마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 유도 심근세포 아형을 생성하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 sarcomere assembly 및 subtype specification을 조절하는 데 필요한 단서와 같은 심장 재프로그래밍 중 아형 특이적 계통 변환에 관한 핵심적이고 근본적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기계화 연구를 수행하는 데 필요한 심장 하위 유형 사양에 대한 정량화된 효과를 제공하는 방법을 제공한다는 것입니다.

먼저 E기 12.5기 배아에서 마우스 배아 섬유아세포를 분리합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 액체 질소에 보관하십시오. 다음으로, plat-E 세포를 수확하여 6개의 웰 플레이트에 웰당 100만 개의 세포로 플레이트하여 세포가 24시간 내에 70-80% 포화도에 도달하도록 합니다.

세포를 형질주입 배지로 덮고 표준 배양 조건에서 배양합니다. 실험 당일에서 1을 뺀 날에, 15 밀리리터 원뿔형 폴리스티렌 튜브를 취하여 60 마이크로리터의 환원된 혈청 배지와 반응당 6 마이크로리터의 형질 주입 시약을 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다.

transfection 시약을 사용하기 때문에 transfection 효율의 감소를 방지하기 위해 감소된 혈청 배지에 시약을 직접 첨가하십시오. 다음으로, 반응당 총 2마이크로그램의 GHMT 칵테일을 추가하고 튜브를 가볍게 두드려 섞습니다. 실온에서 15분 동안 반응을 배양한 다음 혼합물을 적하 방식으로 plat-E 세포에 첨가합니다.

형질주입 날짜와 시간을 기록합니다. 형질주입된 plat-E 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 마우스 배아 섬유아세포를 도금하기 1시간 전에 먼저 각 웰에 12mm 피브로넥틴 코팅된 커버 슬립을 추가하여 면역 세포화학을 위한 24웰 플레이트를 준비합니다.

다음으로, 각 웰에 300마이크로리터의 소 콜라겐 용액을 추가하고 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 배양이 거의 끝날 무렵, HCN4GFP 쥐 배아 섬유아세포의 냉동 바이알을 해동합니다. 세포를 빠르게 해동하고 예열 된 섬유 아세포 매체로 한 번 씻고 살아있는 세포의 농도를 계산합니다.

다음 24의 좋은 판에 있는 코팅 해결책을 흡인하고 즉각 교원질과 fibronectin에 의하여 입힌 덮개 미끄러짐에 우물 당 30, 000의 세포를 도금하십시오.transfection 후에 24 시간은, 0.45 미크론 숨구멍 크기 surfectant 자유로운 셀룰로오스 아세테이트 여과기를 통해서 retro 바이러스 매체를 거르고, 15 밀리리터 원뿔 관으로 옮깁니다. 그런 다음 폴리브레렌을 밀리리터당 8마이크로그램의 최종 농도로 첨가합니다.

plat-E 세포에 2ml의 새로운 transfection 배지를 조심스럽게 보충합니다. 배지를 너무 빨리 변경하면 세포가 분리될 수 있습니다. 적절하게 유지된 plat-E 세포는 밀리리터당 평균 1,000만 단위의 감염 단위를 생성합니다.

세포의 95% 이상에서 높은 GFP 발현 및 강도는 일반적으로 유도된 심근세포 유사 근세포의 성공적인 GHNT 매개 생성과 관련이 있습니다. 다음으로, 배양된 배아 섬유아세포의 배지를 흡인하고 새로 수집된 레트로바이러스 배지를 추가합니다. 그런 다음 필로폰 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 밤새 배양합니다.

다음 날, 다시 plat-E 세포에서 배아 섬유아세포로 배지를 옮깁니다. 두 번째 바이러스 수집 후 plat-E 세포를 폐기합니다. 유도 후 48시간 후에 세포 상태 매체를 흡인하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다.

그런 다음 24웰 플레이트의 웰당 500마이크로리터의 예열된 유도 심장 근세포 유사 근세포 배지를 추가합니다. 다음 12일 동안 2-3일마다 미디어를 교체하십시오. 유도 후 14일이 지나면 매체를 조심스럽게 흡인하고 300마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 각 웰을 헹굽니다.

그런 다음 PBS를 제거하고 웰당 250마이크로리터의 4% 파라포름알데히드 용액을 첨가하고 실온에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, 300마이크로리터의 0.1%tritonex 100 및 PBS로 웰을 5분 동안 세 번 세척하여 세포를 투과화합니다. 마지막 세척 후 과잉 투과성 용액을 흡입한 다음 웰당 300마이크로리터의 범용 차단 버퍼를 추가합니다.

실온에서 10분 동안 차단합니다. 한 쌍의 슬라이드를 마우스 항알파 악테닌, 닭 항 GFP 및 토끼 항 NPPA 항체로 밤새 염색하여 유도된 심방 유사 근세포에서 유도된 심박 조율기 유사 근세포를 식별합니다. 다음 날, 웰을 세척하고 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 적절한 2차 항체를 추가합니다.

추가 세척 후 2.4마이크로리터의 장착 매체를 유리 현미경 슬라이드에 추가합니다. 24웰 플레이트에서 커버 슬립을 취하고 여분의 용액을 제거합니다. 그런 다음 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드로 옮깁니다.

각 슬라이드에 대해 한쪽 가장자리에서 시작하여 적색 형광 채널에서 위아래로 스캔을 시작하여 알파-악티닌 양성 육종 양성 세포를 식별합니다. Sarcomere 줄무늬는 555 나노미터 파장에서 가장 쉽게 식별할 수 있습니다. 식별되면 녹색 채널로 전환하고 세포가 양수인지 기록해 둡니다.

그런 다음 컴퓨터로 전환하여 원적선 647나노미터 파장을 평가하여 NPPA 또는 MYL2 염색을 찾습니다. 알파-악티닌 양성, 사르코메르 양성, Hnc4-GFP 음성 및 Nppa 양성 세포는 유도 심방 유사 근세포입니다. Nppa 염색은 paranuclear 및 punctate로 나타납니다.

먼저, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시딩 후 24시간이 지난 세포의 수를 계산합니다. 다음으로, 커버 슬립의 각 세포를 육안으로 검사하여 적절한 알파-악티닌 및 사크로메르 염색을 확인하고 두 마커에 대해 양성으로 염색된 세포의 수를 기록합니다. 그런 다음 플레이팅된 실제 총 셀로 나눕니다.

평균적인 재프로그래밍 실험은 알파-악티닌과 사코메르 양성인 세포의 약 1%를 산출합니다. 14일째까지 실험을 중단하고 육종 조직을 평가할 수 있습니다. 이는 여기에 빨간색으로 표시된 양성 알파-악티닌 염색으로 식별됩니다.

sarcomere 조직을 보이는 세포만이 자발적인 박동을 할 수 있으므로 이것은 좋은 첫 번째 검사입니다. 여기에 표시된 것은 Hcn4-GFP 리포터 마우스에서 유도된 심박 조율기와 같은 심근세포입니다. 이 견해에서 3개의 세포는 sarcomere 조직을 나타냅니다.

Hcn4-GFP에 대해 양성인 3개의 세포 클러스터가 이미지 중앙에 존재하며 심박 조율기 세포 유형으로 식별될 수 있습니다. Once 왼쪽 하단의 세포는 알파-액티닌 염색으로 관찰될 수 있지만 육종 조직이나 식별 가능한 아형 마커는 없습니다. 이 유도된 심실과 같은 심실 세포 집단에서 중심 세포는 육종 조직을 나타내며, 이 세포는 또한 심실 심혈 세포의 마커인 미오신 경쇄 마커 MYL-2에 대해 양성으로 염색됩니다.

마스터링이 완료되면 plat-E 세포의 도금 및 형질 주입을 1시간 내에 수행할 수 있습니다. 1-2시간 내에 마우스 배아 섬유아세포를 유도하고 약 8시간 내에 전체 24웰 플레이트를 myto 정량화합니다. 이 절차를 시도하는 동안 건강한 마우스 배아 섬유아세포와 고역가 바이러스가 성공적인 재프로그래밍 실험의 핵심이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 개별 유도 심근세포 아형을 생성하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.