Summary
In vitro sistemlerin Metabolik yetkinlik ilaç ve toksik maddelerin biyotransformasyonu ve dışa atılması için önemli bir gereksinimdir. Bu protokol, biz Hücre kültürlerinde metabolizma faz değerlendirmek için referans metabolik sondaları uygulanmasını açıklar.
Abstract
Ksenobiyotik metabolize eden enzimlerin çözünürlüğü arttırmak ve salgılanmasını kolaylaştırmak fonksiyonel gruplar ilave etmek suretiyle ilaç ve toksik biyotransformasyonu önemli bir işlev görür. Bazı durumlarda, bu yapısal değişiklikler yeni toksik ürünlerin oluşumuna yol açar. hayvanlar üzerinde test azaltmak amacıyla, kimyasal risk metabolik olarak yetkin hücreleri kullanılarak değerlendirilebilir. Metabolik enzimlerin ifadesi, buna rağmen, nitro, birincil kültür sistemlerinde bir çok zaman içinde kararlı değildir ve çoğu zaman hücre çizgilerinde kısmi veya mevcut değildir. Bu nedenle, in vitro ilaç, katkı maddeleri, ve çevre kirliliği yaratanlar metabolizma çalışma ideal metabolik aktivite ile karakterize edilmiştir hücre sistemlerinde yürütülmelidir. Biz UPLC kütle spektrometresi ile ölçülebilir kimyasal probları ve metabolik ürünlerini kullanarak 2B hücre hatları ve primer 3D kültürlerinde metabolik enzimler sınıfının aktivitesini (insan Faz I) ölçmek için, bir yaklaşım açıklar veluminometri. yöntem hücre kuşakları ve çeşitli dokulardan elde edilen birincil hücreler metabolik aktiviteyi test etmek için uygulanabilir.
Introduction
Ksenobiyotik metabolizma vücuda yabancı kimyasal atılımını 1 kolaylaştırmak için hidrofilik grupların ve bunların konjugatları eklenmesi ile modifiye olan süreçtir. Tipik olarak ksenobiyotiklerin metabolizma bir ya da birden fazla hidroksil grubu 1, 2 ilavesi ile bir oksidasyon çoğunlukla oluşan Faz iki aşamalı bir işlemdir. Örneğin glukuronid veya bir sülfat kısmı 1, 2 gibi bir hidrofobik konjugat için alıcılar olarak Faz II, hidroksil grupları kullanılır. bir alıcı grup zaten molekül üzerinde mevcut ise, konjugasyon adım, bağımsız Faz I metabolizma olabilir. Her bir reaksiyon kimyasal alt tabakalar 3 belirli bir enzimin grubu, örneğin, hidroksilasyon katalize CYP (sitokrom P450), (Şekil 1) ve dealkilasyon ile gerçekleştirilir. ConjugatioN sulfotransferazlar ile katalize edilir, UDP-Glukuronosiltransferazı (Şekil 1), glutation-S-transferaz ve N-asetiltransferaz 4. Her bir doku ve organ bu proteinlerin en ifade karaciğer ile, belirli bir metabolik enzim sentezleme profiline sahip olacaktır.
Şekil 1: Faz I ve kumarin için Faz II Metabolizmasının örneği. CYP2A6 / kumarin 7-hidroksilasyonu katalize CYP2A13. 7-hidroksikumarin UGT1A6 ve UGT1A9 yüksek etkinlik gösteren, faz II enzimleri UGTs bir glukuronid parçasına konjuge olur.
ksenobiotiklerin metabolizmasını anlamak iki nedenden dolayı ilaç güvenliğinin değerlendirilmesinde ve kimyasal risk değerlendirmesi için önemlidir: reaksiyon kinetiği bir uyuşturucu veya kimyasal aktif veya inaktif formu b vücutta ne kadar süre yeni belirleyecekefore boşaltım; ve ana bileşiğin metabolik enzimler tarafından daha reaktif olmayan ve toksik türler için değiştirilebilir. Aynı zamanda "biyoaktivasyon" olarak bilinen bu tür reaksiyonlar çoğunlukla, aynı zamanda, faz II konjugasyon 5 ile nadir durumlarda enzimler CYP faz ile tahrik edilmektedir.
Buna göre, doğru bir ilaç ya da bir kimyasal ile bağlantılı risk tahmin etmek için bir in vitro modelinin özelliği, hücre sistemine bağlı oksijen yetkinlik oldukça bağımlıdır. Hastalıklı dokulardan ya da normal hücrelerin transformasyonu türetilmiş hücre çizgileri genelde bir parçası değilse kökenli 6 bunların dokunun metabolik enzim profili temsil tüm kaybeder. Normal metabolik enzim profili bakımı (en azından kısa süreli kültürlerde), birincil hücre kültürleri daha iyi görünür ve doku onun 3 boyutlu yapısını 1 muhafaza sağlayan bir matris içinde kültürlenir ise daha artırıldı. Bu nedenle, Charbir in vitro hücre sistemine bağlı oksijen yeterliliğin acterization hücre modeli kimyasal güvenlik değerlendirme yapmak için uygun olan ilgili bir karar kılavuz önemli bir ön adımdır.
Bu yazıda bir karaciğer hücre çizgisi 7 ve 3D primer akciğer hücre kültürleri 8 ile uygulama örnekleri ile in vitro aktivite ve Faz I CYP enzimlerinin ekspresyonunu profil bir protokol mevcut. CYP özel alt-tabakalar, bunların metabolik ürünleri ve önleyici kontrol kütle spectrometry- ve lüminojenik tabanlı miktar yöntemler ile birlikte tarif edilmiştir. Bazı CYP uyarılabilir ve diğerleri kurucu olduğu için, örnek aynı zamanda bu iki senaryo için verilecektir.
Protocol
Not: metabolik aktivite deneyi için genel iş akışı, Şekil 2'de gösterilmiştir. bu iş akışının her adım sonraki paragraflarda sonradan detaylı. Reaktifler ve ekipman ayrıntılı tablolar Malzemelerin Tablo l'de verilmiştir.
Şekil 2: Metabolik Sonda Denemesi için iş akışı. hücreleri, yeterli yoğunluğa büyütülür. Bir CYP indüksiyon aşaması tahlil edilen enzim aktivitesine bağlı olarak gerekli olabilir. prob substratı ve inhibitör hücre kültürüne ilave edilir. bir inkübasyon süresi sonrasında, ortam analiz için toplanır ve hücreler, proteinin ölçümü için parçalanır. orta kütle spektrometrisi veya luminometri ile prob substratın metabolik ürünün analizi için işlenir.reklam / 55502 / 55502fig2large.jpg" target = '_ blank'> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
1. Hücre Kültürü
Şekil 3: Karaciğer Hücre Hattı Kültür Işık İletim mikrografi. Bu protokol 5'te tarif edilen hücre hattı, tipik olarak kültürde cholangiocytes ve hepatositler arasında% 50'lik bir bölme (100 x) ile farklılık gösterir. Ölçü bar = 100 um. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Karaciğer hücre hattı kültürü
NOT: Ticari olarak mevcut karaciğer hücre çizgisi, metabolik olarak elverişli hücrelerin, örnek olarak kullanıldı. Hücre çizgisi viral enfeksiyon 7 neden olduğu bir hepatokarsinoma türetildi. Akışların birleştiği yerde hücreler, bu hücre çizgisi (Şekil 3) cholangiocyte- ve hepatosit benzeri hücrelerin belirlemektedir ve diğer ayrıntılar Guillouzo 7 bulunabilir. Kültür ortamına% 2 DMSO dahil CYP'ler çeşitli bu hücre hattının ve ifade farklılaşmasını destekler.- sıvı azottan hücrelerle kriyojenik şişeler kaldırma ve taşıma için, kuru buz üzerine yerleştirin. 1-2 dakika boyunca, 37 ° C'de bir su banyosunda önceden ısıtılmış için dondurarak saklama vialinin transferi ve bir laminer akış başlığı içinde yerleştirmeden önce% 70 etanol ile flakon sterilize edin.
- steril şartlar altında çalışarak iken, dikkatli bir şekilde herhangi bir fazla basıncı serbest bırakmak ve 37 ° C'de önceden ısıtılmış Williams'ın E ortamı 9 mL ile doldurulmuş bir 10 ml tüp içine kriyojenik şişe içeriğini pipet kriyojenik şişe açın.
- Oda sıcaklığında, 400 x g'de 10 dakika süre ile çözelti santrifüj supernatant atmak ve 5 mL hücreleri tekrar süspansiyonözel çözülme ortamı, 37 ° C'de önceden ısıtılmış glutamin veya bir glutamin takviyesi (2 mM nihai konsantrasyon) (Williams'ın E + glutamin eklemesi + çözülme takviyeleri) ile takviye edilmiştir.
- bir hücre sayacı ya da herhangi bir başka müsait hücre sayımı tekniği ile bir 500 uL alikot kullanarak canlı hücreleri sayın.
- 0.6 x 10 6 canlı hücre / kuyucuk içinde çözülme ortamında, 0.5 mL'lik nihai bir hacimde 24 oyuklu kollajen kaplı plakaya hücreleri Seed.
- % 5 /% 95 CO2 / hava ve% 100 nispi nem ile 37 ° C'de bir inkübatör içinde plaka (lar) yerleştirin.
- 24 saat sonra, hücreler tohumlandıktan sonra, önceden ısıtılmış bakım / metabolizma çalışma ortamı, 0.5 mL (Williams'ın E + glutamin takviyesi + metabolizma takviyesi (bu ortam önceden DMSO içerir)) ile orta yerine. iki günde orta değiştirin.
- Kültür içinde, birkaç gün sonra hücreler, bir alt konfluent trabeküler yapı (Şekil 3) meydana getirir. optimum metabolikaktivite genellikle gün 7 ve 10 arasında gözlemlenen ve 4. günde en düşük olan.
Şekil 4: hava-sıvı arayüzü 8 Yetiştirilen Alcian Mavi Lekeli hava yolu Hücreler Kesit.
Silli, mukus üreten ve bazal hücrelerin net bir şekilde görülebilir. Ölçü bar = 250 um.
- Farklılaştırılmış hava yolu epitel kültürleri
Not: protokolü bir ek parça 8 (Şekil 4) üzerinde hava-sıvı arayüzünde büyütülen bir ticari olarak temin edilebilir tam olarak farklılaşmış primer hava yolu epitel ile gösterilmiştir. Doku kültürü mukosiliyer fenotip ve hücre polarite 8 korur. Hücreler, nazal veya bronşiyal kökenli olabilir. Burada, insan burun hücreleri kullanır. Hücreler 24 ile bir kültür plakası formatında gönderilirhava-sıvı arayüzünde ekler. taşınmasını kolaylaştırmak ve ek kültür ortamı ile karıştırılmış bir agaroz matris içine gömülü bazal bölümü ile sevk edilir ve orta dökülmesini önlemek için.- hücrelerin teslim üzerine temiz bir laminer akış başlığı içinde yerleştirmeden önce,% 70 etanol çözeltisi ile 24 ekler ihtiva eden plakalar sterilize edin.
- Önceden ısıtılmış 700 ul özel kültür ortamı eklenerek steril 24 oyuklu plaka hazırlanması.
- Kullanarak steril cımbız yavaşça agaroz matrisine İnsertin çıkartılmasından yeni bir levha ortamı ile önceden yüklenmiş hücre uçlar transfer.
- % 5 /% 95 CO2 / hava ve% 100 nispi nem ile 37 ° C'de bir inkübatör içinde plaka (lar) yerleştirin.
- Her 2 gün için ekler aktarmak yeni bir steril 24 oyuklu plaka önceden yüklenmiş 700 ul sıcak özel havayolu hücre kültürü ortamı ile.
- Bu tür trans-epitel direnci (TEER) veya gibi yöntemler kullanılarak hava geçen yolların dokuların bütünlüğünü değerlendirilmesikirpikler canlı bir video görüntüleme sistemi 9 ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak frekansı (BKA) yendi. TEER ve CBF ölçümü KUEHN 10'da tarif edilmektedir.
Hücre Kültürleri 2. CYP Aktivitesi Ölçümü
Not: Genel bir kural olarak, DMSO ve metanol gibi çözücüler Bu çalışmada sunulan farklı metabolik problar ve inhibitörlerin stok çözeltileri hazırlamak için de kullanılabilir. Bununla birlikte, yüksek konsantrasyonlarda metabolik enzimleri inhibe çünkü en az (% 1 ya da daha düşük) kültür ortamı içinde nihai DMSO konsantrasyonu olması önerilir. Mümkün olduğunda, aynı zamanda, fenol kırmızısı, prob kullanılabilirliğini azaltabilir albümin gibi CYP'ler ve Faz II, enzim aktivitesi ve serum bileşeni müdahale çünkü metabolik problar ile inkübasyon sırasında fenol kırmızı içermeyen ve serumsuz ortam kullanılması tavsiye edilir. Kesinlikle bu uyması her zaman mümkün değildir kılavuzlar. Örneğin, hava yolu hücre kültürü ortamı tescilli ve kırmızı fenol ihtiva etmektedir. Hücreler hepatosit benzeri fenotip kabul etmek için gerekli olduğu gibi patentli karaciğer hücre çizgisi metabolizması ortamı 7 zaten% 1'in üzerinde DMSO ihtiva etmektedir.
NOT: Son olarak, burada terimi spesifik prob / inhibitör kullanılan ancak bu terminoloji dikkatli dikkat edilmesi gereken vardır. metabolik bir prob bir enzim özel substrat için Aslında, çok nadirdir. Burada tarif edilen sondalar, bununla birlikte, enzim hedef için yüksek bir afiniteye sahiptir ve bu nedenle aktivitenin güvenilir belirtisi olarak kabul edilir.
- Metabolik problar, endüktör ve inhibitörler
- Kütle Spektrometresi göre yöntemler kullanılarak problar
NOT: Bu bölümde anlatılan probları ve inhibitörler CYP2As 11 aktivitesini test etmek için uygun olan, CYP1A2 12,ref "> 13, CYP2B6 7, 14, CYP2F1 15, 16, ve CYP2E1 17 UPLC-kütle spektrometrisi ile. probları inhibitörleri ve CYP karşılık gelen karşılık gelen referanslarla Tablo 1 'de tarif edilmiştir. Tablo 1, aynı zamanda CYP metabolik ürünü listeler kütle spektrometrisi ile ölçülür aktivitesi. doku kültürü içinde kullanılmaya yönelik doku kültürü ve çözümleri içeren tüm çalışma steril doku kültürü kaputu gerçekleştirilebilir etmektir. bir stok solüsyonu tüm prob alt tabakalar için, DMSO içinde hazırlanabilir.- Sadece metabolik prob için, diğer Önceki deneyden hücre parçalar veya kuyu iki dizi hazırlamak inhibisyon deneyi için bir dizi kullanılır. Orta boş kontrol olarak, hücrelerin bir üçüncü seri hazırlayın. Bunlar ayrı levhalar veya üç kez tekrarlanan minimum aynı plakalar içinde olabilir. plaka bir örneği, laydışarı Şekil 5'te sunulmuştur.
- Deney günü, taze ortamın 450 ul hücre kültür ortamı değiştirin.
- steril bir başlık hücre kültür ortamı kullanılarak aşağıdaki çözümleri 10x konsantrasyonu hazırlayın. 10x CYP prob, 10x CYP inhibitörü ve 10x CYP inhibitörü artı 10 x prob karıştırın.
Not: inhibitörü ve prob ana stok çözeltileri (1000x stokları örn) ortam içinde seyreltilmiş ve ayrıca hücre kültürü ile% 1 daha fazla bir son DMSO konsantrasyonunu engellemek için 10x çözelti elde etmek için% 100 DMSO içinde hazırlanabilir . Hücrelerle inkübe için amaçlanmıştır son 1x konsantrasyonları, Tablo 1 'de gösterilmiştir. - 0.2 um'lik bir şırınga filtresi ile farklı 10x prob çözeltisi süzülür.
- inhibisyon deneyinin ve 30 dakika için önceden kuluçkaya için hazırlanan hücre serisine 10x CYP inhibitörü ihtiva eden ortam içinde 50 uL ekleyin.
- Rtaze ortam 450 uL ile inhibisyon seri hâlindeki hücre ortamı eplace ve 10x CYP inhibitörü ve 10x prob substratı her ikisini ihtiva eden 50 ul ortam ekleyin.
- Diğer hücrelere 10x prob substratı ile 50 ul ortam ekleyin ve Şekil 5'te gösterildiği gibi, boş hücre kontrolleri (örn, DMSO) ortamında seyreltilmiş aracın eşit bir miktarı ilave edin.
- 5 dakika (zaman = 0, arka plan kontrol) ve hücre kuluçka makinesi içinde 16 saat 0 - hücreleri inkübe edin.
NOT: Bu kuluçka süresi hava yolu hücreleri ve karaciğer hücre hattı ile başarılı bir şekilde kullanılmıştır; Ancak taze birincil hepatositler, hücre hazırlama, kalite ve verici genetik yapısını, bu nedenle daha kısa süreler bekleyen yüksek metabolik yeterliliğe sahip (örneğin, 2-4 saat) uygun olabilir. Her zaman hücre hatları veya hücre tipleri farklı test ederken bir zaman ders deneyi gerçekleştirmek için tavsiye edilir. - Kuluçka dönemi, coll sonundavb sondaların metabolik ürünün ölçümü için ayrı etiketlenmiş tüpler orta. ileride işlenmek üzere orta dondurun.
- Protein miktarının belirlenmesi için Hücreleri.
NOT: herhangi bir standart protein miktar kiti ve protokol bu adım için uygundur. BCA bir uygun seçenektir. Hücreler bir deneyde kullanılacak varsa, bu adım, isteğe bağlıdır.
- Orta tedavi
NOT: inkübasyon aşamasında toplanan orta üst prob kimyasal olarak metabolik ürünleri içerir. Belirli bir CYP aktivitesinin ölçülmesi için, sadece ilgi konusu CYP tarafından katalizlenmiş reaksiyona ait ürün, ölçülebilir olmalıdır. Faz I metabolizma ürünleri genellikle faz II metabolizması (konjugasyon) işbirliği içinde işlenir ve bu nedenle bu şekilde tespit edilemez. Bu nedenle, bir CYP aktivitesinin en doğru ölçümünü elde etmek amacıyla, bir dekonjugasyon adımı herhangi bir kaldırmak için gereklidirFaz II metabolizma modifikasyonu. I metabolitler Faz konjugasyonu, genellikle glukuronidasyonunu veya sülfasyonu yoluyla yapıldığı için, dekonjugasyon glukuronidazlar göre örneklerin uygulanması sayesinde elde edilen ve 18 sülfatazlann edilir. Glukuronidaz ve sülfataz etkinliği yüksek glukuronidaz ile pH bağımlı, pH 4.5-5.0 ve sülfataz etkinliği pH 6.0-6.5 en yüksek olmak elde ediliyor. Bu nedenle, bu adım, pH ayarlanması gerekir. yöntem, burada açıklanan, diğer pek çok pH-metre probları 1.5 ml mikro santrifüj tüpü içinde uymaz çünkü pratik nedenlerden pH şeritler kullanılarak pH ölçer. Ticari olarak temin edilebilen pH şeritler 0.3 ila 0.2 pH birimi kadar düşük bir çözünürlüğe sahip bulunmaktadır.- 1,5 mL'lik bir mikro inkübasyon ortamı 250 uL aktarın ve 100 nM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 4-metilumbelliferon iç standart stok solüsyonu ekleyin.
- 1 M HCl ilave edilerek 4.5-5.0 için ortamın pH ayarlayın. her seferinde HCl 1 uL ekleyin ve pH kontrolpH şerit üzerine orta 2 uL pipetleme. tipik olarak, 5.0 bir pH değeri olur ulaşan 5-10 uL 1 M HCl fazla gerektirir.
- Helix pomatia kaynaklı β-glukuronidaz / arilsülfataz 150 birim (85.000 ünite / ml stok 1.8 uL) ilave edilir ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edilir. soğuk metanol 250 uL ilave ederek reaksiyonu durdurun (-20 ° C). ayrıca, -20 ° C ya da işlem numuneler saklayın.
- 45 ° C'de bir vakum santrifüj kullanılarak çözücü buharlaşır. su çözeltisi:% 30 asetonitril, 500 uL numune yeniden oluşturun. Numuneler kütle spektrometre analizi için hazır ve amber glass viyaller içinde -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Kütle Spektrometre tabanlı ölçüm
NOT: Tüm UPLC ve kütle spektrometresi ayarları adanmış Ek Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. kantitatif analiz için, bir kalibrasyon eğrisinin oluşturulması gereklidir. calititreşimlerin eğrisi nicelendirilecek bileşiğin bilinen bir seyreltme aralığı çalıştırarak elde edilir. Bu durumda, kalibrasyon eğrileri, doğrusal aralığı 19 ile 20% arasında olmalıdır ve en az 6 olan 10 farklı konsantrasyonda (Tablo 2), üzerinde oluşturulmuştur. algılama düşük seviyede bir sinyal daha büyük veya ortalama arka plan sinyalini 3x eşit veren en düşük konsantrasyon olarak belirlenmiştir. miktar en düşük seviyesi 10x üçlü numuneler, en az 3 bağımsız çalışır üzerinde tespit edilir, her ikisi de ortalama arka plan sinyali bir sinyal büyük veya buna eşit veren en düşük konsantrasyon numunesi olarak belirlenir.- Iç standart, Tablo 2'ye göre, doku kültürü ortamında, bir sentetik metabolitin bir seri seyreltme hazırlayın. Standart seyreltme için 250 uL lik bir nihai hacim yeterlidir.
- st de tarif edildiği gibi standart seri dilüsyonları buharlaştırılmakta% 30 asetonitril hacimde ep 2.1.2.4 ve tekrar süspansiyon: Ortam önce buharlaştırma hacmine su eşdeğeri (örneğin, 250 uL% 30 asetonitril: Başlangıç standart çözelti ortamının 250 uL ise su).
- UPLC-MS otomatik numune alıcı içinde enjeksiyon için bir amber UPLC cam şişeye, her seri seyreltme standart 250 uL ekleyin.
- UPLC şişeleri amber ve UPLC otomatik numune alıcı bunları yerleştirmek için test örneklerini (250 ul) ilave edin.
- Bütün şişeleri rastgele hale getirin.
Not: Kullandığımız kütle spektrometresi yapılandırma Ek Tablo 1 'de ayrıntılı bir UPLC bağlanmış hibrid üçlü dört / lineer iyon tuzağı kütle spektrometresidir. Diğer platformlar farklı yazılım ve yapılandırma olurdu ama kantifikasyonunu gerçekleştirmek için benzer adımları takip edecek. - Ölçmek için spesifik sonda bağlı Ek Tablo 1'de ayrıntıları ayarlar kullanılarak UPLC-MS çalıştırın.
- kullanım"Miktarını - kantitasyonu yöntemi oluşturma" kütle spektrometresi ölçüm araçlarının aracı (Malzeme Tablosu) alınan sentetik standart ve iç standart kalibrasyon eğrisi oluşturmak için.
- ölçmek ve "Kantifikasyonu Yöntemi" yürütmek için örnek toplu ve örnekleri seçmek için "Kantifikasyonu Sihirbazı" kullanın. Kütle spektrometresi miktar yazılımı her test numunesinde hedef bileşik kantitatif değerleri ile bir elektronik tablo gösterir.
- Lüminesans göre yöntemler kullanılarak problar
NOT: lüminojenik sondalar CYP bir dizi etkinlik ölçmek için ticari olarak mevcuttur; Ancak, tüm hücre bazlı deneyler için de uygundur. Burada, bir protokol CYP1A1 / CYP1B1 aktivitesini ölçmek için sunulmuştur. CYP1A1 / 1B1 uyarılabilir CYP'ler aktivitesini analiz etmek için ve bir alter olarak kullanılabilir kadar lüminojenik probları bir örnek vermek üzere nasıl göstermek üzere seçildikütle spektrometrisi bazlı yöntemler doğal. Tablo 3, hava yolu hücreleri ve karaciğer hücre hattı için kullanılan konsantrasyonlar ve inkübasyon süresi özetler; Bununla birlikte, bu diğer hücre tipleri için adapte edilmesi gerekebilir. Diğer lüminojenik problar ticari olarak elde edilebilir ve CYP'ler çeşitli alt-tabakalar olarak da kullanılabilir.- olmayan bir kaynaklı kontrol, indüklenen testi ve bir uyarılan + önleyici testi dahil etmek için yeterli hücrelerin hazırlanması. Bir plaka taslağına bir örneği, Şekil 5B'de gösterilmektedir.
- CYP1A1 / 1B1 indükleyen (de uygun olabilir, 24 ila 48 saat daha kısa süreler) karışımı 72 saat bir süre için ortam içinde 10 nM TCDD bir son konsantrasyona sahip hücrelerin inkübe etmek.
DİKKAT: TCDD kanserojen ve teratojendir. Yeterli koruyucu ekipmanları kullanın tedarikçisi MSDS sayfasını inceleyebilir ve kullanılmadan önce bir risk değerlendirmesi yapmak. - Bu süre sonunda, ortam maddesinin ayrılması PBS ile 3 kez kuyu durulayın ve bazı taze ortam ilave edin.
- Prior lüminojenik raportör probu ile inkübe etmek, ortam içinde, 10 uM CYP1A1 / 1B1 inhibitörü, α-naphthoflavone bir son konsantrasyona sahip 30 dakika boyunca indüklenen hücre belirlenen alt kümesi önceden inkübe edin.
- uyarılmamış indüklenen ve uyarılmış + önleyici hücrelere 50 uM bir nihai yoğunlukta lüminojenik prob LUC-CEE (luciferase 6'-kloroetil eter) ekleyin.
- bir hücre kültürü inkübatöründe 4 saat süreyle inkübe edin. İnkübasyon süresi sonunda, lüminojenik sondanın ölçümü için orta toplar.
- Transfer işlemi, 25, beyaz bir opak 96 delikli plakaya kültür ortamının uL ve üretici tarafından sağlanan lusiferin belirleme reaktifinin 25 uL ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Hemen bir luminometre kullanılarak plakayı okuyun.
- Hücrelerin PBS ile durulayın ve toplam protein miktarının belirlenmesi için lize.
NOT: Canlı hücreler gelecek deneyler için tutuluyorsa Bu adım isteğe bağlıdır. benT, TCDD olarak uyarıcılar zehirlidir ve hücrelere zarar olacağını da belirtmek önemlidir.
- Kütle Spektrometresi göre yöntemler kullanılarak problar
Tablo 1: onların Sorumlu Enzim ile Metabolik Probes'dan, Ürünler ve İnhibitörleri listesi. Molekül ağırlığı ve hava ve karaciğer hücreleri ile kullanılan önerilen konsantrasyonları da belirtilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Önerilen 24 oyuklu plaka Düzeni eden bir CYP tahlilin gerçekleştirilmesi için. (A), esas olarak ifade CYP'ler önerilen düzen boş ortam deliklerin bir dizi içerirMetabolik prob ve metabolik prob şeklinde ifade edilmektedir. Bu düzen test ediliyor zaman noktalarının sayısına göre çoğaltılabilir. (B), uyarılabilir CYP'ler örneğin düzeni orta boşluğu için de bir dizi, bir metabolik prob (TCDD ile, örneğin), yalnızca kontrol uyarılan hücreler, sondalar ile inkübe edilir ve problar ve bir inhibitör ile inkübe içerir.
Tablo 2: Kalibrasyon eğrilerinin ve İlgili LODs ve LOQs için kullanılan sentetik standartlar seyreltilmesi. kullanmak için seyreltme aralığı kütle spektrometresi platform ve hassasiyetine göre değişiklik gösterebilir. Burada, bir UPLC bağlanmış bir hibrid üçlü dört / lineer iyon tuzağı kütle spektrometresi kullanılır. Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınrakam.
Tablo 3: lüminojenik Probe, CYP1A1 için indükleyici ve önleyici / 1B1 Deneyi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Representative Results
Üç farklı vericiden (hava yolu M360, M370, M417) ve karaciğer hücre çizgisi (Hep hattı) ', hava yolu hücre kültürlerinde iki CYP'ler çiftleri (CYP1A1 / 1B1 ve CYP2A6 / 2A13) için ölçülen metabolik aktivite örnekleri Şekil 6'da gösterilmiştir 20.
CYP aktivitesi luminometri ile ölçüldüğü
Şekil 6A, hava yolu hücreleri Luc-CEE (luciferase 6'-kloroetil eter) (3 donör) ile TCDD uyandırılmadan karaciğer hücrelerinin CYP1A1 / 1B1 O-dealkilasyon aktivitesi ile üretilen göreli lüminesans gösterir. CYP1A1 / 1B1 yüksek oranda indüklenebilen enzimlerdir ve tipik olarak çoğu dokuda bir kurucu seviyede ifade edilmez. Hücreler uyarılmış zamanlarda Şekil 6A'da görüldüğü gibi, herhangi bir lüminojenik sinyali tespit edilmiştir. Her iki hücre tipi TCDD, güçlü bir CYP1A1 / 1B1 indükleyici, bir işareti ile önceden inkübe edildiğindeed lüminojenik sinyal kontrol (Şekil 6A) kıyasla tespit edilir. Bu Luc-CEE prob sonra ölçülür lusiferin parçasının serbest bırakılması için lider metabolize olduğunu gösterir. Genel TCDD tedavi karaciğer hücre çizgisinden aktivitesi daha toplam protein normale döndükten sonra, hava yolu hücreleri için daha düşüktür. hücre hatları birincil hücreler daha az metabolik olarak aktif olma eğilimi beri bu olağandışı değil. α-naphthoflavone eklenmesi daha Luc-CEE metabolizmasının CYP bağımlılık teyit tüm hücre tiplerinde CYP1A1 / 1B1 aktivitesi üzerinde açık inhibitör etkisi vardır.
UPLC-MS kullanılarak CYP450 Metabolitlerin miktarlarının hesaplanması
Şekil 6B inhi mevcudiyetinde kumarin ve yokluğu ile inkübe edildikten sonra 3 vericiden (Hava M343, M345, M347) ve hepatik hücreleri (Hep hattı) alınan hava yolu hücrelerinde CYP2A6 / 2A13 aktivitesinin ölçümü göstermektedirbitor 8-metoksipsoralenden. Veri Toplam protein için normalleştirilir. 0 dak kumarin inkübasyon kontrolünde, bir 7-hidroksikumarin (Şekil 6B) tespit edilir. CYP2A6 / 2A13 bazı dokularda temel olarak ifade edilir ve 7-hidroksikumarin bir kumarin oluşumu ile, bu nedenle daha sonra 16 saat kuluçka da indüksiyonu olmadan, test edilen farklı hücre tiplerinde tespit edilir. 8-metoksipsoralenden zaman, CYP2A inhibitörü (Şekil 6B), 7-hidroksikumarin oluşumu önemli ölçüde azalır ilave edilir.
Inhibisyon nadiren tamamlanır tamamlanmaz ve diğer CYP da substratı tanıması ama çok daha az verimli bir şekilde işlemek mümkün olabilir çünkü CYP inhibitörü varlığında, hala bazı kalıntı aktivite tespit etmek normal olduğunu belirtmek gerekir. Aynı zamanda, hava yolu hücrelerinde CYP2A6 için görülebildiği gibi, birincil hücreleri kullanıldığında kaydedilen metabolik aktivite, donörler arasında farklı olabilir gözlemlenebilir(Şekil 6B). Bu CYP aktivitesi her donör genotipi ve polimorfizmleri yükümlü olduğu tahmin edilmektedir.
Şekil 6: Aktivite Deneyi CYP1A1 için sonuç / 1B1 aktivite (A) ve hepatik Hücre Hattı ve üç Havayolu hücre vericileri (M360, M370, M417) içerisinde CYP2A6 / 2A13 aktivitesi (B). (A) Luc-CEE dealkilasyon aktivitesi ile TCDD CYP1A1 / 1B1 indüksiyonu olmadan gösterilmiştir. α-naphthoflavone CYP1A1 / 1B1 inhibitörü olarak kullanılmıştır. Etkinlik dakika (dak) inkübasyon süresi ile normalize, göreli ışık birimi (RLU), ve toplam protein (mg) olarak ifade edilir. Bunlar temel olarak ifade edilmiştir (B) olarak CYP2A6 / 2A13 indüksiyon gerektirmez. pmol / dak / mg protein olarak Kumarin 7-hidroksilasyon aktivitesi ile ve inhibitör 8-methoxypsor olmadan farklı zaman noktalarında gösteriliralen. Tüm sonuçlar ortalamanın standart sapma ile üç bağımsız ölçümün ortalama değeri olarak sunulmuştur. Bu şekil, Baxter 20 modifiye edilmiştir.
Ek Tablo 1: UPLC ve Kütle Spektrometre Ayarları. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Discussion
Şu anda, bir çok standart toksikolojik test sistemleri, normal insan metabolizmasının 1 temsilcisi değildir işlenmiş bakteri, hücre soylarını ya da embriyonik hücreleri kullanır. Bu kimyasal veya tıp potansiyel toksik aktivitesinin yanlış tahminler yol açabilir. Bu tür bir çip üzerinde 3D hücre kültürleri ve organ olarak vitro modellerde, yenilikçi, daha insan dokuları 21, 22, 23, normal morfoloji ve metabolik aktivite çoğaltmak için bir girişimde geliştirilmektedir. Metabolik yetkinlik modelleri iyi toksikolojik değerlendirme ve ilaç biyolojik dönüşüm çalışmaları için uygun olan deşifre kullanılabilen bir kriterdir.
Bu yazıda ana hatlarıyla protokol canlı hücreler kullanılarak CYP enzimlerinin aktivitesini ölçmek için tasarlanmıştır. Esnek ve 2D veya 3D KÜLTÜR farklı hücre sistemleri için kullanılabilires ve lüminojenik Probe veya kütle spektrometresi tabanlı yaklaşım kullanma seçeneğiniz mevcuttur. Her iki yöntem de malzeme nanogram miktarlarda algılar ve sadece çok oyuklu formatta yetiştirilen hücreler az sayıda gerektirecek kadar hassastır. Ayrıca küresel, uygulanabilir veya hücreler karmaşık matrisler içinde büyütülmüştür. prob substratın seçimi tabii ki protokol önemli bir unsurudur. Analizin özgüllüğü seçici CYP inhibitörü kullanılması ile elde edilebilir CYP enzim ve güvence başka bir katman seçici olan prob dayanır. alt-tabakalar ve bu yazıda belirtilen inhibitörleri sadece birkaç örnektir, fakat diğerleri literatürde bulunabilir.
Enzim, düşük bir seviyede ifade edilen bağlı olabilir negatif CYP aktivitesi sonucunda yeni bir hücre tipi ile çalışan birden çok uzun kuluçka süresi dikkate alınması önemlidir. Bir pozitif kontrol olarak kullanılan bir hücre tipinin eklenmesi, söz konusu a sağlamak için tavsiye edilirNegatif sonuç teknik bir sorun ve herhangi sorun gidermeye yardımcı ile bağlantılı değildir. Primer hepatik hücreler metabolik olarak yeterlidir ve süspansiyon içinde örneğin birincil hepatositler için, kontrol olarak kullanılabilir kullanımı çok kolay olan fakat bunların canlılığı zaman içinde sınırlıdır. Karaciğer hücre çizgileri bu protokolde tarif edildiği gibi kullanımı nispeten kolaydır olası alternatifleri vardır, ama bazı metabolik aktivite 6, 21 açısından, diğerlerinden daha iyi olduğu.
Deney toplam protein miktarı olmadıkça, yıkıcı olmayan, olduğu için, uzunlamasına çalışmalarda 20, zaman içinde CYP aktivitesi takip etmek mümkündür. Bazı hücreler kültürde zamanla değişken CYP aktivitesini olacak, çünkü bu önemli bir noktadır. Negatif bir sonuç, in vitro olarak farklılaşma ya da farklılaşmanın giderilmesi ile birleşmeye eksikliği, ilerleme ile ilişkili olabilir. Bu durumda, bu yaklaşım, yarı kantitatif bir olduğuVeriler, her hücre kültürü içinde protein toplam miktarına göre normalize değildir çünkü ettik. TCDD için olduğu gibi doku üzerinde toksik bir etkiye sahip olabilir probları, inhibitörleri, veya teşvik edicilere maruz kalma gibi CYP aktivitesinin ölçülmesi sonra doku yeniden her zaman mümkün değildir ya da önerilmez.
gibi mikrozomlar gibi hücre fraksiyonları, aynı zamanda, belirli bir hücre tipinin, CYP aktivitesinin karakterize edilmesi için kullanılabilir. Mikrozomal preparasyonlar, bununla birlikte, hücre malzemesi, uygun eş-faktörlerin eklenmesi bir çok ihtiyaç ve enzimler aktif kalmasını sağlamak için tampon. canlı hücreleri kullanarak zor mikrozom hazırlık aşamasını ortadan kaldırır ve tamponlar ve ko-faktörler en çok hangi çalışma dışarı.
Genel bir öneri olarak, ayrıca, enzimatik aktivitesini aynı olduğunu doğrulamak için, hücre kültürlerinde CYP'ler ekspresyon profilini karakterize etmek için en iyi yöntemdir. doğrulama Bu ek seviye metabolik sondalar Enti olmadığını verilmiş tavsiye edilirTek bir CYP özgü bel ve ölçülen metabolik aktivitesi, ilgili enzim ekspresyonu ile eşleştirilir artan bir güven vermektedir. CYP zar proteinlerini olduğu bu nedenle nicel RT-PCR, bu enzimleri 20 profil tercih edilen bir yaklaşım olmuştur, Western blotlar için hazırlamak için nispeten zordur.
Protokol, tek önemli bir şekilde de olsa, metabolik enzimlerin bir ailesini temsil eder deney CYP enzim aktivitesi için bir yöntem açıklanır dikkat etmek önemlidir. Bir kütle spektrometresi yaklaşımın esnekliği prob substratlar diğer metabolik dönüşümler için satın alma yöntemlerinin geliştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, bu bir anda geliştirilecek ve şu anda bilinen daha az spesifik problar ve diğer metabolik enzim ailesi için seçici inhibitörler vardır. Bu boşluk, in vitro hücre sistemlerin t metabolik yeterlilik kapsamlı bir değerlendirme sağlamak için ele alınmalıdırMS.
Disclosures
AB ve EM bu el yazması yazılmıştır anda British American Tobacco çalışanları edildi. Bu yazıda anlatılan çalışma British American Tobacco tarafından finanse edildi ve bu video yazı için yayın ücreti British American Tobacco tarafından ödendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent & Cells | |||
| 2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
| 5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
| 6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
| 6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
| 7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
| 7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
| 8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
| acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
| α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
| BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
| Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
| Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
| chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
| collagen | Cell Systems | 5005-B | |
| coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
| disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
| fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
| Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
| HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
| HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
| HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
| Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
| methanol | Fisher | M/4056/17 | |
| MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
| MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
| Phenomenex Kinetex 2.6 μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
| TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
| thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
| Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm 2.1 x 50 mm | Waters | 86003538 | |
| Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UPLC | Waters | Acquity | |
| QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
| QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
| luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
| rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |
References
- Garcia-Canton, C., Minet, E. Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).
- Croom, E.
- Lewis, D. F. 57 varieties: the human cytochromes P450. Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).
- Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. Phase II drug metabolizing enzymes. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, Olomouc. Czech. Repub. 103-116 (2010).
- Dekant, W. The role of biotransformation and bioactivation in toxicity. EXS. 99, 57-86 (2009).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).
- Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers. Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Kuehn, D., et al. Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke. J. Vis. Exp. , (2015).
- Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).
- Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2. Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).
- Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).
- Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico. Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).
- Kartha, J. S., Yost, G. S. Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes. Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).
- Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).
- Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1. Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).
- Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli. Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).
- Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements. RSC Analytical Methods Committee. , Available from: http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf (2013).
- Baxter, A., et al. Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia. Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).
- Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs. Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).
- Li, Z., et al. Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip. Integr. Biol. 8, Camb. 1022-1029 (2016).
- Takahashi, Y., et al. Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Biosci. Rep. , (2015).
