Summary
Metabolic kompetens in vitro-system är en viktig förutsättning för biotransformeringen och disposition av droger och gifter. I detta protokoll beskriver vi tillämpningen av referens metaboliska sönder för att bedöma fas I metabolism i cellodlingar.
Abstract
Xenobiotiska metaboliserande enzymer spelar en nyckelfunktion i biotransformeringen av läkemedel och gifter genom att lägga till funktionella grupper som ökar löslighet och underlättar utsöndring. Vid vissa tillfällen de strukturella förändringar leder till bildandet av nya giftiga produkter. I syfte att minska djurförsök, kan kemisk risk bedömas med användning av metaboliskt kompetenta celler. Expressionen av metaboliska enzymer är emellertid inte stabil över tid i många i primär kultur vitro-system och är ofta partiell eller frånvarande i cellinjer. Därför bör studier av läkemedel, tillsatser, och miljöföroreningar metabolism in vitro idealt utföras i cellsystem där metabolisk aktivitet har karakteriserats. Vi förklarar här en metod för att mäta aktiviteten av en klass av metabola enzymer (Human fas I) i 2D cellinjer och primära 3D kulturer med hjälp av kemiska prober och deras metaboliska produkter mätbara av UPLC masspektrometri ochluminometri. Metoden kan genomföras för att testa den metaboliska aktiviteten i cellinjer och primära celler härledda från en mängd olika vävnader.
Introduction
Xenobiotisk metabolism är den process genom vilken kemikalier som är främmande för kroppen modifieras genom tillsats av hydrofila grupper och konjugat för att underlätta deras utsöndring 1. Typiskt metabolismen av xenobiotika är en två-stegsprocess med fas I består mestadels av en oxidation med tillsats av en eller flera hydroxylgrupper 1, 2. I fas II, är hydroxylgrupperna används som acceptorer för en hydrofil konjugat såsom glukuronid eller ett sulfatgrupp 1, 2. Om en acceptor grupp redan finns på molekylerna, kan konjugeringssteget hända oberoende av fas I-metabolism. Varje reaktion utförs av en specifik grupp av enzymer, t ex CYP (cytokrom P450-er), som katalyserar hydroxylering (Figur 1) och dealkylering av kemiska substrat 3. Conjugation katalyseras av sulfotransferaser, UDP-glukuronosyltransferaser (figur 1), glutation-S-transferaser och N-acetyltransferaser 4. Varje vävnad och organ kommer att ha en viss metabolisk enzymuttrycksprofil, med levern uttrycker de flesta av dessa proteiner.
Figur 1: Exempel på fas I och fas II Metabolism för Kumarin. CYP2A6 / CYP2A13 katalysera 7-hydroxylering av kumarin. 7-hydroxikumarin är konjugerad till ett glukuronidenheten genom fas II enzymer UGT, med UGT1A6 och UGT1A9 som visar den högsta aktiviteten.
Förstå metabolism av xenobiotika är kritisk i utvärderingen av läkemedelssäkerhet och för riskbedömning kemikalier av två skäl: reaktionskinetiken kommer att avgöra hur länge ett läkemedel eller kemisk blir kvar i kroppen i en aktiv eller inaktiv form Böre utsöndring; och moderföreningen kan modifieras till en mer reaktiv, instabil och toxiska species av metaboliska enzymer. Sådana reaktioner även känd som "bioaktivering" är mestadels drivna av fas I CYP-enzymer utan även på mer sällsynta tillfällen av fas II konjugering 5.
Baserat på detta, är förmågan hos en in vitro-modell för att exakt förutsäga den risk som är förknippad med ett läkemedel eller en kemikalie som är mycket beroende av den metaboliska kompetensen hos cellsystemet. Cellinjer härledda från sjuka vävnader eller från transformation av normala celler förlorar ofta en del om inte alla av den metaboliska enzymprofil representativ för deras ursprungsvävnad 6. Bibehållande av den normala metaboliska enzymprofil visas bättre i primära cellkulturer (åtminstone i korttidskulturer) och förbättras ytterligare om vävnaden odlas i en matris så att den kan bibehålla sin 3D-struktur 1. Därför, det förkolnadeacterization av den metaboliska kompetensen i ett in vitro-cellsystem är ett viktigt preliminärt steg för att vägleda beslutet om vilken cell modell är lämpligt att göra kemiska säkerhetsutvärderingar.
I detta dokument presenterar vi ett protokoll för att profilera aktivitet och uttryck av fas I CYP-enzymer in vitro med exempel på deras tillämpning med en hepatisk cellinje 7 och 3D primära lungcellkulturer 8. CYP specifika substrat, deras metaboliska produkter och inhibitor kontroller beskrivs tillsammans med mass spectrometry- och luminogena baserade kvantifieringsmetoder. Eftersom vissa CYP är inducerbara och andra är konstitutiva kommer exempel också ges för dessa två scenarier.
Protocol
OBS: Det allmänna arbetsflödet för den metaboliska aktivitetsanalysen skisseras i figur 2. Varje steg i arbetsflödet därefter beskrivs i de kommande avsnitten. Detaljerade tabeller av reagens och utrustning ges i Tabell of Materials.
Figur 2: Workflow för Metabolic Probe Assay. Cellerna sås och odlas till adekvat densitet. En CYP induktionssteget kan krävas beroende på enzymaktivitet analyseras. Sonden substrat och inhibitor tillsätts till cellodlingen. Efter en inkubationstid, mediet samlas upp för analys och cellerna lyseras för protein kvantifiering. Mediet behandlas för analys av den metaboliska produkten av sonden substratet genom masspektrometri eller luminometri.ad / 55502 / 55502fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Cellodling
Figur 3: Ljus Transmission Micrography av en lever cellinje Culture. Cellinjen beskrivs i detta protokoll 5 differentiera typiskt med en delad 50% mellan cholangiocytes och hepatocyter i kultur (100x). Scale bar = 100 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Hepatisk cellinje kultur
OBS: Ett kommersiellt tillgängligt lever cellinjen användes som ett exempel på metaboliskt kompetenta celler. Cellinjen härleddes från en hepatokarcinom orsakad av virusinfektion 7. Vid konfluens, differentierar denna cellinje in i cholangiocyte- och hepatocyt-liknande celler (Figur 3), och ytterligare detaljer kan hittas i Guillouzo 7. Inkluderandet av 2% DMSO till odlingsmediet stödjer differentiering av denna cellinje och uttryck av en mängd olika CYP.- Avlägsna de kryogena flaskor med celler från flytande kväve och placera på torris under transport. Överföra köldkärlet till ett vattenbad förvärmas till 37 ° C under 1-2 min, och sterilisera utsidan av flaskan med 70% etanol innan de placeras i en huv med laminärt flöde.
- Samtidigt som arbetar under sterila betingelser, öppna försiktigt kryogen flaskan för att frisätta eventuellt övertryck och pipettera innehållet i den kryogena flaskan in i ett 10 ml rör fyllt med 9 ml förvärmda Williams E-medium vid 37 ° C.
- Centrifugera lösningen under 10 min vid 400 xg vid rumstemperatur, kasta supernatanten och återsuspendera cellerna i 5 mlproprietary upptiningsmediet förvärmas vid 37 ° C, kompletterat med glutamin eller en glutamin tillägg (2 mM slutlig koncentration) (Williams E + glutamin tillägg + upptinings tillägg).
- Räkna livskraftiga celler med användning av en 500 mikroliter alikvot med en cellräknare eller någon annan lämplig cellräkning teknik.
- Ympa cellerna i en 24-brunn kollagen-belagd platta med en täthet av 0,6 x 10 6 viabla celler / brunn i en slutlig volym av 0,5 ml upptiningsmedium.
- Placera plattan (er) i en inkubator vid 37 ° C med en 5% / 95% CO 2 / luft och 100% relativ fuktighet.
- 24 h efter sådd av cellerna, ersätta mediet med 0,5 ml förvärmda underhåll / metabolism arbetsmedium (Williams E + glutamin tillägg + metabolism tillägg (detta medium redan innehåller DMSO)). Ändra mediet varannan dag.
- Efter några dagar i odling cellerna bildar en sub-konfluent trabekulära struktur (figur 3). Den optimala metaboliskaaktivitet observeras typiskt mellan dag 7 och 10 och är lägst vid dag fyra.
Figur 4: Tvärsnitt av Alcian Blue Stained Airway Cells Grown vid luft-vätskegränssnittet 8.
Cilierade, slem producerande och basalceller är tydligt synliga. Scale bar = 250 | im.
- Differentierade luftvägsepitel kulturer
OBS: protokoll visas med en kommersiellt tillgänglig fullständigt differentierade primära luftvägsepitel odlas vid luft-vätskegränsytan på en insats 8 (figur 4). Vävnadsodlings behåller en mucocilliary fenotyp och cellpolaritet 8. Celler kan vara av nasal eller bronkial ursprung. Här använda mänskliga nasala celler. Cellerna levereras på en odlingsplatta format med 24infogar vid luft-vätskegränsytan. Att underlätta transport och undvika medel spill skären levereras med basala delen inbäddade i en agarosmatris blandad med odlingsmedium.- Vid leverans av cellerna, sterilisera plattorna innehållande de 24 skär med en 70% etanollösning innan de placeras i en ren dragskåp med laminärt flöde.
- Förbereda en steril 24-brunnsplatta genom tillsats av pre-warmed 700 mikroliter proprietary odlingsmedium.
- Med användning av sterila pincetter överföra cell skär till den nya plåten förinstallerad med mediet genom att försiktigt lösgöring insatsen från agarosmatrisen.
- Placera plattan (er) i en inkubator vid 37 ° C med en 5% / 95% CO 2 / luft och 100% relativ fuktighet.
- Varje 2 dagar överföra skären till en ny steril 24-brunnars platta förinstallerad med 700 mikroliter varmt proprietary luftväg cellodlingsmediet.
- Bedöma integriteten i luftvägsvävnad med användning av förfaranden, såsom trans-epitelial resistans (TEER), ellercilier slå frekvens (CBF) med användning av ett mikroskop utrustat med en live videoavbildningssystem 9. Mätning av TEER och CBF beskrivs i Kuehn 10.
2. CYP Aktivitet Kvantifiering i cellkulturer
NOTERA: Som en allmän regel, kan lösningsmedel såsom DMSO och metanol användas för att framställa stamlösningar för de olika metaboliska sönder och inhibitorer som presenteras i detta dokument. Emellertid, rekommenderas att hålla den slutliga DMSO-koncentrationen i odlingsmediet till ett minimum (1% eller lägre) eftersom höga koncentrationer kan hämma metaboliska enzymer. När det är möjligt, är det också rekommenderat att använda fenolrött fritt och serumfritt medium under inkubationen med metaboliska prober eftersom fenolrött kan störa CYP och fas II-enzymaktivitet och serumkomponent såsom albumin kan minska sondens tillgänglighet. Det är inte alltid möjligt att strikt följa dessa riktlinjer. Till exempel, är luftvägscellodlingsmedium proprietary och innehåller fenolrött. Proprietary hepatisk cellinje metabolism mediet 7 redan innehåller DMSO ovan 1% som det krävs för cellerna att anta hepatocyt-liknande fenotyp.
OBS: Slutligen, här är termen specifika sond / hämmare användas, men denna terminologi måste beaktas med försiktighet. I själva verket är det mycket sällsynt att en metabolisk sond för att vara ett enzym exklusiv substrat. Sonderna som beskrivs här, emellertid, har en hög affinitet för sin enzymmålet och därför betraktas som tillförlitliga markörer för aktivitet.
- Metaboliska sönder, inducerare och inhibitorer
- Prober med användning av masspektrometri baserade metoder
OBS: De sönder och inhibitorer beskrivs i detta avsnitt är lämpliga för att testa aktiviteten av CYP2As 11, CYP1A2 12,ref "> 13, CYP2B6 7, 14, CYP2F1 15, 16, och CYP2E1 17 genom UPLC-masspektrometri. Sondema, inhibitorer och motsvarande CYP beskrivs i tabell 1 med motsvarande hänvisningar. Tabell 1 listar också den metaboliska produkten av CYP aktivitet som är kvantifierat genom masspektrometri. allt arbete som involverar vävnadsodling och lösningar för användning i vävnadskultur är som skall utföras i en steril vävnadsodling huva. en stamlösning kan framställas i DMSO för alla sondsubstrat.- Före experimentet förbereda två serier av cellinlägg eller brunnar, använda en serie för hämningen experimentet, den andra för endast den metaboliska sonden. Förbereda tredjedel serie celler som ett medium blank kontroll. De kan vara på separata plattor eller i samma plattor med ett minimum av tre replikat. Ett exempel på plattan lågut presenteras i figur 5.
- På dagen för experimentet, byter cellodlingsmedium med 450 mikroliter av färskt medium.
- Förbereda i en steril huva en 10x koncentration av följande lösningar med hjälp av cellodlingsmediet. Blanda 10x CYP sond, 10x CYP-hämmare, och 10x CYP-hämmare plus 10x sond.
OBS: Master stamlösningar av hämmare och prob kan framställas i 100% DMSO (t.ex. 1,000x stockar) till och ytterligare utspädda i medium erhålla en 10x lösning i syfte att undvika en slutlig DMSO-koncentration på över 1% med cellkulturen . De slutliga 1x koncentrationer som syftar för inkubation med cellerna visas i tabell 1. - Välja olika 10x sondlösningen med en 0,2 | im sprutfilter.
- Tillsätt 50 | il av mediet innehållande den 10x CYP inhibitor till serien av celler som framställts för hämningen experimentet och pre-inkuberas under 30 min.
- REPlacera mediet av celler vid inhibering serie med 450 mikroliter av färskt medium och tillsätt 50 | il av medium innehållande både 10x CYP inhibitor och 10x probsubstrat.
- Lägg till de andra cellerna 50 fil medium med 10x sond-substrat och till en ekvivalent mängd vehikel utspädd i medium (t.ex., DMSO) till de tomma cellkontroller såsom visas i fig 5.
- Inkubera cellerna i 0 - 5 min (tid 0, bakgrund kontroll) och 16 h i cellinkubator.
OBS: Denna inkubationstid användes framgångsrikt med de luftvägsceller och lever cellinje; emellertid färska primära hepatocyter har en hög metabolisk kompetens, i avvaktan på kvaliteten på cellberedningen och genetiska makeup av donator, därav kortare tider (t ex 2-4 h) kan vara lämpliga. Det är alltid rekommenderas att utföra ett tidsförlopp experiment när man testar olika cellinjer eller celltyper. - Vid slutet av inkubationstiden, collect mediet i separata märkta rör för kvantifiering av den metaboliska produkten av proberna. Frys medium för framtida behandling.
- Lyserar cellerna för protein kvantifiering.
OBS: Alla standardprotein kvantifiering kit och protokoll är lämpligt för detta steg. BCA är ett lämpligt alternativ. Detta steg är valfritt om cellerna måste användas i en annan analys.
- medel behandling
OBS: Den uppsamlade från inkubationen steget mediet innehåller modersond kemikalien samt dess metaboliska produkter. För att mäta en specifik CYP aktivitet endast produkten av reaktionen som katalyseras av CYP av intresse bör kvantifieras. Fas I ämnesomsättning ofta bearbetas i tandem med fas II metabolismen (konjugering) och därför inte kan upptäckas som sådana. Sålunda för att erhålla den mest exakta kvantifieringen av en CYP-aktivitet, är ett dekonjugering steg krävs för att avlägsna eventuelltFas II metabolism modifiering. Eftersom konjugering av fas I metaboliter innefattar ofta glukuronidering eller sulfatering, är dekonjugering uppnås genom behandling av proverna med glukuronidaser och sulfataser 18. Glukuronidas och sulfatas aktivitet är pH-beroende med högsta glukuronidasaktivitet uppnås vid pH 4,5-5,0 och sulfatas-aktivitet är högst vid pH 6,0-6,5. Därför kräver denna pH-justeringssteget. I den här beskrivna metoden, mäter vi pH med användning av pH-remsor av praktiska skäl eftersom mätaren sonder mest pH inte passar i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Kommersiellt tillgängliga pH-remsor kan hittas med en upplösning så låg som 0,3 till 0,2 pH-enheter.- Överföra 250 mikroliter av inkubationsmedium till ett 1,5 ml mikrorör och tillsätt 4-metylumbelliferon inre standardstamlösning för att nå en slutlig koncentration av 100 nM.
- Justera pH i mediet till 4,5-5,0 genom tillsats av 1 M HCl. Tillsätt 1 pl av HCl vid en tid och kontrollera pHgenom att pipettera 2 | il av medium på ett pH-remsa. Når ett pH av 5,0 skulle typiskt kräva inte mer än 5-10 | il av en IM HCl.
- Tillsätt 150 enheter (1,8 | il av en 85 tusen enheter / ml lager) av β-glukuronidas / arylsulfatas från Helix pomatia och inkubera i 1 h vid 37 ° C. Stoppa reaktionen genom tillsats av 250 mikroliter av kall metanol (-20 ° C). Lagra proverna vid -20 ° C eller processen ytterligare.
- Indunsta lösningsmedlet med användning av en vakuumcentrifug vid 45 ° C. Rekonstituera proverna med 500 mikroliter av en 30% acetonitril: vatten-lösning. Proverna är redo för masspektrometrianalys och kan lagras vid -20 ° C i amber glass flaskor.
- Mass Spectrometry baserad kvantifiering
OBS: All UPLC och mass spektrometer inställningar beskrivs i den särskilda Supplemental tabell 1. För en kvantitativ analys, är upprättandet av en kalibreringskurva krävs. Calibration kurva erhålls genom att köra en känd utspädningsområde av föreningen som skall kvantifieras. I detta fall har de kalibreringskurvor genererade över 10 olika koncentrationer (Tabell 2), åtminstone sex av som bör vara inom 20% av det linjära området 19. Lägsta nivån av detektering bestäms som den lägsta koncentration som ger en signal som är större än, eller lika med 3x den genomsnittliga bakgrundssignalen. Den lägsta nivån av kvantifiering bestäms som provet av lägsta koncentration som ger en signal större eller lika med 10x den genomsnittliga bakgrundssignalen vilka båda bestäms över åtminstone 3 oberoende körningar med tredubbla prover.- Förbereda en serieutspädning av ett syntetiskt metabolit i vävnadsodlingsmedium enligt tabell 2, inklusive den inre standarden. En slutlig volym av 250 pl per standardutspädning är tillräcklig.
- Indunsta de seriella spädningar av standard såsom beskrivits i step 2.1.2.4 och återsuspendera i en volym av 30% acetonitril: vatten ekvivalent med volymen av media före avdunstning (t ex 250 | il 30% acetonitril: vatten om utgångsstandardlösningen var 250 mikroliter av medium).
- Lägga 250 mikroliter av varje serieutspädning standard till en bärnstensfärgad UPLC glasflaska för injektion i UPLC-MS autosampler.
- Lägg testproven (250 mikroliter) till gult UPLC flaskor och placera dem i UPLC autosampler.
- Slumpa alla flaskorna.
OBS: Konfigurationen masspektrometer vi använde är en hybrid trippel kvadrupol / linjär jonfälla-masspektrometer kopplad till en UPLC detaljerad i Supple Tabell 1. Andra plattformar skulle ha olika programvaror och konfiguration, men skulle följa liknande steg för att utföra kvantifiering. - Köra UPLC-MS med användning av de inställningar som beskrivs i Supple Tabell 1 beroende på den specifika proben att kvantifiera.
- Använda sig avden "kvantifiera - Bygg Kvantifiering metoden" verktyg i massspektrometer kvantifieringsverktygen (tabell of Materials) för att generera kalibreringskurvan från den förvärvade syntetisk standard och intern standard.
- Använd "Kvantifiering Wizard" för att göra urvalet parti och prover för att kvantifiera och kör "Kvantifiering Method". Mass programvara spektrometer kvantifiering visar ett kalkylblad med kvantifiering värdena av den avsedda föreningen i varje testprov.
- Prober med användning Luminiscens baserade metoder
OBS: luminogent sönder för att mäta en rad CYP aktiviteter är kommersiellt tillgängliga; Men inte alla är lämpliga för cellbaserade analyser. Här, är ett protokoll som presenteras för att mäta aktiviteten av CYP1A1 / CYP1B1. CYP1A1 / 1B1 valdes för att illustrera hur man analysera aktiviteten av inducerbara CYP och för att ge ett exempel på hur luminogena prober kan användas som ett alternativ till masspektrometri baserade metoder. Tabell 3 sammanfattar koncentrationerna och inkubationstiden vi använde för luftvägsceller och lever cellinje; Men kanske de måste anpassas för andra celltyper. Andra luminogena prober är kommersiellt tillgängliga och kan användas som substrat för en mängd olika CYP.- Förbereda tillräckligt många celler för att inkludera en icke-inducerad kontroll, en inducerad test, och en inducerad + inhibitor test. Ett exempel på en platta layout visas i Figur 5B.
- Att inducera CYP1A1 / 1B1, inkubera cellerna med en slutlig koncentration av 10 nM TCDD i medium under en period av 72 timmar (kortare perioder av 24 till 48 h kan också vara lämpliga).
VARNING: TCDD är cancerframkallande och teratogen. Använd lämplig skyddsutrustning, granska leverantören MSDS plåt och göra en riskbedömning före användning. - Efter denna period, ta bort mediet, skölj brunnarna med PBS 3 gånger, och lägga till lite färskt medium.
- Prior att inkubera cellerna med luminogena rapportörsond, för-inkubera den utsedda delmängd av inducerade celler under 30 min med en slutlig koncentration av 10 | iM CYP1A1 / 1B1-inhibitor, α-naftoflavon, i medium.
- Lägga den luminogena sond LUC-CEE (luciferin 6'-kloretyl eter) vid en slutlig koncentration av 50 uM till de icke-inducerade, inducerade, och inducerade + inhibitor-celler.
- Inkubera under 4 timmar i en cellkultur inkubator. Vid slutet av inkuberingstiden samla mediet för kvantifiering av den luminogena sonden.
- Överföring 25 mikroliter av odlingsmedium till en vit ogenomskinlig 96 brunnsplatta och lägga 25 mikroliter av luciferin detektionsreagens som tillhandahålls av tillverkaren. Inkubera i 20 min vid rumstemperatur. Läs plattan omedelbart med en luminometer.
- Skölj cellerna med PBS och lysera efter totalt protein kvantifiering.
OBS: Detta steg är valfritt om levande celler behålls för framtida experiment. jagt är viktigt att notera emellertid att inducerare, såsom TCDD är toxiska och kommer att skada cellerna.
- Prober med användning av masspektrometri baserade metoder
Tabell 1: Förteckning över Metabolic Probes, produkter och inhibitorer med motsvarande enzym. Molekylvikt och rekommenderade koncentrationerna som används med luftvägen och hepatiska celler är också indikerade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Föreslagna 24-brunnar Layout för att Utför en CYP Assay. (A) Den rekommenderade layout för CYP konstitutivt uttryckta innefattar en serie av brunnar för blind mediet, Den metaboliska sonden, och den metaboliska sond plus inhibitor. Denna layout kan multipliceras med antalet tidpunkter som testas. (B) I exemplet layout för inducerbara CYP: er innefattar en serie väl för en medellång tom, en metabolisk prob endast kontroll, inducerade celler (t.ex. med TCDD) inkuberades med sonderna och inkuberades med proberna och en inhibitor.
Tabell 2: Utspädning av syntetiska standarder används för kalibreringskurvor och Respektive bestämningsgränser och LOQs. Utspädnings utbud att använda kan variera beroende på masspektrometri plattform och känslighet. Här har vi använt en hybrid trippel kvadrupol / linjär jonfälla masspektrometer kopplad till en UPLC. Klicka här för att se en större version av dennafigur.
Tabell 3: luminogena Probe, hämmar och inducerar för CYP1A1 / 1B1 Assay. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Exempel på metabolisk aktivitet som uppmätts för två par av CYP (CYP1A1 / 1B1 och CYP2A6 / 2A13) i de luftvägscellkulturer från tre olika donatorer (luftväg M360, M370, M417) och hepatisk cellinje (Hep linje) visas i fig 6 20.
CYP-aktivitet mättes genom luminometri
Figur 6A visar den relativa luminiscens som produceras av CYP1A1 / 1B1 O-dealkylering aktiviteten av Luc-CEE (luciferin 6'-kloretyl eter) i luftvägsceller (3 donatorer) och hepatiska celler med och utan TCDD induktion. CYP1A1 / 1B1 är mycket inducerbara enzymer och är vanligtvis inte uttrycks på en konstitutiv nivå i de flesta vävnader. Såsom kan ses i Figur 6A, är ingen luminogena signal detekteras när cellerna inte induceras. När båda celltyper förinkuberas med TCDD, en stark CYP1A1 / 1B1 inducerare, ett märkeed luminogent signal detekteras jämfört med kontrollen (fig 6A). Detta indikerar att Luc-CEE sonden har metaboliseras ledande till frisättningen av luciferin del som kvantifieras därefter. Övergripande aktiviteten från TCDD behandlade lever cellinje är lägre än för de luftvägsceller, även efter totalt protein normalisering. Detta är inte ovanligt, eftersom cellinjer tenderar att vara mindre metaboliskt aktiva än primära celler. Tillsats av α-naftoflavon har en klar hämmande effekt på CYP1A1 / 1B1-aktivitet i alla celltyper som ytterligare bekräftar den CYP-beroendet av Luc-CEE metabolism.
Kvantifiering av CYP450 metaboliter med användning UPLC-MS
Figur 6B illustrerar kvantifieringen av CYP2A6 / 2A13-aktivitet i luftvägsceller från 3 donatorer (Airway M343, M345, M347) och leverceller (Hep linje) efter inkubation med kumarin i närvaro och frånvaro av inhibitor 8-metoxipsoralen. Data är normaliserad för totalt protein. I 0 min kumarin inkubation kontroll, ingen 7-hydroxikumarin detekteras (figur 6B). CYP2A6 / 2A13 uttrycks konstitutivt på vissa vävnader och därför efter 16 h inkubation med kumarin bildningen av 7-hydroxikumarin detekteras i de olika celltyper som testades, även utan induktion. När 8-metoxipsoralen, är en CYP2A-hämmare tillsattes (Figur 6B), är bildningen av 7-hydroxikumarin reduceras avsevärt.
Det bör noteras att i närvaro av CYP-hämmare, är det normalt att fortfarande känna en viss restaktivitet som inhibition är sällan komplett och eftersom andra CYP skulle också kunna känna igen underlaget men bearbeta den mycket mindre effektivt. Det kan också observeras att den inspelade metabolisk aktivitet kan vara olika mellan donatorer vid användning av primära celler som den är synlig för CYP2A6 i luftvägsceller(Figur 6B). Detta förväntas som CYP aktivitet är skyldig att varje donator genotyp och polymorfism.
Figur 6: Aktivitetsanalys Resultat för CYP1A1 / 1B1 aktivitet (A) och CYP2A6 / 2A13 aktivitet (B) i det Hepatisk Cell Line och i Three Airway Cell Donors (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE dealkylering aktivitet visas med och utan induktion av CYP1A1 / 1B1 av TCDD. α-naftoflavon användes som CYP1A1 / 1B1-inhibitor. Aktivitet uttrycks som relativa luminiscens heter (RLU) normalise av inkubationstiden i minuter (min) och totalt protein (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 inte kräver induktion som de uttrycks konstitutivt. Kumarin 7-hydroxylering aktivitet i pmol / min / mg proteiner visas vid olika tidpunkter med och utan inhibitom 8-methoxypsoralen. Alla resultat presenteras som ett medelvärde av tre oberoende mätningar med standardavvikelser från medelvärdet. Denna figur modifierades från Baxter 20.
Kompletterande Tabell 1: UPLC och masspektrometer Inställningar. Klicka här för att ladda ner filen.
Discussion
För närvarande många standardiserade toxikologiska testsystem använder Engineered bakterier, cellinjer eller embryonala celler som inte är representativa för den normala humana metabolismen 1. Detta kan leda till felaktiga förutsägelser om potentiella toxiska aktiviteten hos en kemisk eller medicin. Innovativa in vitro modeller, såsom 3D-cellkulturer och organ på ett chip, håller på att utvecklas i ett försök att bättre replikera normal morfologi och metabolisk aktivitet hos mänskliga vävnader 21, 22, 23. Metabolic kompetens är ett kriterium som kan användas för att dechiffrera vilka modeller är bäst lämpade för toxikologisk bedömning och läkemedelsmetabolismen studier.
Protokollet vi har skisserat i detta dokument är utformad för att mäta aktiviteten av CYP-enzymer med hjälp av levande celler. Den är flexibel och kan användas för olika cellsystem i 2D eller 3D cultures och ger möjlighet att använda antingen en luminogent probe- eller masspektrometri baserat tillvägagångssätt. Båda metoderna är tillräckligt känsliga för att detektera nanogrammängder av material och endast kräver ett litet antal celler odlade i en flerbrunnsformat. De kan också tillämpas på sfäroid eller celler odlas i komplexa matriser. Valet av sonden substratet är uppenbarligen ett kritiskt element av protokollet. Specificiteten hos analysen förlitar sig på sonden vara selektiv för CYP enzymet och ett annat skikt av säkerhet kan erhållas genom användning av en selektiv CYP inhibitor. Substraten och hämmare som anges i detta dokument är bara några exempel, men andra kan hittas i litteraturen.
Det är viktigt att beakta flera inkubationstider vid arbete med en ny cell som ett negativt CYP-aktivitet resultat skulle kunna bero på det enzym som uttrycks på en låg nivå. Tillsatsen av en celltyp som kan användas som en positiv kontroll är tillrådligt att säkerställa att ennegativt resultat är inte kopplad till en teknisk fråga och att hjälpa till med felsökning. Primära leverceller är metaboliskt kompetenta och kan användas som kontroll, till exempel primära hepatocyter i suspension är mycket lätt att använda, men deras livskraft är begränsad i tid. Levercellinjer är möjliga alternativ som är relativt lätt att använda som beskrivs i detta protokoll, men vissa är bättre än andra när det gäller metabolisk aktivitet 6, 21.
Eftersom analysen är icke-förstörande, om inte totalt protein kvantifieras, är det möjligt att följa den CYP-aktivitet över tid i longitudinella studier 20. Detta är en viktig punkt eftersom vissa celler kommer att ha variabel CYP aktivitet över tiden i kultur. Ett negativt resultat kan vara förknippade med bristen på sammanflytning, framsteg med differentiering eller avdifferentiering in vitro. I så fall är den metod halv quantitative eftersom data inte är normaliserad med den totala mängden protein i varje cellkultur. Det är inte alltid möjligt eller rekommenderat att återanvända vävnaden efter mätning av CYP aktivitet som exponering för sonder, hämmare eller inducerare kan ha en toxisk effekt på vävnaden som är fallet för TCDD.
Cellfraktioner såsom mikrosomer skulle också kunna användas för att karakterisera den CYP-aktivitet av en given celltyp. Mikrosomberedning kräver emellertid en hel del cellmaterial, tillsättning av lämpliga kofaktorer och buffert för att säkerställa att de enzymer förblir aktiva. Med hjälp av levande celler eliminerar knepiga mikros förberedelse steg och träna som buffrar och kofaktorer fungerar bäst.
Som en allmän rekommendation, är det bästa praxis för att ytterligare karakterisera uttrycksprofilen av CYP i cellkulturer för att verifiera att den matchar den enzymatiska aktiviteten. Denna extra nivå av verifiering rekommenderas med tanke på att de metaboliska sond inte Entiförlita specifika för en enda CYP och det ger ökad förtroende för att den uppmätta metabolisk aktivitet motsvaras av motsvarande enzym-expression. Eftersom CYP är membranproteiner är de relativt svåra att framställa för western blöts, därför kvantitativ RT-PCR har varit det föredragna tillvägagångssättet att profilera dessa enzymer 20.
Det är viktigt att notera att detta protokoll beskriver en metod för att analysera CYP enzymaktivitet som endast representerar en familj av metaboliska enzymer, om än en viktig sådan. Flexibiliteten i en mass tillvägagångssätt spektrometri tillåter utvecklingen av anskaffningsmetoder för andra metabola omvandlingar av probsubstrat. Men de har utvecklas en i taget och det finns för närvarande färre kända specifika prober och selektiva inhibitorer för andra metabola familjer enzym. Detta gap bör åtgärdas för att möjliggöra en övergripande bedömning av den metaboliska kompetensen hos in vitro cell systeFröken.
Disclosures
AB och EM var anställda i British American Tobacco vid tidpunkten detta manuskript skrevs. Det arbete som beskrivs i detta manuskript har finansierats av British American Tobacco och publiceringsersättningar för video-artikeln betalades av British American Tobacco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent & Cells | |||
| 2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
| 5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
| 6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
| 6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
| 7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
| 7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
| 8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
| acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
| α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
| BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
| Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
| Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
| chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
| collagen | Cell Systems | 5005-B | |
| coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
| disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
| fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
| Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
| HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
| HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
| HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
| Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
| methanol | Fisher | M/4056/17 | |
| MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
| MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
| Phenomenex Kinetex 2.6 μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
| TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
| thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
| Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm 2.1 x 50 mm | Waters | 86003538 | |
| Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UPLC | Waters | Acquity | |
| QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
| QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
| luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
| rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |
References
- Garcia-Canton, C., Minet, E. Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).
- Croom, E.
- Lewis, D. F. 57 varieties: the human cytochromes P450. Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).
- Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. Phase II drug metabolizing enzymes. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, Olomouc. Czech. Repub. 103-116 (2010).
- Dekant, W. The role of biotransformation and bioactivation in toxicity. EXS. 99, 57-86 (2009).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).
- Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers. Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Kuehn, D., et al. Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke. J. Vis. Exp. , (2015).
- Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).
- Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2. Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).
- Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).
- Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico. Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).
- Kartha, J. S., Yost, G. S. Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes. Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).
- Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).
- Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1. Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).
- Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli. Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).
- Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements. RSC Analytical Methods Committee. , Available from: http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf (2013).
- Baxter, A., et al. Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia. Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).
- Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs. Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).
- Li, Z., et al. Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip. Integr. Biol. 8, Camb. 1022-1029 (2016).
- Takahashi, Y., et al. Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Biosci. Rep. , (2015).
