Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Тандем жидкостной хроматографии на основе подхода для анализа метаболитов Published: March 28, 2017 doi: 10.3791/55558
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Summary

Здесь мы опишем протокол для экстракции метаболитов из золотистого стафилококка и их последующего анализа с помощью жидкостной хроматографии и масс - спектрометрии.

Abstract

В попытке сорвать бактериальные патогены, хозяева часто ограничивают доступность питательных веществ в месте инфекции. Это ограничение может изменить содержания ключевых метаболитов, которые регуляторные факторы отвечают, регулируя клеточный метаболизм. В последние годы ряд белков и РНК стали важными регуляторами экспрессии генов вирулентности. Так, например, белок Cody реагирует на уровни разветвленных аминокислот и ГТФ и широко сохраняется в условиях низкой G + C грамположительных бактерий. В качестве глобального регулятора в стафилококк, Cody контролирует экспрессию десятков вирулентности и метаболических генов. Мы предполагаем , что золотистый стафилококк использует Коди, в частности, для изменения его метаболического состояния в целях адаптации к питательным ограничивающим условиям , потенциально встречающимся в принимающей среде. Эта рукопись описывает способ экстракции и анализа метаболитов из золотистого стафилококка с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с масс - спектрометрическихtrometry, протокол, который был разработан, чтобы проверить эту гипотезу. Метод также подчеркивает лучшие практики, которые будут обеспечивать строгость и воспроизводимость, такие как поддержание биологического устойчивого состояния и постоянная аэрации без использования непрерывных культур хемостатических. По отношению к USA200 метициллин-чувствительных золотистого стафилококка изолировать UAMS-1 родительского штамма, изогенных Cody мутант показал значительное увеличение аминокислот , полученных из аспартата (например, треонин и изолейцин) и уменьшается в их предшественников (например, аспартат и О -acetylhomoserine ). Эти результаты хорошо коррелируют с данными , полученными транскрипционных с РНК-сл анализа: гены в этих путей были повышающей регуляции между 10- и 800-кратного в нуль - мутанта Cody. Сцепление глобальных анализов транскриптома и метабол может показать, как бактерии изменяют свой метаболизм, когда сталкиваются с экологическим или питательным стрессом, обеспечивая потенциальное понимание в Physiological изменения, связанные с истощением питательных веществ испытали во время инфекции. Такие открытия могут проложить путь к разработке новых антибактериальных и терапевтических средств.

Introduction

Бактериальные патогены должны бороться со многими проблемами в пределах принимающей среды. В дополнении к прямой атаке иммунных клеток, хозяин также изолирует питательные вещества , необходимые для выживания бактерий и репликации, генерирующие питательная иммунитета 1, 2. Чтобы выжить эти враждебные среды, бактериальные патогены развертывания факторов вирулентности. Некоторые из этих факторов позволяет бактериям уклоняться от иммунного ответа; Другие факторы включают секретируются пищеварительные ферменты, такие как гиалуронидаза, thermonuclease, и липазы, которые могут позволить бактерии пополнить недостающие питательные вещества, потребляя ткани , полученные составляющие 3, 4, 5. В самом деле, бактерии развивались регуляторные системы , которые связывают физиологическое состояние клетки к продукции факторов вирулентности 6, 7, до класса = "внешних ссылок"> 8, 9, 10.

Все больше данных указывает на Коди в качестве критического регулятора, связывающего обмен веществ и вирулентность. Несмотря на то, впервые обнаружен в Bacillus зиЫШз как репрессор гена 11 дипептид пермеазы (ДПП), Cody теперь известно, производится почти всеми низкими G + C , грам-положительных бактерий , 12, 13 и регулирует множество генов , участвующих в угле и азота , метаболизм 14, 15, 16, 17, 18, 19. В патогенных видов, Cody также контролирует экспрессию некоторых из наиболее важных генов вирулентности 20, 21,. эф "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody активируется в качестве белка ДНК-связывающего два класса лигандов: с разветвленной цепью аминокислот (ВСАА; изолейцин, лейцин и валин [РКН]) и ГТФ . Когда эти питательные вещества в изобилии, Cody репрессирует (или в некоторых случаях, стимулирует) транскрипцию. Поскольку эти питательные вещества становятся ограниченными, активность Cody постепенно уменьшается, что приводит к градуированному транскрипционному ответу, который перенаправляет предшественник с помощью различных метаболических путей, связанных с центральным метаболизмом 28, 29, 30.
Тандем жидкостной хроматографии в сочетании с масс - спектрометрией (ЖХ-МС) представляет собой мощный метод , который может точно определить и количественно малые молекулы внутриклеточных метаболитов 31. В сочетании с Закавкriptome анализ (например, РНК-Seq), этот аналитический рабочий процесс может дать представление о физиологических изменениях , которые происходят в ответ на экологический или питательный стресс. Здесь мы представляем метод для экстракции метаболита из клеток золотистого стафилококка и последующего анализа с помощью LC-MS. Этот подход был использован для демонстрации плеотропных эффектов Кодьте на золотистом стафилококке физиологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление буферных растворов

  1. Подготовка фосфатно-солевого буфера (PBS,; рН 7,4) путем разбавления исходного раствора 10х PBS до конечной концентрации 1х с сверхчистых (дистиллированной и деионизированной) водой.
  2. Готовят раствор закалки путем объединения 2 мл ацетонитрила, 2 мл метанола, 1 мл сверхчистой H 2 O и 19 мкл (конечная концентрация 0,1 мМ) муравьиной кислоты.
  3. Подготовка ВЭЖЙ-МС растворителя А путем добавления муравьиной кислоты (0,2% [об / об] конечной концентрации) для сверхчистой воды.
  4. Подготовьте LC-MS растворитель В добавлении муравьиной кислоты (0,2% [об / об] конечной концентрации) в ацетонитриле.
    Примечание: Все растворы должны быть приготовлены с использованием реагентов высшей чистоты доступны (как правило, высокоэффективной жидкостной хроматографии класса). Растворы должны быть приготовлены свежие перед каждым экспериментом и хранили на льду до использования.

2. Установление стационарного роста золотистого стафилококка

  1. Серия С. aureuые штаммы , представляющий интерес для изоляции на трипсин соевого агара (TSA) из замороженного раствора в глицерине. Инкубируют при 37 ° С в течение 16-24 ч.
  2. Инокулируйте 4 мл трипсина соевого бульона (ТСБ) или другую подходящей среду в стерильных стеклянных пробирках с инкубационными отдельными колониями каждого штамма. Инкубируйте склонны (~ 70 ° угол) с вращением на 60 оборотов в мин (оборотов в минуту) при 37 ° С в течение 16-20 ч.
    Примечание: Ночные культуры склонны к кислородным градиентам при использовании стандартных методов, в том числе тех, которые описаны на стадии 2.2, которые влияют на клеточную физиологию. Таким образом, мы используем несколько стратегии обратного разбавления для обеспечения биологического устойчивого состояния (см шагов 2,4-3,2 ниже).
  3. С помощью спектрофотометра для измерения оптической плотности культур со стадии 2,2 при 600 нм (OD 600). Используйте стерильную среду в качестве оптических ссылок (пустые). Развести эти клетки к OD 600 0,05 в 50 мл стерильной среды TSB (предварительно нагревают до 37 ° С) в отдельном, 250 мл колб DeLong.
  4. INCUBATE культуры при 37 ° С в водяной бане при встряхивании при 280 оборотах в минуту.
  5. Каждые 30 мин, принимают OD 600 измерений; по мере увеличения оптической плотности, может оказаться необходимым, чтобы разбавить культуры с TSB, так что они остаются в пределах линейного диапазона поглощения спектрофотометра.
  6. Когда культуры со стадии 2.5 достижения OD 600 ~ 0,8-1,0, субкультивирования их в 50 мл 37 ° C TSB к OD 600 0,01-0,05 и повторите шаги 2.4 и 2.5.

Настройка Collection 3. Образец

  1. Подготовьте слой измельченного сухого льда в соответствующем сосуде (например, стекло тарелки, ведро льда, или холоднее).
  2. Поскольку оптические плотности культур приближаются к желаемой точке сбора урожая, добавляют 1 мл закалки раствора до 35 мм необработанной чашки Петри и предварительно остыть на сухом льде в течение ≥5 мин.
    Примечание: «искомая точка урожая» будет варьироваться в зависимости от экспериментальных целей. Например, если бы нужно было изучить мetabolites во время аэробного роста, основные показатели этого состояния включают ацетат экскрецию и повторное усвоение ацетата во время поста-экспоненциальной фазы роста 32, 33. Как правило, эта точка должна быть в пределах стадии конкретных роста (например, экспоненциальная фаза). Конкретный OD 600 значения , связанное с этой стадией может варьироваться от различных бактериальных штаммов и ростовой среды.
  3. Поместите фильтр из нержавеющей стали фритты (предварительно охлажденного до -20 & deg; C) в резиновой пробке и поместить его на вершине вакуумной колбы, прикрепленной к вакуумной установке или вакуумному насосу.
  4. Применение вакуума и поместить смешанный сложный эфир целлюлозы мембрану (размер пор 0,22 мкм) на вершине.
    Примечание: Очень важно, чтобы использовать фильтр с диаметром, равным, что фритты и правильно центрировать этот фильтр, чтобы гарантировать, что образец проходит через фильтр, а не через край. Смачивание мембраны с ледяной стерильной H 2 O может помочьс позиционированием мембраны.

4. Пример Harvest

  1. При OD 600 из ~ 0,4-0,5, используют серологические пипетки для удаления 13 мл культуры из колбы и применить образец к фильтру.
  2. После того, как весь образец был отфильтрован, немедленно промойте фильтр ≥5 мл охлажденного льдом PBS, чтобы смыть средние ассоциированные метаболиты.
  3. Отсоединить вакуум и использовать пару стерильных пинцетов, чтобы удалить фильтр из фритты. Invert фильтра (ячейки стороной вниз) в предварительно охлажденный раствор резкого охлаждения.
    Примечание: Важно , чтобы выполнить указанные выше шаги быстро (т.е., в течение нескольких секунд) , и , как только жидкость была удалена , чтобы обеспечить быстрое тушение клеток, арестовав метаболическую активность.
  4. Инкубируйте фильтр в растворе на закалочном сухом льде в течение ≥20 мин.
  5. С помощью стерильных пинцетов, инвертировать фильтр (клеточно-стороной вверх) в чашку Петри и использовать микропипетки, чтобы промыть клетки прочь тон мембраны в раствор закалочной.
  6. Повторно суспендируют клетки в закалочной растворе, а затем передачи клеточной суспензии в стерильную 2 мл ударопрочного пробирку, содержащую ~ 100 мкл шариков кремнезема 0,1 мм. Хранить это на сухом льду или при температуре -80 ° С.

5. Метаболит Экстракция

  1. Оттепель образцы на льду и разрушения клеток в гомогенизаторе с четырьмя 30 с очередями при 6000 оборотах в минуту, с 2 мин охлаждения периодов на сухом льду между циклами.
  2. Уточнение лизаты в течение 15 мин в предварительно охлажденном, охлажденном микроцентрифуге при максимальной скорости (т.е. 18213 XG при ≤4 ° С).
  3. Передача супернатант в чистую пробирку микроцентрифужных.
  4. С помощью микропипетки, передать небольшую часть образца в микроцентрифужных трубки для количественного определения остаточного содержания пептида на стадии 6; хранить остаток при -80 ° С.
    Примечание: Объем зарезервированного образца варьируется, в зависимости от анализа BCA, используемого на стадии 6.1. ЭтаОбразец должен быть сохранен на мокром льду для немедленного анализа или замораживали при -80 ° С.

6. бицинхониновой кислоты (ВСА) Анализ

  1. Провести анализ BCA в соответствии с рекомендациями производителя набора, с использованием образцов, начиная с шага 5.4 для определения остаточной концентрации пептида для каждого образца.

7. ЖХ-МС

  1. Смешайте 75 мкл золотистого стафилококка экстракта с 75 мкл LC-MS растворителя В, полученного на стадии 1.4.
  2. Вихревой смешивать и спина при 13000 х г в течение 5 мин.
  3. Поместите 100 мкл надосадочной жидкости в жидкостной хроматографии (LC) флакона и колпачка его. Убедитесь в том, что пузырьки воздуха не попали в выборку.
  4. Загрузите LC ампулы на автосамплер LC-MS и редактировать список бегов в программе «Offline Worklist Editor.»
    1. Заполните "Sample Name" (например, дикого типа 1), "Sample Position" (например, P1-A1), "Метод" (например, муравьинаячид-Negative метод), и "Файл данных" (например, дикий тип-1) столбцы. Нажмите кнопку кнопку «Сохранить Worklist». Откройте программу «Масс-спектрометрия Data Acquisition Workstation» и введите сохраненный ранее рабочего списка. Нажмите кнопку «Пуск Worklist Выполнить», чтобы начать непрерывное измерение LC-MS.
  5. Отдельные образцы на колонке, связать столбец к времени пролета (TOF) спектрометра и пара в TOF-спектрометр с системой LC. Используйте градиент подвижной фазы следующим образом: 0-2 мин, 85% растворитель В; 3-5 мин, 80% растворителя В; 6-7 мин, 75% растворитель В; 8-9 мин, 70% растворителя В; 10-11.1 мин, 50% растворителя В; 11.1-14 мин, 20% растворитель В; и 14.1-24 мин, 5% растворителя В; конец с 10 - минутного периода повторного уравновешивания при 85% B растворителя и скорости потока 0,4 мл мин - 1.
  6. Используя изократический насос, влить эталонные массовый раствор с ходом , чтобы позволить для одновременной калибровки масс - оси.
    Примечание: Этот шагна основе стандартного TOF спектрометра руководства.
    1. Использование смеси уксусной кислоты D4 и гексакис (1Н, 1Н, 3Н-тетрафторпропокси) phosphazine в качестве раствора контрольной массой для выполнения калибровки в режиме реального времени. Используйте изократический насос со скоростью потока 2,5 мл мин -1 для инфузии.

8. Пакетный Коррекция ионных графов

  1. Назначают любой образец , чтобы служить в качестве эталонного образца для коррекции партии (например, дикого типа, реплицировать 1).
  2. Вычислить сумму отсчетов ионов для всех метаболитов в пределах эталонного образца. Повторите этот расчет для всех образцов.
  3. Разделить общее количество ионов каждого образца по общему количеству ионов эталонного образца, чтобы сгенерировать соотношение.
  4. Разделить количество ионов для каждого метаболита в образце путем выборку / опорный коэффициентом для получения пакетного скорректированного подсчета ионов для каждого метаболита.

9. Пептид Нормализация

  1. Divide пакетных скорректированных значений подсчета ионов для каждого образца, полученного на стадии 8 с помощью концентрации пептида, определенной с помощью анализа BCA на стадии 6 с получением нормализованного значения для каждого метаболита.
    Примечание: Нормированные, периодического действия периодического действия корректируется ионов счета для каждого метаболита , полученного на стадии 9.1 , можно непосредственно сравнивать между штаммами и подвергали статистическому анализу (например, Манна-Уитни U -теста). В качестве альтернативы, метаболит, как известно, неизменным либо лечения или генетического фона могут быть использованы в качестве нормализатора для обнаружения изменений вследствие метаболита разложения. Включение известного количества L-норвалина или gluraric кислоты в буфере для экстракции может быть использовано для корректировки потери в процессе обработки образца 34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы провели анализ внутриклеточных пулов метаболита в золотистого стафилококка в процессе роста в пробирке в богатой, сложной среде. В качестве доказательства принципа, мы сравнили метаболит профили между метициллиночувствительным золотистым стафилококком остеомиелитом изолировать UAMS-1 (дикий типа [WT]) и изогенный штамм , в которых отсутствует глобальный регулятор транскрипции Cody (Δ Cody) 26. Стационарное, экспоненциальные культуры штаммов дикого типа и Cody были созданы в TSB среде, как описано в стадии 2 протокола. Поведение роста дикого типа и мутантных Cody -null культур были сходными, только с умеренными различиями в доходности роста и скорости (диаграмма 1). Используя РНК-Seq и технологию микрочип, мы и другие показали , что множественные гены , кодирующие ферменты , участвующих в биосинтезе аминокислот , полученных из аспартаты были де-репрессированы в Cody -null мутанта сompared к клеткам WT в процессе роста в пробирке в TSB (рисунок 2) 25, 27, 30. Кроме того, brnQ1 и brnQ2, которые кодируют пермеаз с разветвленной цепью аминокислот, которые избыточно экспрессируется в codY- нуль - мутанта 30, 35.

Для того, чтобы определить, в какой степени стационарные внутриклеточные Содержания метаболитов, ассоциированных с этого пути изменяются в нуль-мутанта, мы провели ЖХ-МС на основе метаболита профилирование. WT и codY- нулевые мутантные клетки выращивали до биологического стационарного состояния и отбирали , как описаны в пункте 4 протокола. Мы определили метаболит содержаний пути интегрирования площади пики ионов интенсивности для каждого хроматографическим разрешенного метаболита с использованием аналитического программного пакета (см списка материалов). Мы исправили для диффerences биомассы путем нормализации метаболита содержаний до остаточной концентрации пептида каждого образца. Кроме того, мы исправлены эти значения для потенциальных эффектов пакетных между образцами путем вычисления среднего количества ионов для всех метаболитов в пределах каждого образца и с использованием образца дикого типа в качестве опорного значения. Такой подход позволил между выборочными сравнениями метаболита содержаний через условие. Inter-метаболит сравнения в пределах данного образца аналогичным образом может быть достигнуто путем предварительного преобразования нормализованных содержаний метаболита из подсчета ионов в мол рных количествах с использованием метода стандартных добавок.

Мы сравнили уровни ключевых интермедиатов в аспартат пути в UAMS-1 и его codY- нуль - мутанта. Как видно на рисунке 3, конечные продукты этого пути (например, треонин и (изо) лейцин) являются более распространены в Cody -null мутантных клеток, в то время как предшественники (например,аспартаты и о ацетил- гомосерин) являются более распространены в клетках дикого типа . В сочетании повышающая регуляция BrnQ пермеаз 36 и путь биосинтеза РКН , вероятно , приводит к увеличению изолейцин и лейцин 30. Хотя различия относительно малы (<4-кратный), ЖХ-МС на основе количественного и коррекции партии выявить устойчивые и статистически значимых изменений, которые согласуются с транскрипционных изменений, опосредованных Cody.

Рисунок 1
Рисунок 1: поведение роста золотистого стафилококка UAMS-1 и изогенное Cody -null мутант в TSB. Для того, чтобы продлить время клетки , проведенную в стационарном экспоненциальном росте, культуры были обратно-разводили до оптической плотности 0,05 в свежей среде после того, как предварительные культуры достигли OD 600 ~ 1. Образцы для анализа метаболита ЖХ-МС были собраныиз экспериментальных культур при оптической плотности ~ 0,5 (стрелки). Приведенные данные представляют три биологических повторностей.

фигура 2
Рисунок 2: Схема выбранных метаболитов , полученных из аспартата. Гены и оперонов, продукты катализируют синтез аспартат семейства аминокислот, которые указаны курсивом; увеличение транскрипта в изобилии -null мутанта Cody по сравнению с диким типом, как определено с помощью РНК-сл анализа 29, также отмечено. ДГП, 2,6-diaminoheptanedioate (2,6-диаминопимелатдегидрогеназа).

Рисунок 3
Рисунок 3: содержания метаболитов в семье аспартат изменяются в мутанте Cody. В -кратных изменения журнала 2 отдельных метаболитов вcodY- нуль - мутант по сравнению с UAMS-1 (WT) показаны. Изменение было определенно путем деления средней численности трех биологических повторностей нулевой деформации codY- на среднем обилии трех биологических повторностей Ут Стрейн. Стандартная ошибка между биологическими повторностями для каждого метаболита была <35%. Пунктирные линии указывают на лог - 2 1,5-кратное изменение, обрезание , используемый в данном эксперименте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Все метаболиты малых молекул связаны друг с другом через их общее происхождение в центральных метаболических путях. Во время экспоненциального роста, бактериальные клетки находятся в биологическом и метаболическом стационарном состоянии, обеспечивая снимок физиологического состояния при определенных условиях. Коди контролирует питательную достаточность, отвечая на РКН и ГТФ. Как РКН и GTP бассейнов капли, активность Коди, вероятно , постепенно уменьшается, регулируя экспрессию его генов - мишеней , чтобы адаптироваться к увеличению питательного истощения 30. Cody-дефицитный штамм ведет себя так , как будто РКНЫ и ГТФ истощены из окружающей среды , но только проявляет очень мягкое различие в поведении роста по отношению к Cody-опытным штамму (Рисунок 1). Таким образом, сравнение стационарных бассейнов метаболитов в этих штаммов дает нам уникальную возможность выявить, в какой степени метаболизма переконфигурированный, когда питательные вещества не хватает. Следует отметить, что НУЭксперименты г исследовать метаболит содержания, когда активность Cody максимизируются (РКНА и ГТФ является наиболее распространенным в экспоненциальной фазе). Тем не менее, другие вопросы могут быть решены в других фазах роста. Например, в экспоненциальной фазе, трикарбоновые кислоты (ТС) цикл активность очень низок; в пост-экспоненциальной фазе, цикл ТСА активируется 36. Целый ряд фенотипов, в том числе метаболита содержаний, зависит от этой активации. Кроме того, Agr Кворум сенсорной система становится активной во время перехода от экспоненциального роста к стационарной фазе 37. Сбор образцов в пост-показательной или стационарной фазы может быть более актуальным для исследований, посвященных этим темам. Независимо от того, когда образцов собирают, важно собрать, промыть и передать образцы в буфер для экстракции как можно быстрее (т.е. в пределах с) , чтобы минимизировать оборот метаболита , который происходит , когда стационарное состояние возмущенное,

Хроматографический метод, описанный здесь, особенно подходит для анализа полярных и неполярных аминокислот и центральных соединений углерода метаболизма. Тем не менее, дополнительные методы класса специфичные могут быть использованы для количественного определения конкретных соединений, представляющих интерес, не хроматографически решены с помощью этого метода. Например, изменение рН хроматографической подвижной фазы путем замены муравьиной кислоты с уксусной кислотой в качестве добавки, как сообщается , с тем чтобы разрешение изолейцин и лейцин 38. Изменение процедуры экстракции Аналогичным образом можно включить восстановление и количественное определение лабильных метаболитов, которые чувствительны к способу экстракции, используемому здесь. Так , например, соединение , такие как цистеин, которые склонны к образованию дисульфидных связей , потенциально может быть восстановлено следующими дериватизациями с реагентом Эллмана 39. Барботирования буферы экстракции с газообразным азотом может сохранить NAD + и NADHКоэффициенты, что позволяет провести оценку состояния клеточного окислительно - восстановительной 40. Нуклеозидтрифосфатов может разлагаться в основных или небуферных решениях; подкисления раствора для экстракции может улучшить восстановление этих молекул 41.

В экспоненциально растущей культуре бактерий, истощение одного или несколько питательных веществ, приводит к переходу к пост-экспоненциальной и стационарной фазе роста. Эти фазы роста характеризуется различными метаболическими состояниями 42. Хемостатная культура на основе генерировать практически непрерывное биологическую стационарное состояние идеально подходит для экспрессии генов и физиологических исследований. Однако этот метод требует специального оборудования, является технически требовательным, и требует, что ограничение питательных веществ быть наложены для поддержания стабильной популяции клеток в потоке. Последнее требование вызывает транскрипционные и физиологические возмущения из-за отличные от переменной или повторных факторовgulator анализируются. Для того, чтобы гарантировать, что наши колбы на основе результаты являются репрезентативными клетками, растущих в геометрической прогрессии в устойчивом состоянии, а не переход между двумя фазами, мы используем стратегию разведения двойных обратно с последовательной колбой: объемное соотношение (незначительные изменения в уровнях кислорода может привести к измененный метаболизм 36, 42). После первоначального разведения ночных культур, эти клетки выращивают до OD 600 из ~ 1,0, обратно-разбавляют до OD 600 из ~ 0,05, и собирают , когда они достигают OD 600 ~ 0,5. Такой способ также разжижает цитоплазматические молекулы, которые накапливаются в течение ночи роста, в том числе стабильных РНК. Действительно, RNAIII, эффектор СМ кворумной сенсорной системы, является одним из такого РНКА и регулирует экспрессию некоторых из тех же целей , как ген Cody 25, 43, 44. Накопленная RNAIII может маскировать Cody-DEPрегулирование endent, что приводит к недооценке силы подавления или стимуляции Cody (Шарма и Brinsmade, неопубликованные результаты).

Одним из ограничений этого анализа состоит в том, что он обеспечивает мгновенное представление о метаболите содержаний внутри клетки; никаких выводов не могут быть взяты из результатов, касающихся изменений потока через любой заданный путь. Например, Содержание лизина и метионина между двумя штаммами исследованных не изменились, несмотря де-репрессии ферментов биосинтеза в нулевой деформации codY- (фиг.2 и 3). -null штамм Cody может фактически быть производя больше лизин и метионин, но они могут быть быстро преобразованы в другие соединения; Таким образом, эти молекулы не накапливаются. С помощью 13 C- или 15 N-меченый углерод или азота источники позволили бы следовать углерод и азот скелетам через основные метаболические переходы 45 <SUP> 46.

Мы использовали метод , описанный для выяснения изменений в метаболита в бассейнах золотистого стафилококка, Б. Сенная 29, микобактерии туберкулеза 47, и Enterococcus faecium 48, но метод может быть применен к другим грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе с другом патогены человека легко культивировать в лаборатории. Действительно, интегрируя метаболомику и транскриптомную информации может выявить неожиданные связи между метаболизмом и вирулентностью, которые могли бы привести к новым стратегиям для лечения инфекций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была частично финансируется с помощью NIH Пути к независимости премии (грант GM 099893) и запуск факультета средств на СРБ, а также научно-исследовательский грант проекта (грант GM 042219). В спонсорам не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и интерпретации данных, или решение представить работу для публикации.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 mL) Belco 2510-00250
Sidearm Flask, 500 mL Pyrex 5340
3-hole Rubber Stopper, #7 Fisher 14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit VWR 89428-936
Petri Dish, 35 mm Corning 430588 Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size Millipore GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 mL USA Scientific 1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm Biospec Products Inc 11079101Z
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce (Thermo Scientific) 23235
Cogent Diamond hydride type C column Agilent 70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series Agilent G6230B
Quat Pump, 1290 Series Agilent G4204A 
Bin Pump, 1290 Series Agilent G4220A 
Valve Drive, 1290 Series Agilent G1107A 
Isocratic Pump, 1290 Series Agilent G1310B 
TCC, 1290 Series Agilent G1316C 
Sampler, 1290 Series Agilent G4226A 
Thermostat, 1290 Series Agilent G1330B 
Chemical
Tryptic Soy Broth Becton Dickinson 211825
Difco Agar, Granulated Becton Dickinson 214530 Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x Ambion AM9624 Dilute fresh to 1x with ultra-pure water
Acetonitrile Fisher Scientific A955-500 Optima LC-MS
Methanol Fisher Scientific A456-500 Optima LC-MS; toxic
Formic Acid Sigma Aldrich 94318 For mass spectrometry, 98%
Software
MassHunter Agilent G3337AA
Bacterial Strain Species Strain Genotype
SRB 337 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 wild type
SRB 372 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
  3. Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
  4. Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
  5. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  6. Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
  7. Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
  8. Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
  9. Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
  10. Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
  11. Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
  12. Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
  13. Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , [Epub ahead of print] (2016).
  14. Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
  15. Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
  16. Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
  17. Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
  18. den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
  19. Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
  20. Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
  21. Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
  22. Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
  23. Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
  24. Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
  25. Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
  26. Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  27. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  28. Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
  29. Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
  30. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
  31. Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. LC-MS-based metabolomics. Mol. Biosyst. 8 (2), 470-481 (2012).
  32. Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
  33. Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
  34. Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
  35. Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
  36. Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
  37. Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
  38. Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
  39. Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
  40. Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
  41. Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
  42. Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
  43. Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
  44. Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767 (2013).
  45. Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
  46. Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
  47. de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
  48. Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).

Tags

Биохимия выпуск 121 микробиология бактериальная физиология метаболомика, Cody аминокислоты метаболиты вирулентности патогенеза обмен веществ масс-спектрометрия жидкостная хроматография
Тандем жидкостной хроматографии на основе подхода для анализа метаболитов<em&gt; Золотистый стафилококк</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K.… More

Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K. Y., Brinsmade, S. R. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55558, doi:10.3791/55558 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter