É descrito um procedimento para preparar preparações en face da artéria carótida e da aorta do rato. Tais preparações, quando imunofluorescentemente coradas com anticorpos específicos, permitem estudar a localização de proteínas e a identificação de tipos de células dentro de toda a parede vascular por microscopia confocal.
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Artigo de método
En Face Preparação de Vasos Sanguíneos de Rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
As secções de tecidos embebidos em parafina são rotineiramente utilizadas para estudar histologia de tecido e histopatologia. No entanto, é difícil determinar qual é a morfologia tridimensional do tecido a partir dessas seções. Além disso, as secções dos tecidos examinados podem não conter a região dentro do tecido que é necessária para a finalidade do estudo em curso. Esta última limitação dificulta estudos histopatológicos de vasos sanguíneos uma vez que as lesões vasculares se desenvolvem de forma focalizada. Isto requer um método que nos permita examinar uma vasta área da parede dos vasos sanguíneos, desde a sua superfície até regiões mais profundas. Uma montagem completa en face preparação dos vasos sanguíneos cumpre este requisito. Neste artigo, vamos demonstrar como fazer preparações en face da aorta do rato e da artéria carótida e imunofluorescentemente mancha-los para microscopia confocal e outros tipos de imagem baseada em fluorescência.
Introdução
Para estudos histopatológicos por microscopia óptica, tridimensional partes de tecidos biológicos são rotineiramente processados para parafina embedment seguido de seccionamento e coloração. Uma amostra de tecido que foi embebida em parafina pode ter vários milímetros em todas as três dimensões. No entanto, para a finalidade da microscopia de luz, deve ser primeiro seccionado de modo que a luz possa atravessar e manchada então de modo que a seção fina rendesse o suficiente contraste para a imagem latente. Porque os espécimes seccionados são geralmente 5-10 μm na espessura, um vê somente uma fração muito pequena do espécime inteiro em duas dimensões de cada vez. É p....
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Protocolo
Os protocolos para a ligadura da artéria carótida parcial do mouse e o isolamento da aorta do rato e da artéria carótida para a imunocoloração de face são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IBT 2014-9231).
1. Ligação da Artéria Carótida Parcial Esquerda
- Prepare o espaço cirúrgico, colocando uma almofada de aquecimento de 12 polegadas x 14 polegadas sobre a mesa e cobrir a almofada e tampo da mesa com um grande drapeado cirúrgico limpo. Ajuste o braço do suporte da barra para que o campo de visão do estereomicroscópio esteja na área central da almofada de aquecimento.
- Ligue a almo....
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Resultados
Uma imagem de imunofluorescência em face típica do endotélio é mostrada na Figura 3 . Esta imagem mostra uma única secção óptica de uma aorta do rato tomada perto da abertura de uma artéria intercostal (a grande área escura em forma de ovo). A aorta foi duplamente corada com anti-VE-caderina (verde) e anti-VCAM-1 (molécula de adesão celular vascular-1) (vermelho). Cada célula endotelial é delineada com uma coloração linear verde na junção dos aderentes. Devido a pequenas.......
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Discussão
Ao manusear os vasos sanguíneos do rato, é importante lembrar que o endotélio é frágil e que qualquer força mecânica excessiva danificará as células endoteliais. Por exemplo, as células endoteliais quebram ou se desprendem da parede do vaso se o vaso é perfundido com muita força, o que pode acontecer facilmente quando a vasculatura é perfundida usando uma seringa operada manualmente.
Para obter uma pressão de perfusão constante, utilizamos um sistema de perfusão por gravidade com uma pressão.......
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Agradecimentos
As atividades de pesquisa dos autores são suportadas por concessões do instituto nacional da saúde ao Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de injeção de cloreto de sódio a 0,9% USP saco de 500 mL | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| placas de 12 poços | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 sutura de vicryl revestida | Ethicon | J833G | |
| AF488 cabra anti-rato IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 anti-coelho para cabras IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Coelho policlonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Sistema de Fluxo Aoto | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Autoclave Wrap. 24 polegadas x 24 polegadas | Cardinal Health | 4024 | |
| Afastadores Blunt, 2,5 mm de largura | Ferramentas de Ciência Fina | 18200-10 | |
| Caprofeno (Rimadyl) | Zoetis | NADA#141-199 | |
| Esfoliante de Clorexidina, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Curity esponjas de gaze 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Almofada de aquecimento elétrico, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Pinça Graefe Extra Fina | Ferramentas de Ciência | Fina 11152-10 | |
| Tesoura | de ÍrisFerramentas de Fine Science | 14090-11 | |
| Micro vidro de cobertura 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Lâminas de microscópio | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| soro de cabra normal | Equitech-Bio | GS05 | |
| Solução de Paraformaldeído 4% em PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Placas de Petri 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Antifade mountant com DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Cotonetes de cortton puritano | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini aplicadores com ponta de algodão | VWR | 82004-050 | |
| Porta-agulha com cabo redondo | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sutura de seda 6/0 | Fine Science Ferramentas | 18020-60 | |
| Tesoura de mola | ROBOZ | RS-5601 | |
| Tesoura de estrabismo | Ferramentas de ciências finas | 14075-09 | |
| Pinça Super Grip | de ciências finas | 00649-11 | |
| Curativo transparente | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
Referências
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg....
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Reimpressões e permissões
