En Face Preparação de Vasos Sanguíneos de Rato

Para estudos histopatológicos por microscopia óptica, tridimensional partes de tecidos biológicos são rotineiramente processados ​​para parafina embedment seguido de seccionamento e coloração. Uma amostra de tecido que foi embebida em parafina pode ter vários milímetros em todas as três dimensões. No entanto, para a finalidade da microscopia de luz, deve ser primeiro seccionado de modo que a luz possa atravessar e manchada então de modo que a seção fina rendesse o suficiente contraste para a imagem latente. Porque os espécimes seccionados são geralmente 5-10 μm na espessura, um vê somente uma fração muito pequena do espécime inteiro em duas dimensões de cada vez. É possível coletar seções seqüenciais e, após a imagem de cada seção individualmente, realizar reconstrução assistida por computador das imagens 3D, mas este é um trabalho tedioso. Histopatologia dos vasos sanguíneos, especialmente para o estudo da patogênese da aterosclerose, apresenta problemas únicos. A aterosclerose é uma doença focalizada que desenvolveLocalmente em áreas onde ocorre o fluxo sanguíneo perturbado. Além disso, a doença é iniciada dentro da íntima, um tecido fino constituído por uma monocamada de células endoteliais e matriz extracelular, de grandes artérias. Por estas razões, é um desafio para localizar e estudar lesões precoces usando vasos sanguíneos seccionados, porque pode-se facilmente deixar de seccionar a lesão. Mesmo se uma secção incluir uma área doente, ver-se-á apenas uma porção de 5-10 μm contendo células endoteliais e outras células da parede vascular nos meios e adventitia.

Preparações completas de montagem em face (pronunciadas än fäs) nos permitem examinar uma vasta área da superfície do vaso sanguíneo, como a aorta inteira da raiz da aorta, até as artérias ilíacas comuns. Utilizando um tal espécime corado com anticorpos específicos e outras sondas específicas, pode-se identificar a localização das lesões e também onde ocorrem vários eventos moleculares em células endoteliais em conjunção comA aterogénese, tais como alterações na expressão, localização e modificações pós-traducionais de proteínas. Além de estudar a aterogênese, a forma de célula endotelial observada em preparações faciais é usada como um indicador do padrão regional de fluxo sanguíneo em tempo médio. Tais dados são importantes para o estudo da cicatrização mecânica de células endoteliais in situ. Para esta finalidade, os vasos sanguíneos histológicos transversais de corte não são úteis. Assim, para medicina vascular e biologia, é especialmente importante adquirir uma técnica para fazer preparações en face de vasos sanguíneos que permite observar uma vasta área da superfície do vaso, bem como as áreas mais profundas subsuperfície do vaso.

Conforme revisto por Jelev e Surchev ¹ , os biólogos vasculares desenvolveram vários métodos para observar o revestimento dos vasos sanguíneos em face. Alguns métodos engenhosos foram desenvolvidos nos anos 1940 e 1950. Usando esses métodos, eles foram Capaz de estudar a organização fundamental das células endoteliais que revestem a superfície interna dos vasos sanguíneos. No entanto, devido ao modo como estas preparações em face são preparadas (o chamado método de Hautchen ^{2 , 3 , 4} ou descascamento da superfície do recipiente ⁵ ) e a forma como o espécime foi corado, nem sempre foi possível obter uma morfologia morfológica ininterrupta Informações da superfície do vaso para as áreas mais profundas da parede dos vasos sanguíneos. A preparação de vasos en-face de montagem completa combinada com a coloração por imunofluorescência permitiu não apenas estudar a morfologia das células endoteliais ea expressão e localização das proteínas nessas células, mas também estender esses estudos à região subendotelial da parede do vaso. Os primeiros estudos usando vasos sanguíneos en face preparações imunoflurescently manchadas começaram a aparecer na década de 1980 ^{6 ,}7. Com o advento da microscopia confocal de varrimento a laser e, mais recentemente, a microscopia multifotónica, pode-se agora obter imagens nítidas claras da estrutura da parede dos vasos sanguíneos em amostras de vasos en face imunofluorescentemente corados bem como a rede vascular em animais vivos ^{8 , 9 , 10 , 11.} Estas técnicas de imagem baseadas em computador criam imagens seccionadas ópticas em foco e, empilhando-as, podem obter-se imagens 3D reconstruídas da parede vascular e da rede vascular nos tecidos. Pode gerar imagens de uma secção feita ao longo do eixo Z da imagem reconstruída ^{12 , 13} .

Neste artigo, iremos ilustrar um método para preparar preparações en face da aorta do rato e da artéria carótida para a coloração imunof luorescente. En face preparaçõesPode ser feita mesmo depois destes vasos terem sido experimentalmente manipulados. Por exemplo, uma artéria carótida pode ser ligada parcialmente e depois uma preparação en face preparada após tal cirurgia. Por esta razão, também descreveremos neste artigo como realizamos uma ligadura parcial na artéria carótida. Comparados com preparações semelhantes de animais maiores tais como ratos, coelhos e seres humanos, os vasos de ratinho são de pequeno tamanho e mais frágeis, necessitando assim de cuidados adicionais durante o isolamento cirúrgico dos vasos e preparando-os para a coloração de anticorpos e a microscopia. Como o modelo animal mais comumente usado para a modificação genética é o mouse, torna-se crítico para muitos pesquisadores lidar com vasos de mouse sem danificá-los. Neste manuscrito, vamos descrever como lidar com os vasos sanguíneos do rato quando se fazem preparações en face da aorta do rato e da artéria carótida. Para efeitos de demonstração, utilizaremos ratinhos C57 / b6 de tipo selvagem.

Os protocolos para a ligadura da artéria carótida parcial do mouse e o isolamento da aorta do rato e da artéria carótida para a imunocoloração de face são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IBT 2014-9231).

1. Ligação da Artéria Carótida Parcial Esquerda

1. Prepare o espaço cirúrgico, colocando uma almofada de aquecimento de 12 polegadas x 14 polegadas sobre a mesa e cobrir a almofada e tampo da mesa com um grande drapeado cirúrgico limpo. Ajuste o braço do suporte da barra para que o campo de visão do estereomicroscópio esteja na área central da almofada de aquecimento.
2. Ligue a almofada de aquecimento na mesa e coloque o botão de controlo de 3 posições no nível de calor médio. Neste ajuste de temperatura, a superfície da placa cirúrgica (ver 1.6.1) será de 38-40 ° C.
   1. Coloque uma gaiola limpa em outra almofada de aquecimento. Gire a almofada de aquecimento como acima. Esta gaiola será utilizada para a recuperação após a cirurgia (ver 1.16), bem como para a habitação.
   Na mesa cirúrgica, coloque uma bolsa de esterilização autoclavada contendo tesoura de íris (1 par), pinça de tecido (1 par), pinça de aperto super (2 pares), tesoura de mola (1 par), retractor sem corte (1 par, (1), sutura de seda 6-0 esterilizada, aplicadores com ponta de algodão, mini aplicadores com ponta de algodão, cortinas cirúrgicas e esponjas de gaze de 2 "x 2". Coloque também um frasco de compressão contendo 70% de etanol e outro contendo clorhexidina cirúrgica na mesa cirúrgica.
3. Pesar um mouse. O peso corporal é necessário para determinar a quantidade adequada de analgesia, que será administrada imediatamente antes da cirurgia.
4. Coloque um mouse na câmara de indução.
5. Ligue o tanque de oxigênio eo vaporizador anestésico para anestesiar o mouse na câmara de indução. Manter o nível de isoflurano a 2%. Demora 3-5 minutos antes que o mouse parar de se mover.
   1. Enquanto o mouse está sendo anestheColoque um pedaço menor de tecido cirúrgico estéril (24 polegadas x 24 polegadas) sob o microscópio estereoscópico para criar uma superfície cirúrgica. Em seguida, coloque uma placa cirúrgica acrílica (que foi limpo com álcool 70%) na superfície drapejada. A placa cirúrgica deve, portanto, estar na almofada de aquecimento, mas separada por duas camadas de cortinas cirúrgicas.
6. Quando o mouse pára de se mover na câmara de indução, transfira o mouse para uma área de preparação pré-cirúrgica e posicione seu nariz no cone nariz conectado ao vaporizador (isoflurano a 2%). Remova o cabelo em torno da área cervical usando um aparador elétrico ou loção removedor de cabelo. Recomendamos loção remoção de pêlos, porque este método não vai produzir pedaços de cabelo solto, que são difíceis de remover completamente da área cirúrgica.
7. Com o nariz-cone no lugar, mova o mouse para a placa cirúrgica.
   1. Tape para baixo as patas dianteiras direita e esquerda para a placa cirúrgica. Tape para baixo ambas as pernas traseiras togeNo lado direito do mouse. Isto provoca uma ligeira rotação do corpo do rato de tal modo que o lado esquerdo da área do pescoço do rato fica melhor posicionado para a cirurgia.
8. Desinfectar a área da incisão com 70% de álcool, clorexidina esfrega cirúrgica, e novamente com 70% de álcool. Cubra o mouse com um pano cirúrgico esterilizado, exceto para a área da incisão cervical.
9. Confirme com uma pitada de dedo que o ratinho está completamente anestesiado e administre analgesia (Caprofen 3-5 mg / kg) via injecção intraperitoneal ou subcutânea.
10. Sob o microscópio dissecante, faça uma incisão ventral da linha média ao redor da área cervical usando um scalpel ou tesoura de íris.
    NOTA: Usamos tesoura porque a distância de trabalho do estereomicroscópio é limitada, o que torna difícil usar um bisturi.
11. Expor a artéria carótida comum esquerda (LCCA), empurrando para o lado e reposicionando as glândulas salivares que cobrem os vasos sanguíneos para o lado esquerdo da aNimal.
12. Identificar todos os vasos sanguíneos no campo cirúrgico ( Figura 1 ). A LCCA bifurca na artéria carótida interna esquerda (ICA) e na artéria carótida externa esquerda (ECA). A artéria tireoidiana superficial (STA) surge da ECA no lado medial. A artéria occipital (OA) costuma surgir da ECA, mas em alguns ratos ela surge da ICA.
13. Ligatar todos os ramos da artéria, exceto o OA usando sutura de seda esterilizada 6-0. Para conseguir isto, faça as duas ligações seguintes.
    1. Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo ao redor e abaixo da artéria carótida interna esquerda (ICA). Pegue um pedaço de sutura de sutura pré-cortada 6-0 (~ 2,5 cm) com fórceps e passe-o sob a artéria. Usando outro par de pinças, puxe a sutura cerca de 1/3 do seu comprimento e ligue a artéria.
    2. Remova o tecido conjuntivo em torno da artéria carótida externa esquerda (ECA) da mesma maneira descrita acima e faça uma ligadura proximal ao tiróide superior esquerdoD (STA) ( Figura 1 ). Tenha cuidado para não danificar as fibras nervosas que correm dentro do campo cirúrgico.
14. Quando estas ligaduras foram feitas, retornar as glândulas salivares para a posição original e hidratar o campo cirúrgico, colocando 2-3 gotas de solução salina estéril. Feche a pele usando suturas Vicryl revestidas com 6-0.
15. Após a cirurgia, coloque o mouse na gaiola pré-aquecida (ver 1.2.1). O rato deve acordar dentro de 5 min e começar a andar ao redor. Uma vez confirmado que o mouse se comporta normalmente, leve a gaiola para a sala de alojamento dos animais.
16. Observe o mouse diariamente durante os primeiros 3 dias de recuperação. O rato pode ser mantido, desde que a experiência exija sob as várias condições que o protocolo experimental requer. As preparações faciais podem ser feitas a qualquer momento após a cirurgia.

2. En Face Immunostaining

1. Eutanizar um rato com CO ₂ por overdose por inalação.
2. Tape o mouse em uma posição supina (lado do ventre para cima) em uma placa de dissecação.
3. Exponha a cavidade abdominal fazendo uma incisão na linha média usando uma tesoura de íris.
4. Expor a cavidade torácica cortando as costelas lateralmente ao esterno.
5. Fazer um entalhe na veia cava ou cortar uma das artérias femorais para drenar o sangue.
6. Inserir uma agulha de 26 G ligada a uma instalação de perfusão por gravidade (120 cm de pressão de água) no ápice do ventrículo esquerdo e perfundir o sistema circulatório com solução salina contendo heparina (40 U / mL). Continue a perfusão até que a solução salina que flui para fora do corte torna-se clara.
7. Mudar o sistema de perfusão de soro fisiológico para a solução de fixação contendo paraformaldeído a 4% em PBS (solução salina tamponada com fosfato) e continuar a perfusão durante mais 5 min.
8. Colher a aorta e ambas as artérias carótidas esquerda e direita usando tesoura de ponta romba e fórceps, e colocar em um tubo cônico de 50 mL contendo o fixador em gelo.
Figura 2 ).
9. Transferir cada recipiente separadamente para um poço de uma placa de 12 poços contendo 0,5 mL de uma solução permeabilizante (Triton X-100 a 0,1% em PBS) por poço. Permeabilize vasos sanguíneos durante 10 min com oscilação à temperatura ambiente (RT).
10. Lavar brevemente com PBS.
11. Para bloquear locais de ligação de anticorpos não específicos, incubar os vasos sanguíneos em soro normal a 10% da espécie animal na qual os anticorpos secundários foram feitos, em TTBS (solução salina tamponada com Tris (TBS) com Tween 20 a 2,5%) durante 30 min com Balançando na RT.
12. Incubar os vasos com os anticorpos primários adequadamente diluídos em TTBS com 10% de soro normal (como descrito acima) durante a noite com oscilação a 4 ° C. O nívelDe diluição deve ser determinada para cada anticorpo.
13. Execute a seguinte coloração de controlo.
    1. Incubar vasos com TTBS em vez de um anticorpo primário seguido por incubação com um anticorpo secundário.
    2. Incubar vasos com TTBS contendo soro não imune (ou pré-imune) ou Ig do mesmo animal (espécie) em que foram feitos anticorpos primários, seguido de incubação com um anticorpo secundário.
    3. Omitir a incubação com um anticorpo secundário. Estas amostras de controlo devem ser manuseadas da mesma maneira e ao mesmo tempo em que é realizada a coloração com anticorpos específicos.
14. Lavar os vasos sanguíneos 3 vezes com TTBS durante 10 min cada com oscilação à RT.
15. Incubar com anticorpos secundários marcados fluorescentemente diluídos apropriadamente em TTBS com 10% de soro normal (como descrito acima) durante 1 h com oscilação à RT. A coloração nuclear com DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindole) pode ser realizada simultaneamente aT nesta fase adicionando 1/5000 em volume de uma solução stock DAPI que contém 5 mg / mL de DAPI em H2O.
16. Lavar 3 vezes com TTBS durante 10 min cada com oscilação à RT.
17. Enxaguar brevemente em PBS.
18. Coloque uma gota do reagente anti-fade em uma tampa de vidro (22 mm x 50 mm) e coloque um vaso sanguíneo sobre a tampa de vidro com o endotélio virado para baixo.
19. Coloque um vidro de slide (22 mm x 75 mm) no vaso sanguíneo, evitando bolhas de captura.
20. Coloque a lâmina em um limpador de laboratório limpo ( por exemplo, Kimwipe) e cubra a lâmina com dois pedaços de esfregão de laboratório. Coloque suavemente 3.5 kg de peso ( por exemplo, use uma garrafa de água em um livro grosso.) No slide por um máximo de 5 min para aplainar a amostra de vasos sangüíneos en face.
21. Remova o peso e limpe o excesso de solução em torno da lamela.
22. Aplique esmalte nas 4 esquinas da lamela, coloque as lâminas em uma caixa de slide, lado da lamela para cima e mantenha no escuro em RT(Ou 4 ° C) durante a noite. Este processo aplana o tecido ainda mais e torna mais fácil fazer a microscopia em altas ampliações.
23. Seal o coverslip completamente usando unha polonês.
24. Realize a microscopia assim que o esmalte estiver seco.
25. Se necessário, armazene as lâminas a -20 ° C.

Uma imagem de imunofluorescência em face típica do endotélio é mostrada na Figura 3 . Esta imagem mostra uma única secção óptica de uma aorta do rato tomada perto da abertura de uma artéria intercostal (a grande área escura em forma de ovo). A aorta foi duplamente corada com anti-VE-caderina (verde) e anti-VCAM-1 (molécula de adesão celular vascular-1) (vermelho). Cada célula endotelial é delineada com uma coloração linear verde na junção dos aderentes. Devido a pequenas irregularidades da amostra, algumas junções aderentes estão fora desta secção óptica. A coloração com Anti-VCAM-1 é mais forte na abertura da artéria intercostal, onde se sabe que o fluxo sanguíneo perturbado ocorre. A Figura 4 mostra a coloração da face das artérias carótidas com anti-VE-caderina (verde), anti-VCAM-1 (vermelho) e DAPI (púrpura). A artéria carótida esquerda (LCA) foi parcialmente ligada enquanto a artéria carótida direita (RCA) não foi tocada. Os espécimes dos vasos foram feitos um dia após o Cirurgia e manchado. Observa-se aumento da coloração anti-VCAM-1 no vaso ligado. Os espécimes corados imunofluorescentemente com vários anticorpos podem ser utilizados para investigar o nível de expressão de proteínas de interesse, a extensão das modificações pós-traducionais de proteínas alvo e, claro, o padrão de localização de várias proteínas dentro de células endoteliais assim como em outras células dentro da Parede 10 , 11 do vaso sanguíneo.

Figura 1 : Anatomia detalhada do vaso na área cervical do rato. A rede vascular antes e depois da dissecção é mostrada à esquerda. Todas as artérias são identificadas no diagrama mostrado à direita. Linhas pretas indicam ligaduras. Escala: 1 divisão = 1 mm._blank "> Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Diagrama mostrando como as artérias carótidas e a aorta são feitas em preparações faciais. Linhas pontilhadas ao longo da parede do vaso indicam cortes a serem feitos para abrir os vasos. As micrografias coloridas mostram preparações reais de face. Escala: 1 divisão = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Uma imagem frontal do endotélio corado com anti-VE-caderina (verde) e anti-VCAM-1 (vermelho). Uma única secção óptica confocal de células endoteliais perto de uma abertura intercostal émostrando. Note-se que a expressão de VCAM-1 é aumentada em células endoteliais localizadas no ponto de ramificação do vaso onde o fluxo sanguíneo não é laminar. A imagem foi gravada usando uma lente objetiva 60X (NA 1.4, óleo). Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens En Face das Artérias Carótidas Esquerda e Direita Coloridas com Anti-VE-caderina (Verde), Anti-VCAM-1 (Vermelho) e DAPI (Roxo). A artéria carótida esquerda foi ligada parcialmente e a carótida direita foi deixada intacta. Estas preparações en face foram feitas 24 h após a cirurgia. É evidente a expressão aumentada de VCAM-1 no lado ligado em comparação com o recipiente intacto. Essas imagens foram coletadas perto da bifurcação de artérias carótidasUsando um microscópio confocal de varredura a laser com uma lente objetiva 60X (NA 1.4, óleo). Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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