Introduction
핵심은 배아 (1), (2)에서 개발 한 최초의 기능 기관이다. 순환계와 함께에서는 산소, 영양분, 개발시의 폐기물 처리 장치에 공급한다. 3 주 후, 수정, 인간 심장 처음 박동 및 적절한 조절은 심근 (CMS)에 의해 유지된다. 이들 특화된 세포의 비가역적인 손실 따라서 진보적 심부전의 기초가되는 기본적인 문제이다. 이러한 제브라 피쉬 제노와 같은 일부 유기체는 심장 재생 잠재력을 가지고 있지만, 성인 포유류 심장 3, 5, 6 개의 제한된다. 따라서, 심장의 중요한 기능을 제공, 심장 질환 혼자 7 미국에서 60 만 명이 사망를 차지, 세계에서 사망의 주요 원인이다 놀라운되지 않습니다. 그만큼효율적으로 복구하거나 손상된 심근을 대체 할 refore, 세포 기반 치료는 큰 임상 적 관심이다.
야마나카 동료 8 정액 연구는 네 개의 전사 인자 강제 발현이 다 능성 줄기 세포로 완전히 분화 된 섬유 아세포를 변환하기에 충분한 것으로 나타났다. 그러나, 모든 다 능성 줄기 세포의 종양 전략 용량은 치료 목적의 사용에 중요한 문제였다. 이것은 능성 단계를 피하면서 다른 방법은 세포를 transdifferentiate하는 검색 할 과학 분야 동기를 부여. 최근, 여러 그룹이 전사의 자궁외 식으로 유도 된 심근 유사 세포 (iCLMs)에 마우스 섬유 아세포의 직접 변환을 표시하여이 전략의 가능성을 보여 주었다 Gata4, Mef2c, Tbx5, 나중에, Hand2 (GMT 및 GHMT 요인 각각) 9,10. 작고에hermore 동일한 전략은 생체 내에서 인간 유래 조직 9, 11, 12에서 수행 될 수있다. 최근 연구에 추가적인 요소 또는 심부전 리 프로그래밍 효율을 13, 14, 15을 향상시키는 변조 될 수있는 신호 전달 경로를 강조하고있다. 함께 찍은, 이러한 연구는 재생 요법에 대한 감독 분화의 가능성을 보여줍니다. 그러나, 방법 론적 차이 16 CM 리 프로그래밍, 미지의 분자 메커니즘 일관성 재현성의 저 효율성 및 iCLMs의 이질적인 성질은 어드레싱 남아있다.
직접 iCLM 얼룩을 평가하기 위해, 우리는 근절 개발 및 심장 계통 specificatio의 식별 이산 견고한 단일 세포 분석 설계N-이 기능 심근의 필요한 특성. 심방 (AM), 심실 (VM)와 조정기 (PM) 17, 18, 19, 20의 위치와 고유의 전기적 특성에 의해 정의되는 심장 CM의 적어도 세 가지의 유형이있다. 조율 된 조합, 그들은 혈액의 적절한 펌핑을 할 수 있습니다. 심장 손상 중에, 하나 또는 모든 아형의 영향을 야기 할 수 있으며 세포 치료의 유형은 경우에 따라 해결해야 할 것이다. 작은 일이 부속 명세서를 조절하는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 수행되는 동안 현재 대부분의 전략은 심근 세포의 전체적인 생성에 초점을 맞춘다.
다음 연구는 제대로 잘 조직 된 근섬유 분절을 정량화 및 심근 서브 타입의 다양한 세트를 식별하는 방법을 자세히 설명합니다. 페이스 메이커 (PM) - 특정 기자 마우스를 사용하여, 우리는 난을 적용 할 수 있습니다mmunocytochemical 접근 방식은 유도 심방 같은 근육 세포 (IAM), 유도 심실 같은 근육 세포 (IVM)과 유도 PM-같은 근육 세포 (IPMS) (21)를 구별한다. 우리의 관찰에 기초하여, 전용 근절 조직을 나타내는 세포는 자율 박동 할 수있다. 이 독특한 프로그래밍 플랫폼 역할을 평가하기 위해 허용 단일 셀 해상도 근절 조직, 하위 사양 및 CM의 재 프로그래밍의 효율성의 특정 매개 변수를 설정합니다.
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Protocol
동물 관행과 관련된 모든 실험 절차는 UT 사우스 웨스턴 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
Hcn4-GFP E12.5 마우스 배아 섬유 아세포 1. 분리 (MEFs에)
- 동형 접합 Hcn4-GFP의 남성과 CD-1 여성 사이의 시간 제한 교배를 설정합니다.
- 이산화탄소 안락사 이후 자궁 전위에 의해 E12.5에서 임신 여성을 희생.
- 이전 23 22 설명 된대로 해부 집게와 자궁 뿔을 제거하고 칼슘 또는 마그네슘없이 1X 인산 완충 식염수 (PBS)와 얼음에 페트리 접시 2+에 배치합니다.
- 멸균 기법을 사용하여 조직 배양 후드에서 모든 후속 단계를 수행한다.
- 가위를 사용하여 집게를 해부 골목 자궁과 양수에서 배아를 제거합니다. 더 나은 처리를 위해 첨부 된 태반을 유지합니다. 레그나NT CD-1 여성은 일반적으로 10 ~ 14 새끼를 낳을.
- 집게를 해부 사용하여 격리 된 배아을 빠르게 70 % (v / v)의 EtOH로 두 번을 씻어.
주 : 세척은 세포 사멸을 최소화하기 위해 빠른해야한다. - 격리 된 배아에서 심장을 포함, 머리, 사지, 꼬리와 내장을 제거합니다.
- 약 1mm 3 크기로 멸균 면도날을 사용하여 1X PBS와 잘게 다진 1 mL를 10 cm 접시에 남아있는 조직을 놓습니다.
- PBS로 50 ML 원뿔 튜브에 다진 조직을 전송합니다.
- 3 분 동안 300 XG에 스핀. 조심스럽게 과량의 PBS를 대기음.
- 배아 당 멸균 0.25 % 트립신 - EDTA의 1 ML을 추가합니다. 15 분 동안 37 ° C의 수조에서 세포를 부화. 부드럽게 튜브마다 4 분을 섞는다. 오버 소화 조직의 크게 수율을 낮출 것이다.
- 4 초 동안 최대 속도 (3200 RPM)에서 소용돌이 세포 혼합물.
- 배아 당 섬유 아세포 미디어의 2 mL를 넣고 섞는다. 필터 t스트레이너를 통해 세포를 돕기 위해 피펫을 사용하여 100 μm의 셀 스트레이너 hrough. 이후의 모든 매체의 배합은 표 1을 참조하십시오.
- 4 분 동안 300 XG에 스핀. 조심스럽게 뜨는을 대기음.
- 3 배아 당 신선한 섬유 아세포 미디어의 10 ㎖를 추가하고 6 ~ 10 번 씹다.
- 준비 매 3 배아 1 15 cm 조직 배양 접시에 세포를 플레이트. 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 문화 하룻밤.
- 밤새 배양 한 후, 접시 당 미디어의 신선한 30 mL로 미디어를 교체합니다. 밤새 다시 인큐베이터로 세포를 놓습니다.
참고 : 형광 현미경 Hcn4-GFP + 세포의 오염을 확인합니다. 문화는 GFP해야한다 - 만 프로그래밍에 GFP +를하게된다. - 다음날, 신선한 미리 예열 0.25 % 트립신 EDTA 3 mL를 수확 세포. 카운트 세포를 동결. 일반적으로 용액 당 3 × 10 6 세포에서 세포를 동결. 예상 yieLD는 배아 당 3 × 10 6 세포해야한다.
2. 레트로 바이러스 생산 및 재 프로그래밍
주의 : 다음 프로토콜은 감염성 레트로 바이러스의 생산 및 처리가 필요합니다. BSL-2 가이드 라인 및 무균 기술 하에서 바이오 안전성 레벨 2 장에서 다음 단계를 수행합니다. 레트로 바이러스에 노출 된 모든 자료를 폐기하는 10 % 표백제를 사용합니다.
- 레트로 바이러스의 생산 및 MEFs에 준비
참고 : 다음과 같은 프로토콜을 24 웰 플레이트에서 레트로 바이러스 6 웰 플레이트에서 생산 및 MEF 감염입니다. 다른 형식은 표 2를 참조하십시오. 타이밍 (섹션 2.3 및 그림 2 참조) 각 실험에 대해 적절하게 조정해야합니다 있도록 MEFs에이 일 -1에 도금되어있다.- 플랫-E (PE) 제조업체의 권장 사항에 따라 세포를 유지한다. 간단히, DMEM에서 배양 PE 세포는 10 % FBS, 1 μg의 / ㎖로 보충 된 puromyCIN, 10 μg의 / ㎖의 블라스트, 페니실린 및 스트렙토 마이신. 통로 세포 1 : 문화 70~90%의 포화 상태에 도달 4 이틀.
- 일 -2 : 형질 전날, 형질 미디어에서 6 웰 플레이트에 / 잘 1 × 10 6 세포에서 플랫 - E 세포를 시드. 세포를 형질 감염시 70~80% 합류해야한다.
- 상업적 형질 전환 제를 이용하여 형질 전환.
참고 : 상용 시약은 형질 전환 전에 실온 (RT)에 있어야합니다. DNA를 형질 들어 GHMT 칵테일 구를 형성하여 레트로 바이러스 플라스미드 DNA 각각 (G, H, M, 및 T)를 추가한다.- 일 -1 : 15 ML 원뿔 폴리스티렌 튜브에서, 6 웰 플레이트 형식 반응 당 형질 감염 시약 6 μL의 혈청 감소 배지 중 60 μL를 혼합한다. 실온에서 5 분 동안 혼합물을 인큐베이션.
주 : 여기에서 사용 된 트랜 스펙 션 시약 플라스틱 결합 때문에,직접 환원 혈청 배지에 형질 전환 효율의 임의의 감소를 피하기 위해 DD. - 반응 당 GHMT 칵테일 2 μg의 총을 추가하고 부드럽게 섞어 누릅니다. 소용돌이하지 마십시오. RT에서 15 분 동안 반응물을 인큐베이션.
- 드롭 현명한 방식으로 PE 세포 단계 2.2.3에서 혼합물을 추가합니다.
- 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 하룻밤 형질 플랫 - E 세포를 품어. 형질 전환의 시간을 기록한다.
- 일 -1 : 15 ML 원뿔 폴리스티렌 튜브에서, 6 웰 플레이트 형식 반응 당 형질 감염 시약 6 μL의 혈청 감소 배지 중 60 μL를 혼합한다. 실온에서 5 분 동안 혼합물을 인큐베이션.
- Hcn4-GFP 마우스 배아 섬유 아 세포의 시드.
- 1 시간 MEFs에 도금하기 전에, 면역 세포 화학에 대한 24 웰 플레이트를 준비합니다.
- 물론 당 12mm의 피브로넥틴의 커버 슬립을 추가합니다.
- (예 SureCoat) 소 콜라겐 용액 300 μL 및 코트 웰을 1 시간 동안 37 ° C의 배양기에서 배양한다.
- 바로 MEF 도금 전에 대기음 코팅 용액.
- Hcn4-GFP MEFs에의 냉동 병을 녹여 및 사전 예열 fibrobl에 1 개를 세척5 분 500 XG에 AST 미디어.
- 트리 판 블루 배제 또는 유사한 염료를 사용하여 세포 생존을 결정합니다. 다음 식을 사용하여 배양 용액 당 생존 세포의 수를 계산한다 :
% 가능한 세포가 = [1.00 - (총 세포의 파란색 셀 수 / 수)] × 100- 다음 식을 이용하여 생존 세포의 수를 계산한다 :
세포 현탁액의 생균 = % 생존 세포의 X 희석 인자 X 10,000 X 전량
- 다음 식을 이용하여 생존 세포의 수를 계산한다 :
- 이전에 제조 된 소 콜라겐 솔루션 피브로넥틴 coverslip에있는 24 웰 플레이트 상에 잘 당 종자 3 × 104 세포.
- 1 시간 MEFs에 도금하기 전에, 면역 세포 화학에 대한 24 웰 플레이트를 준비합니다.
- 형질 도입 및 MEFs에의 재 프로그래밍
참고 : 제조업체의 메모에 따르면, 제대로 플랫 - E 세포를 1 × 10 7 감염 단위 / mL의 평균 역가를 생산 유지했다. 역가가 직접 각 실험 측정되지 않지만하는 GFP 제어는 항상 감염 효율에 대한 대용으로 포함된다.높은 GFP 발현 강도 (GFP +> 95 %)는 일반적 iCLMs 성공적 GHMT 매개 세대 연관.- 0 일 24 시간 후 형질 감염은, 0.45 ㎛의 세공 크기의 계면 활성제가없는 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 PE 레트로 매체 필터링하고 15ml의 원뿔형 튜브에 옮긴다. 8 μg / ML의 최종 농도로 폴리 브렌을 추가한다. 조심스럽게 새로운 형질 감염 배지 2 ㎖의 세포를 보충.
주 : 매체가 너무 빠르게 변경되면 세포는 쉽게 판에서 분리합니다. - 배양 MEFs에의 매체를 기음과 갓 수집 된 레트로 바이러스 매체를 추가; 그것은 6 웰 플레이트의 웰 당 미디어 1.7 mL로 산출한다. 24 웰 플레이트의 웰 당 ~ 800 μL를 추가합니다. 인큐베이터에 MEF 플레이트를 반환하고 밤새 품어.
- 1 일 : 반복 2.4.1와 2.4.2 단계를 반복합니다. 2 차 바이러스 수집 한 후 세포를 폐기하십시오. 인큐베이터에 감염된 MEFs에를 반환하고 하룻밤 휴식을 할 수 있습니다.
- 주 2 : 48 시간 후 유도, 1X PBS로 세포 조절 미디어 및 세척 1 개를 대기음. 24 웰 플레이트의 웰 당 500 μL 사전 예열 iCLM 미디어를 추가합니다.
- 삼일 - 매 2 iCLM 미디어를 교체합니다. 십사일 심장 프로그래밍의 면역 세포 (ICC) 분석을 위해 바이러스 유도 후 처리 플레이트.
- 0 일 24 시간 후 형질 감염은, 0.45 ㎛의 세공 크기의 계면 활성제가없는 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 PE 레트로 매체 필터링하고 15ml의 원뿔형 튜브에 옮긴다. 8 μg / ML의 최종 농도로 폴리 브렌을 추가한다. 조심스럽게 새로운 형질 감염 배지 2 ㎖의 세포를 보충.
재 프로그램 MEFs에 3. 면역 염색
- 14 일 후 유도, 신중하게 미디어를 대기음.
- 얼음처럼 차가운 1X PBS 300 μL 잘 각을 씻어. 초과 솔루션을 대기음.
- 24 웰 플레이트의 웰 당 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액 250 μL와 세포를 수정. 실온에서 15 분을 품어.
참고 : - 염색 전에 이주 고정 세포를 1 4 ° C에서 PBS에 저장할 수 있습니다. - 300 μL 0.1 % PBS - 트리톤 100 (PBST)로 세척 웰 X3에 의해 Permeabilize 하시려면 세포. 세척 사이 RT에서 5 분을 품어. 마지막 세척 후 과잉 솔루션을 대기음.
- 10 블록300 μL / 웰의 1 배 범용 블록 버퍼와 RT에서 분.
- (ICC) 염색 버퍼를 준비합니다 버퍼를 차단 1X PBS 및 1X 유니버설의 1 : 1을 추가합니다. ICC 염색 버퍼에 차 항체를 희석하고 4 ℃에서 밤새 항체를 품어. 권장 희석 용 재료 섹션을 참조하십시오.
- Nppa IPM 및 IAM 식별을위한 마우스 α-티닌, 닭 αGFP, 토끼와 슬라이드의 한 쌍의 얼룩.
- IPM 및 IVM 식별을위한 마우스 α-티닌, 닭 αGFP, 토끼 Myl2으로 슬라이드 한 쌍의 얼룩.
- 다음 날, 300 μL 0.1 % PBST로 웰 X3 씻는다. 세척 사이 RT에서 5 분을 품어. 마지막 세척 후 과잉 솔루션을 대기음.
- ICC 염색 버퍼에 차 항체 희석을 준비합니다. 권장 희석 용 재료 섹션을 참조하십시오. 이차 항체를 빛으로부터 보호 실온에서 1 시간을 품어.
- 다음 보조 antibodie 모든 슬라이드를 얼룩S : 마우스 알렉사-555, 닭 알렉사-488을, 토끼 알렉사-647.
- 300 μL 0.1 % PBST로 웰 X3을 씻으십시오. 세척 사이 RT에서 5 분을 품어. 빛으로부터 보호합니다.
- 유리 현미경 슬라이드에 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI)의 1.5 μg의 / mL로 포함하는 설치 매체의 2.4 μL를 추가합니다. 조심스럽게, 24 웰 플레이트의 우물에서 커버 슬립을 제거 여분의 용액을 제거하고 설치 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 전송할 수 있습니다. 부드럽게 초과 볼륨과 공기를 제거하기 위해 커버 슬립을 누릅니다.
- 선호 매니큐어 또는 플라스틱 밀봉 제와 인감 슬라이드. 상점은 빛으로부터 보호 4 ° C에서 슬라이드를 장착.
공 초점 현미경을 사용하여 심장 서브 타입의 4 확인
주 : 촬상 들어, 공 초점 레이저 주사 현미경은 적어도 2 형광체 (405)에 스펙트럼 감지 가능한 감지기, 488, 555, 및 639 nm의 파장을 구비 IPMS, IAMS 및이 iVMS를 식별하기 위해 필요하다. IMAG플랜 - 고차 색지움 20X / 0.75 목적 또는 더 나은 사용하여 전자 셀. 제조업체의 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 40X 오일 침지 품질의 이미지를 얻을 수 확대 이미지를 스캔.
- 이미지 라이브러리 : DAPI, 알렉사-488, 알렉사-555, 알렉사-647 채널 8 비트 이미지를 가지고 (CH.). 픽셀을 2 6의 1024 프레임 크기, 라인 단계의 체류 시간, 및 (2)의 평균은 높은 해상도 이미지에 충분하다.
- 각 슬라이드를 들어, 하나의 가장자리에서 시작하고 최대 스캔 시작 α-티닌 + 근절 + 세포의 적색 형광 채널 (CH.)에서 아래 (예 3을 참조하십시오 그림 5A). 근절 줄무늬는 555 nm 파장에서 시각적으로 쉽게 식별 할 수 있습니다.
- α-티닌 + 근절 + 세포가 확인되면, 녹색 CH 전환. 이 긍정적 인 경우 (IPM)을 메모를 유지합니다. 원적외선 647 채널을 평가하기 위해 컴퓨터로 전환합니다. (IAM 또는 IVM).
참고 : 있습니다 셀α-티닌 + / 근절 + / Hnc4-GFP + / Nppa - / Myl2은 - IPMS로 지정되어 있습니다. GFP 발현 세포 (도 4a)에 걸쳐 알 수있다. - α-티닌 (마우스 Alexa555), Hcn4-GFP (닭 Alexa488)와 얼룩 슬라이드, Nppa (토끼 Alexa647) 및 DAPI. α-티닌 + / 근절 + / Hnc4-GFP있는 세포 - / Nppa +는 IAM 있습니다. Nppa 염색은 핵 주변 및 점상 (그림 4B)를 나타납니다.
- α-티닌 (마우스 Alexa555)와 얼룩 슬라이드, Hcn4-GFP (닭 Alexa488), Myl2 (토끼 Alexa647). α-티닌에 대한 긍정적 인 세포 + / 근절 + / Hnc4-GFP는 - / Myl2 +이 iVMS 있습니다. Myl2 염색은 근절 필라멘트를 따라 가로 무늬 양식을 전시 할 예정이다. 때문에 염색 및 Z 평면의 품질 변화에 줄무늬가 항상 (그림 4C) 쉽게 표시되지 않을 수 있습니다.
- α-티닌 + 근절 + 세포가 확인되면, 녹색 CH 전환. 이 긍정적 인 경우 (IPM)을 메모를 유지합니다. 원적외선 647 채널을 평가하기 위해 컴퓨터로 전환합니다. (IAM 또는 IVM).
주 : 잠재적으로 재 프로그램 된 MEFs의 실제 수를 평가하기 위해, 24 웰 플레이트의 웰이 실험 웰에 병렬로 시딩하고, 도금 후 하루 수확. 도금 셀의 총 개수는 두 개의 웰을 평균함으로써 결정된다. 이 도금 실제 총 세포 (aTotal)을하게된다.
- 근절 +
- 시각적으로 적절한 α-티닌 + / 근절 + (오른쪽 패널 그림 3)과 기록 (그림 5B-1)에 대한 커버 슬립 각 셀을 검사합니다.
- 도금 실제 총 세포 (aTotal)에 의해 각각의 커버 슬립과 분할에 α-티닌 + / 근절 +의 총 수를 집계 (그림 5B-III). aTotal = 12,500 세포 및 100 세포가 α-티닌 된 경우, 예를 들어 + / + 근절 후, 도금 MEFs에 0.8 %가 다시 프로그램되었다. 평균reprograming 실험은 1 % α-티닌은 + / 근절 + 세포 (그림 5C)를 얻을 것입니다.
- 하위 유형 +
참고 : 다음 단계는 대표 iCLM 정량 워크 플로우 5B / C 그림을 참조하십시오. 이 중 하위 유형 (그림 5B-1)에 대한 고유 한 경우 간단히, 각 근절 + 셀, 집계. 평균 근절 + X 100 세포 (도 5b-1)를 통해 부속 + 세포의 수를 나누어 % 하위 유형 (도 5b-III)을 계산한다. 절대 %의 하위 효율 (그림 5B-IV)를 계산하려면, 그림에서 하위 유형 + 세포 수를 분할 5B-난 × 100 (그림 5B-II) 시드 세포의 총 수에 의해.- 그들은 GFP +, Nppa +, 또는 Myl2있는 경우, α-티닌의 각 + / 근절 + 세포의 경우, 평가
- / Myl2 - -, 티닌 + / 근절 + / Hnc4-GFP - / Nppa +, 및 α-티닌 + / 근절 + / Hnc4-GFP α-티닌 + / 근절 + / Hnc4-GFP + / Nppa의 총 수를 집계 - / Myl2 + 세포 (도 5b-1).
- 각 하위 유형의 비율을 계산하려면, 잘한다는 점에서 + / 근절 + 세포 α-티닌의 총 수에 의해 서브 타입 + 세포의 수를 분할하고 100 GHMT 곱 IPMS, IAMS, 그리고이 iVMS 대략 동일한 비율을 생성한다 (그림 5B-III).
- 아형 + 세포의 절대 수를 계산하기 aTotal하여 실험 조건 아형 + 세포의 총 수를 100 분할하고 (도 5b-II)로 곱한다. 평균 IPMS는 전체 감염 세포 인구의 0.3 %, IAMS 0.3 %를 나타낼과이 iVMS 0.25 % (그림 5B-IV).
- 그들은 GFP +, Nppa +, 또는 Myl2있는 경우, α-티닌의 각 + / 근절 + 세포의 경우, 평가
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Representative Results
PM을 특정 리포터 마우스 활용, 우리는도 1에 도시 된 바와 같은 다양한 내인성 근세포를 식별하기 위해 멀티 플렉스 면역 전략을 개발했다. 도 2에 도시 된 프로그래밍 단계에 따라, 특정 아형의 CM 유도이라도 낮은 속도 빠르면 4 일째 21로 감지 할 수있다. 14 일으로 실험을 중지 할 수 있습니다 및 근절 조직 (그림 3)과 서브 타입 - 사양 (그림 4)에 대한 평가 하였다. 그림 5는 ICC (그림 5 패널 A)에 대한 슬라이드 준비의 워크 플로우 및 iCLM 하위 특정 세포 (그림 / C 5 패널 B)의 정량을 요약 한 것입니다.
그림 1 : 내생의 하위 유형의 다양성심근. α-티닌에 대한 Hcn4-GFP 기자 마우스에서 신생아 심방 심근 (근절 마커, 적색), Hcn4-GFP (녹색 오후 마커) 및 Nppa (심방 마커, 오렌지)의 (AB) 면역 세포 화학 (ICC) 염색. α-티닌에 대한 Hcn4-GFP 기자 마우스에서 신생아 심실의 심근 (근절 마커, 적색), Hcn4-GFP (녹색 오후 마커) 및 Myl2 (심실 마커, 오렌지)의 (C) 면역 세포 화학 염색법. DAPI (파란색) : 핵 염색. 스케일 바 : 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 배양액. GHMT - 유도 리 프로그래밍 동안 사용하는 여러 매체의 제조 표 요약. 표 2 : 시드, 형질 및 유도 형식.세포의 도금 및 형질에 대한 (A) 표 요약. (B) 시드 밀도와 대략적인 감염 단위 (또는 바이러스 상층 액) 심근 유사 세포로 MEFs에를 유도 할 필요가 있었다. 
그림 2 : 타임 라인 회로도를 재 프로그래밍. GHMT 유도 Hcn4-GFP MEFs에의 도식 표현. 세 가지 주요 단계가 도시된다. 
그림 3 : 근절기구의 정도. α-티닌 (근절 마커, 빨간색)에 대한 Hcn4-GFP MEFs에 십사일 GHMT 후 전달의 ICC 염색 근절 조직의 다양한 범위를 보여줍니다. 조직 증가의 정도에서 오른쪽 패널로 떠났다. 각 레벨의 대표 이미지 (N = 3). 스케일 바 : 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 4 : 서브 타입 별 재 프로그래밍 Cardiomyo cytes. α-티닌 (근절 마커, 빨간색)에 대한 GHMT-형질 Hcn4-GFP MEFs에의 (AC) ICC 염색, Hcn4-GFP (PM 마커, 녹색), Nppa (심방 마커, 오렌지), 또는 Myl2 (심실 마커, 오렌지) . DAPI (파란색) : 핵 염색. 스케일 바 : 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 5 : 이미지 인식 및 분석 워크 플로우. 이미지 분석을위한 도식 표현. 패널 A는 세포를 근절 + 및 서브 타입 특이성을 할당하는 순서를 도시한다. 패널 B (I-IV)와 C는 평균 GHMT - iCLM 실험에서 예상되는 결과를 보여줍니다. 요점 및 수식은 녹색으로 표시됩니다.톰 / 파일 / ftp_upload / 55456 / 55456fig5large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. iCLM 미디어 구성 요소 볼륨 (ML) 최종 농도 DMEM (270) 중간 199 (90) FBS (50) 10 % 인슐린 트랜스페린 - 셀레늄 G 2.5 0.50 % MEM 비타민 용액 (10) 2 % MEM 아미노산 (20) 4 % 비 필수 아미노산 (10) 2 % 항생제 항진균제 (10) 2 % B-27 보충 (10) 2 % 열 불 활성화 말 혈청 (25) 5 % 나-피루브산 2.5 1.5 밀리미터 플랫-E 미디어 (PE) 구성 요소 볼륨 (ML) 최종 농도 DMEM (450) FBS (50) 10 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (5) 1% 퓨로 마이신 0.05 1 μg의 / mL의 블라스트 0.5 10 μg의 / mL의 섬유 아세포 배지 (FB) 구성 요소0; 볼륨 (ML) 최종 농도 DMEM (450) FBS (50) 10 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (5) 1% 루타 (5) 1% 형질 매체 (TXF) - 필터링 (0.45 μm의) 구성 요소 볼륨 (ML) 최종 농도 DMEM (450) FBS (50) 10 % 면역 세포 (ICC) 염색 버퍼 구성 요소 볼륨 (ML) 최종 농도 1X PBS (5) 1 배 유니버설 차단 버퍼 (5) A) 세포 파종 및 형질 전환 플레이트 / 접시 표면 면적 (cm 2) 시드 밀도 (셀) 성장 배지 (mL) 중 형질하는 총 DNA의 양 (μg의) 형질 시약 (μL) 감소 세럼 미디어 (μL) 15cm 플레이트 (152) 1.00E + 06 (20) (25) (75) (600) 10cm 플레이트 (55) 5.50E + 06 (10) 9 (27) (300) 6cm 판 (21) 2.20E + 06 4 3.5 10.5 (105) 6도 / 1 개 9 1.00E + 06 이 이 6 (60) 12도 / 1 개 4 4.00E + 05 1 0.5 1.5 (15) 24도 / 1 개 이 2.00E + 05 0.5 0.3 0.9 9 48도 / 1 개 1 1.70E + 05 0.25 0.15 0.45 4.5 B) 섬유 아세포의 파종 및 유도 플레이트 / 접시 섬유 아세포 파종 밀도 (단위 : 백만) iCLM에 대한 대략적인 감염 단위 6cm 판 0.22-0.33 5.00E + 7 (~ 5 ㎖) 6도 / 1 개 0.1-0.15 3.00E + 7 (~ 3 ㎖) 12도 / 1 개 0.04-0.06 1.30E + 7 (1 ~ ㎖) 24도 / 1 개 0.02-0.03 6.50E + 6 (~ 0.8 ㎖) 48도 0.001-0.015 3.00E + 6 (~ 0.4 ㎖)
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Discussion
본 연구는 심장 전사의 레트로 바이러스 - 매개 발현을 통해 심장 서브 타입의 다양한 세트로 MEFs에의 변환을위한 직접 프로그래밍 전략을 제공하는 Gata4, Mef2c, Tbx5 및 Hand2 (GHMT) 요인. PM 특정 리포터 마우스와 함께 면역 다중화 방식을 사용하여, 우리는 단일 세포 해상도에서 IAM,이 iVMS 및 IPMS를 식별 할 수있다. 이러한 분석은 하위 유형의 다양성과 근절 개발에 대한 개별 전사 인자의 기여를 분리 할 수있는 체외 시스템에서 실험이 가능합니다. 병행하여,이 새로운 전사 인자 또는 특정 혈통 iCLMs쪽으로 치우치게 소분자에 대한 통찰력을 가지고 있었다. 그럼에도 불구하고,이 분석의 성공적인 완료에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 아래에서는 일반적인 iCLM 실험에서 바이러스 역가, 섬유 아세포, 품질 및 이미지 분석의 영향을 다룬다.
우리의 연구에서 우리는 EMP로이의 ecotropic - 레트로 바이러스는 E12.5의 MEFs에 재 프로그램입니다. 우리는 레트로 바이러스 역가가 직접 셀의 품질과 관련되는 차렸다. 높은 통로 번호 (> 35) 불량 배양 기술은 심각 레트로 바이러스 입자의 품질에 영향; 따라서, 유의해야 할 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 플랫 - E 세포는 VSV-G의 pseudotyped 바이러스를 생성하고, 따라서 초 원심 분리 또는 냉동 사이클 (24), (25)을 견딜 수 없습니다하지 않습니다. 세포의 수명을 보존하기 위해, 항생제 선택에 대한 재고를 유지하는 것이 필수적이다. 그러나, 바이러스 성 제조시 항생 물질이없는 배지에서 유지되어야한다. 우리의 경험에 의하면, 여기에 사용되는 형질 전환 시약은 세포에서 가장 높은 형질 전환 효율을 제공한다. 다른 형질 전환 방법은 생성되는 바이러스 역가를 비교 사용될 경우 26 필수적이다. 권장 제조업체가 있지만 수확바이러스 상층 액을 48 시간은 형질 전환 후, 우리는 일반적으로 높은 역가의 바이러스 최상의 상태로 준비와 관련된 독성을 피하면서이 24 시간 수확 라운드가 더 높은 프로그래밍 효율을 얻을 수 있음을 관찰했다. 여러 연구 상업적 바이러스 상등액 농축기 (27)의 가능성을 보여 주었다 불구 또한, 우리는 높은 처리량을 유지하기 위해 정규 프로토콜에서 이것들을 사용하지 않았다.
고역가 바이러스 칵테일뿐만 아니라, 섬유 아세포 품질 성공적인 프로그래밍 분석 28 매우 중요하다. 제대로 초과하는 경우, 갓 격리 MEFs에는 냉동 주식에 비해 자신의 더 높은 효율성으로 인해 이용해야한다. 그들은 29을 통합하기 위해 높은 증식 호스트 필요할 이것은 레트로 바이러스의 성질과 관련 될 수있다. 또한, MEF 파종 밀도가 중요한 역할을한다. 시드 밀도가 고용과 우리는 테이블을 포함했다우리의 실험에서 (표 2). 또한, MEFs에 계대를 크게하면 리 프로그래밍의 효율을 감소한다.
면역 세포 (ICC)는 근절 조직 및 하위 규격의 분석을위한 우리의 표준 기술이다. PM-GFP 기자 마우스의 도움으로, 우리는 세 가지 주요 심장 하위 유형 (AM, VM 및 PM)의 검출에 대한 항체 패널을 형성 할 수 있었다. 그러나, 항체 종 가용성 및 표준 공 초점 현미경 설정에 4 채널의 제한의 제약, 하위 유형 당이 된 커버는 세 가지 아형의 빈도를 정량화하기 위해 필요하다. 한 커버 슬립은 α-티닌 / GFP (Hcn4)에 대한 얼룩 것 / Myl2 및 α-티닌 / GFP 하나 (Hcn4) / Nppa. + sarcomeric 구조는 모든 케이블 모뎀들 (CMs)의 일반적인 특성 및 분석에서의 첫 번째 단계는 근절을 결정하는 부속 명세서 21 잠재적 필수인지 이전의 관찰에 기초세포. 그러나 인하여 주관적인 특성으로 근절 조직의 레벨을 설정하는 것은 아마도이 분석에서 가장 어려운 부분이고; 이것은 다수의 관찰자의 정량화를 평균 또는 플로우 (30)를 자동화하는 연산 셀 분할 소프트웨어 개발에 의해 제한 될 수있다. 참조 점으로 내생 세포를 사용하여, 우리는 잘 조직 근절의 +에 대한 임계 값을 발견 iCLMs (그림 3) 점수 것을 이용했다. 이러한 매개 변수를 감안할 때, 평균 실험은 20 상승 제공합니다 - 30 %의 α-티닌은 + 세포 만 1 % α-티닌됩니다 + / 근절 +를. 1 %의 근절 + 세포 ~ 30 % Nppa +, Myl2 +, 또는 Hcn4-GFP + 될 것입니다.
심근가 구조적으로 복잡한 것으로, 인구 기반 유전자 발현 (예를 들어 QRT-PCR)을 감안할 때 또는 분석은 복잡한 형태 채널을 캡처 할 수 없습니다 유동 세포 계측법iCLM의 재 프로그래밍 중에 발생하는 Anges의. 대조적으로, 패치 클램프 칼슘 과도 촬상 매우 엄격한 단일 세포 기능 분석이 있지만, 전문 기술 및 장비는 실험을 수행해야한다. 따라서, 설명 방법은 처리량이 크게 손상시키지 않고 iCLM의 재 프로그래밍의 주요 구조 및 기능 매개 변수를 연구하는 간단한 방법을 제공한다는 점에서 독특하다.
직접 프로그래밍에있는 많은 최근의 발전에도 불구하고, 많은 일을 더 구체적으로 심장 재 프로그래밍하고, 하위 사양을 조절하는 분자 메커니즘을 이해 할 일이다. 이러한 메커니즘은 임상 응용 프로그램에 대한 직접 프로그래밍을 번역하는 것이 특히 중요하게 될 것이다. 따라서,이 연구에서 우리는 직접 근절 개발, 하위 사양 및 iCLM 성숙 대한 기여도를 평가하기 위해 별도의 매개 변수를 변조 할 수있는 플랫폼을 설명합니다. Moreo버전이 시스템은 또한 작은 분자 또는 회생 심장의 다음 단계를위한 세포 외 매트릭스의 복잡한 검사를 허용 고 스루풋 포맷으로 작동하도록 개발 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
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