотика (T0).
- Соберите 1 мл образца пипеткой в каждый момент времени (T0, T6, T24, T48) и намажьте / распределите небольшую аликвоту (100 мкл в серийных разведениях) на пластину с кровяным агаром. Пусть клетки растут на пластине с кровяным агаром в течение 48 часов в анаэробной камере при 37 ° C и подсчитывают результирующее количество колоний для определения КОЕ.
3. Подготовка образцов к сканирующей электронной микроскопии
- Соберите 1 мл клеток с каждой точки времени в микроцентрифужных пробирках и центрифугируйте при 10000 мкг в течение 10 мин. Отбросьте супернатант и промойте клетки в PBS.
- Центрифугируют образцы при 10000 мкг в течение 10 мин и отбрасывают супернатант. Повторно развести клетки в 1 мл 4% параформальдегида и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Образцы центрифуги снова в течение 10 мин при 10,000 мкг и отбрасывают супернатант. Промывают клетки дважды дистиллированной водой и повторно разбавляют в 100 мкл дистиллированной воды. Отрегулируйте громкость в зависимости от мутности раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ. Создание нескольких серийных разведений - хорошая идея. - Покровные покровные этикетки и добавить 40 мкл образца на нем. Инкубируйте 15 минут в капюшоне для испарения жидкости и дайте клеткам прилипать к покровному стеклу. Если жидкость все еще присутствует, используйте нагнетатель для удаления жидкости.
- Помеченные покровные стекла с ячейками в настольной машине для напыления и наклеить ленту. Зафиксируйте чистое золото в распылительной машине. Включите машину и начните напыление при низком давлении (50 мТорр). Покрывают клетки в течение 30 с при 80 мА, что соответствует 20 нм золотого покрытия.
- Передача покрытых клеток на сканирующий электронный микроскоп.
4. Изображения C. difficile Cells на сканирующем электронном микроскопе
- Выпуском сканирующего электронного микроскопа (SEM) правильно prНажав кнопку выхода на компьютерном программном обеспечении.
- Используя углеродную ленту, закрепите покровные стекла с покрытием на металлической сцене. Как только SEM будет выпущен, дверь должна легко открыться. Зафиксируйте металлическую ступень в камере SEM, вкрутив ее.
- Нажмите кнопку НАСОС на программном обеспечении компьютера. SEM можно будет использовать, когда система запишет «Vac OK».
- Нажмите на детектор SE под вкладкой детекторов. Включите луч, нажав на кнопку, отображающую напряжение. Начать визуализацию при более низком напряжении (5 кВ) до увеличения напряжения (до 15 кВ). Изображение появится после включения луча.
- Используя функцию отслеживания, найдите область на покровных покровных изображениях. Осмотрите область и найдите стержневые структуры; Это clostridium difficile .
- Увеличьте масштаб и сфокусируйте изображение для калибровки системы. Это должно быть сделано на нескольких рабочих дистанциях: 15, 9 и 5 мм. Изображение на рабочем расстоянии 5 мм.
- ВключитьLtra с высоким разрешением и начать фокусировать и оптимизировать астигматизм.
- Начните фокусироваться на большом увеличении. Для этого используйте грубые и тонкие фокусные переключатели. Отрегулируйте астигматизм, чтобы получить более четкое изображение.
- Отрегулируйте астигматизм при большом увеличении. Для этого настройте переключатели астигматизма (они похожи на переключатели тонкой / грубой фокусировки) и проверьте изображение для ясности путем цифрового увеличения в программном обеспечении компьютера.
- С помощью функции медленного сканирования, чтобы получить высококачественное изображение. Сохраните собранное изображение как .TIFF-файл, который будет использоваться для анализа. Убедитесь, что панель данных выбрана, если измерения будут выполнены во время анализа.
- Собирайте изображения под разными углами (до 52 °, вручную поворачивая угол непосредственно на SEM. Углы изображения, как правило, показывают больше информации о глубине.
- Измените напряжение луча в зависимости от отображаемых ячеек. Держите это в основном между 5 - 15 кВ для всех экспериментов. По завершении формирования изображения выключите луч и увеличьте рабочее расстояние до 20 мм. Затем камера может быть вентилирована, а стадия может быть удалена. Скопируйте все изображения на диск для дальнейшего анализа.
5. Обработка и анализ изображений
- Загрузите и установите свободно распространяемое программное обеспечение FIJI (http://fiji.sc) на компьютер.
- Откройте файл изображения в FIJI.
- Используя функцию линии, точно проведите масштабную шкалу.
- Перейдите на вкладку «Анализ» в программе FIJI и, наконец, выберите функцию «Выбрать масштаб». Появится окно, которое потребует установки известного расстояния на основе шкалы. Измените также единицу измерения длины и нажмите OK.
- Теперь, когда программа откалибрована для расстояния, используйте линейную функцию для измерения длины ячейки. Чтобы получить длину, используйте функцию линии, чтобы полностью проследить ячейку. Снова выберите вкладку «Анализ» и нажмите «Измерять». Длина должна быть appУхо в единицах, обозначенных ранее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Clostridium difficile является спорообразующей бактерией, и поэтому важно определить морфологические различия между вегетативными и споровыми клетками перед любым функциональным анализом. Рисунок 1 демонстрирует репрезентативные изображения вегетативных клеток, которые были захвачены во время экспоненциальной фазы кривой роста и клеток спор. Как показано, вегетативные клетки представляют собой длинные гладкие стержневидные структуры, тогда как споры небольшие, овальные структуры имеют грубую внешность. Функционально вегетативные клетки быстро растут и делятся и ответственны за вирулентность инфекций C. difficile, выделяя токсины, тогда как споры обычно бездействуют с небольшой активностью. Следовательно, антибиотики в основном активны против вегетативных клеток, тогда как споры обычно резистентны к лечению лекарственными средствами из-за нескольких слоев, защищающих сердцевину ДНК, и от недостатка физиологической активности. Из-за этих фактов большинствоМорфологического анализа сфокусирован на вегетативных клетках. 11 , 12
Кривая уничтожения антибиотиков является стандартной методологией для демонстрации эффективности антибиотиков против растущих бактерий. Концентрации, используемые с штаммом C. difficile R20291, основывались на значениях MICs, 1 мкг / мл для ванкомицина и 0,51 мкг / мл для метронидазола. 10 Как показано на рисунке 2 , контрольные клетки растут и достигают плато, тогда как обработанные клетки уменьшают в суммарном количестве колониеобразующих единиц (КОЕ) до предела обнаружения (LOD), демонстрируя бактерицидный эффект. Как было показано, ванкомицин ( фиг. 2А ) и метронидазол ( фиг. 2В ) эффективны при уничтожении C. difficile при концентрациях супрамикрокта (4хMIC). Можно заметить, что кривые убийства антибиотиков выглядят одинаково, но у препаратов разные механизмы переменного тока(Ванкомицин предотвращает синтез клеточной стенки, тогда как метронидазол влияет на репликацию ДНК). Поэтому мы предлагаем, чтобы кривые уничтожения антибиотиков не обладали достаточной дискриминационной способностью, чтобы обеспечить детальные различия между этими антибиотиками. Мы использовали микроскопию для большей дискриминации.
Из-за его микроскопических размеров C. difficile невозможно изобразить без большого увеличения. Это дало возможность использовать сканирующую электронную микроскопию (SEM), метод визуализации, который может получить разрешение в нанометровом масштабе, чтобы оценить детальные эффекты антибиотикотерапии непосредственно на клетках. Чтобы продемонстрировать полезность этого подхода, клетки были отображены до и после лечения наркотиками, чтобы определить, как изменилась морфология ( рис. 3А ). Как было показано, некоторые стенки клеток были затронуты, как в случае ванкомицина, а некоторые клетки были меньшего размера,Как это было в случае метронидазола. Чтобы проверить, был ли затронут размер ячейки, мы проанализировали длину ячейки, используя программу FIJI. Вегетативный размер клетки может варьироваться в контрольном случае, но большинство из них имеют длину примерно 6 мкм ( рис. 3В ). При рассмотрении многих клеток из контрольных и обработанных параметров можно быстро заметить, что длина клетки преимущественно влияет на метронидазол, но на ванкомицин не влияет ( рис. 3С ).
Рисунок 1: Дифференциация между типами клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии. Показаны репрезентативные изображения растительных и споровых клеток Clostridium difficile. Вегетативные клетки являются стержневыми структурами, которые являются длинными и чешуйчатыми. В отличие от этого, споровые клетки маленькие и имеют шершавое и шершавое пальто. Споры являются псевдоцветными красными для изображенияТолько. На изображениях отображаются шкалы шкалы. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Кривые времени-убийства антибиотика. Кривые гибели SupraMIC были проведены для четырех различных антибиотиков: ванкомицина (А) , метронидазола (В) . Эти антибиотики обладают значительным убивающим действием против штамма C. difficile R20291 и приблизились к пределу обнаружения (LOD) для подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Исследование фармакологических эффектов антибиотикотерапии. Изображения обработанных и необработанных клеток брали в различные моменты времени во время кинетических исследований (А) . Показан репрезентативный пример контрольной вегетативной клетки, которая была измерена для длины (B) . Обработанные и необработанные клетки измеряли и сравнивали (C) . Эксперименты проводились, по меньшей мере, в двух повторностях и для каждой группы измерялись> 17 клеток. * Р <0,05 по сравнению с контрольными и ванкомициновыми группами. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Целью настоящего исследования было создание высокопроизводительного метода для выделения C. difficile и тестирования восприимчивости к антибиотикам с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) в качестве средства для более полной характеристики фармакологического действия антибиотика. Используя протоколы, описанные здесь, мы продемонстрировали, что визуализация фенотипического ответа клетки на лечение антибиотиками может показать понимание фармакологического действия препарата. В целом, часть изображения этого протокола занимает примерно 2 часа после сбора клеток, но может быть намного более дискриминационной, чем типичные кинетические исследования кинетики. Хотя обучение использованию SEM может быть технически сложным, подготовка проб относительно проста и быстра. Мы считаем, что эти протоколы, изложенные здесь, обеспечат объективный подход к оценке фармакологического действия антибиотикотерапии.
Учитывая сходство между t(Кривая 2 ), мы попытались определить, существуют ли различия между реакцией клетки на фармакологическое лечение. Используя SEM, мы определили, что метронидазол оказывает влияние на длину клетки при концентрациях выше этого препарата. Хотя эти фенотипы ранее не сообщались, они согласуются с механизмами действия антибиотиков и предполагают влияние на клеточный метаболизм и рост. Напротив, ванкомицин оказывает значительное влияние на клеточную стенку, что также согласуется с его механизмом действия. Хотя между кинетикой убийства между этими антибиотиками есть сходство, из изображений СЭМ видно, что существуют значительные фенотипические различия. Создание библиотеки фенотипов антибиотиков позволит провести более тщательную характеристику лекарственных средств, для которых может отсутствовать четкий механизм действия, как, например, в случае ридинилазола.
BecausЭтот метод технически сложный, могут потребоваться модификации для решения научного вопроса, включая последовательную подготовку клеток и изменения в напылении золотого покрытия. Слишком большое покрытие может привести к смазыванию любых эффектов на внешнюю сторону ячеек, но недостаточное покрытие может привести к зарядке луча и искажению изображений. Чтобы избежать этого, подготовьте образцы с различным количеством золотого покрытия для оптимизации времени распыления. Наконец, последовательная методология между исследованиями позволит проводить межэкспериментальные сопоставления.
Ограничение использования SEM заключается в том, что оно ограничено наблюдением изменений морфологии клетки; Поэтому функциональные исследования необходимы для подтверждения любого подозрительного ответа. В связи с этим мы считаем, что этот протокол визуализации может быть использован в качестве средства руководства функциональными исследованиями. Несмотря на это ограничение, маркировка иммуноглолдами может быть выполнена с использованием SEM для подтверждения любых подозрительных изменений в торговле или агрегации белков;Однако мы еще не проводили эти эксперименты.
Из-за активного трубопровода новых антибиотиков для лечения C. difficile необходима более тщательная оценка действия препарата. Как представлено здесь, SEM предлагает уникальную, высокую пропускную способность и надежную возможность для характеристики фармакологического действия. По визуализации многих различных антибиотических эффектов среди различных штаммов C. difficile мы сможем понять, почему некоторые антибиотики более эффективны, чем другие, против специфических патогенных штаммов, таких как штамм эпидемий 027 / NAP1 / BI. 14 Кроме того, анализ СЭМ может быть полезен для выявления антибиотических эффектов между риботипами или штаммами и может быть использован для изучения других видов бактерий, демонстрирующих его широкую применимость.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
