Summary
Burada, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi ile, Staphylococcus aureus ve bunların daha sonraki analiz metabolitlerin ekstraksiyonu için bir protokol açıklar.
Abstract
bakteriyel patojenler engellemek için bir çaba, ana sıklıkla enfeksiyon yerinde besinlerin kullanılabilirliğini sınırlamaktadır. Bu sınırlama düzenleyici faktörler hücresel metabolizmayı ayarlayarak, cevap hangi anahtar metabolitlerin bolluklarını değiştirebilir. Son yıllarda, proteinler ve RNA bir dizi hastalık oluşturma gen ekspresyonunun önemli regülatörleri olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, Cody proteini dallı zincirli amino asitler ve GTP seviyelerine yanıt ve yaygın olarak düşük G + C Gram-pozitif bakteriler ile muhafaza edilir. Staphylococcus aureus küresel regülatör olarak, Cody virülans ve metabolik genlerin onlarca ifadesini kontrol eder. Biz S. aureus Cody, kısmen, potansiyel konak ortamında karşılaşılan besin sınırlayıcı koşullara uyum sağlama çabası içinde olan metabolik durumunu değiştirmek için kullandığı varsayımında. Bu makale kütle spektrumu ile birleştiğinde sıvı kromatografisi kullanılarak S. aureus metabolitleri çıkarılması ve analiz edilmesi için bir yöntem tarif etmektedirtrometry, bu hipotezi test etmek için geliştirilen bir protokoldür. yöntem ayrıca, sürekli kemostat kültürlerin kullanmadan biyolojik kararlı duruma ve sürekli havalandırma sağlamak gibi titizlik ve tekrarlanabilirlik sağlayacaktır iyi uygulamaları, vurgulamaktadır. USA200 metisiline duyarlı S. aureus Bağıl UAMS-1 ebeveyn soy izole izogenik codY mutantı aspartat (örneğin, treonin ve izolösin) elde edilen amino asit önemli artışlar sergilemiştir ve (bunların ön azalır, örneğin aspartat ve O-asetilhomoserin ). Bu bulgular, bir RNA seq analizi ile elde edilen transkripsiyon veriler ile iyi bir korelasyon: Cody boş mutantta 10- ve 800-kat arasında up-regüle bu yolların genler idi. transcriptome ve metabolom küresel analizlerini Coupling çevresel veya beslenme stresle karşılaştıklarında bakteri phys içine potansiyel kavrayış sağlayan onların metabolizmasını değiştirebilir nasıl ortaya çıkarabilirbesin tüketme ile ilişkili iological değişiklikler enfeksiyon sırasında yaşadı. Bu bulgular, yeni anti-infektifler ve terapötik maddelerin geliştirilmesi için yol açabilecektir.
Introduction
Bakteriyel patojenler konak ortamında birçok zorluklarla uğraşmak zorundadır. Bağışıklık hücreleri tarafından doğrudan saldırısına ek olarak, ev sahibi de, bakterinin yaşamda kalması ve çoğaltma üreten beslenme bağışıklık 1, 2 temel besin ayrı tutmaktadır. Bu düşmanca ortamlarda hayatta kalmak için, bakteriyel patojenler virülans faktörleri dağıtın. Bu faktörlerin bazıları bakteriler bağışıklık karşılığına izin; diğer faktörler doku türevi bileşenleri 3, 4, 5, tüketerek eksik besin doldurmak için bakteri sağlayabilir, örneğin hiyaluronidaz, thermonuclease ve lipaz gibi sindirim enzimleri, salgılanan içerir. Gerçekten de, bakteriler virülans, 6 faktörleri 7 üretimine hücrenin fizyolojik durumunu bağlayan düzenleyici sistemleri gelişmiştir,
Artan miktarda kanıt vücut metabolizmasını ve virülans bağlayan kritik bir regülatör olarak Cody işaret ediyor. İlk dipeptit permeaz (DPP) gen 11 bir bastıncısı olarak Bacillus subtilis keşfedilmiştir, ancak Cody hemen hemen tüm düşük G + C Gram-pozitif bakteriler 12, 13 tarafından üretildiği bilinmektedir ve düzenler karbon katılan genlerin onlarca azot metabolizması 14, 15, 16, 17, 18, 19. Patojenik türlerde, Cody, en önemli hastalık oluşturma gen 20, 21 bazı ekspresyonunu kontrol,. ef "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody ligandların iki sınıf ile bir DNA-bağlama proteini olarak aktive edilir: dallı zincirli amino asitler (BCAAs, izolösin, lösin ve valin [ILV]) ve GTP transkripsiyonu bu besinler bol olduğunda., Cody bastırmaktadır (ya da bazı durumlarda, uyarır). bu besin sınırlı hale geldikçe, Cody aktivitesi aşamalı olarak azalır,-yolları yeniden merkezi metabolizmaya bağlı çeşitli metabolik yollar aracılığıyla öncüleri bir kademeli transkripsiyonel yanıt olarak ortaya çıkan 28, 29, 30.
Kütle spektrometrisi (LC-MS) bağlanmış Tandem sıvı kromatografisi doğru küçük moleküllü hücre içi metabolitler 31 tanımlamak ve miktarını güçlü bir tekniktir. transkripsivonel ile eşleştirilmiş zamanriptome analizi (örneğin, RNA-Dizi), bu analitik akışı çevresel veya beslenme stres yanıt olarak oluşan fizyolojik değişiklikler hakkında fikir verebilir. Burada, LC-MS ile Staphylococcus aureus hücreleri ve daha sonra analiz metabolit ekstraksiyonu için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım S. aureus fizyolojisi üzerinde Cody pleiotropik etkilerini göstermek için kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tampon çözeltiler hazırlanması 1.
- fosfat tamponlu tuzlu su hazırlama, ultra saf ile 1x nihai bir konsantrasyona kadar 10 x PBS stok çözelti seyreltilerek (PBS, pH 7.4) (distile ve deiyonize) su.
- 2 ml asetonitril içindeki, 2 ml metanol, ultra saf H2O 1 mL ve formik asit 19 uL (0.1 mM son konsantrasyon) birleştirerek söndürme çözeltisi hazırlayın.
- LC-MS, aşırı saf su, formik asit (% 0.2 [hacim / hacim] nihai konsantrasyon) ilave etmek suretiyle, bir çözücü hazırlanır.
- asetonitril, formik asit (% 0.2 [hacim / hacim] nihai konsantrasyon) eklenerek LC-MS solvent B hazırlayın.
Not: Bütün çözeltiler yüksek saflıkta reaktifler elde edildi (genellikle, yüksek performanslı sıvı kromatografi sınıfı) kullanılarak hazırlanmalıdır. Çözümler her deneyden önce taze hazırlanmış ve kullanımdan önce buz üzerinde muhafaza edilmelidir.
Kararlı hal S. aureus Büyüme 2. Kurulması
- Streak S. aureuBir dondurulmuş gliserol stokundan triptik agar (TSA) üzerinde izolasyonu için ilgi lar suşları. 16-24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
- triptik soya suyu (TSB) ya da her bir suşun tek koloniler ile steril cam inkübasyon tüplerde başka bir uygun ortam içinde 4 mL inoküle. eğimli inkübe (~ 70 ° açı) 16-20 saat boyunca 37 ° C'de dakika (rpm) 60 rotasyon dönme ile.
Not: Hücresel fizyolojisini etkiler, burada aşama 2.2 tarif edilenler de dahil olmak üzere, standart yöntemler kullanıldığında, gece boyuncaki kültürleri oksijen gradyanlar yatkındır. Böylece, (bkz adımlar 2,4-3,2, aşağıda) biyolojik kararlı durum sağlamak için çoklu arka seyreltme stratejisini kullanır. - 600 nm (OD 600) de aşama 2.2 kültürlerin optik yoğunluğunun ölçülmesi için bir spektrofotometre kullanılır. bir optik referans (boş) olarak steril ortamı kullanın. Steril TSB ortamı 0.05 50 mL'lik bir OD 600 bu hücrelerin seyreltin ayrı olarak, 250 mL DeLong şişelerinde (37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış).
- incukesmek 280 rpm'de çalkalanarak, bir su banyosu içinde 37 ° C 'de kültür.
- Her 30 dakika, 600 ölçüm OD almak; Optik yoğunluklar arttıkça, bunların spektrofotometrenin doğrusal nüfuz aralığında kalacak şekilde TSB kültürleri seyreltilmesi için gerekli olabilir.
- Adım 2.5 kültürler ~ 0.8-1.0 OD 600 elde zaman, 0.01-0.05 OD'ye 600-37 ° C TSB 50 mL içine alt-kültürü ve tekrar 2.4 ve 2.5 adımları tekrarlayın.
3. Numune Toplama Kur
- Uygun bir kap içinde ezilmiş kuru buz dolu bir yatak hazırlayın (örneğin, cam tabak, buz kovası veya soğuk).
- kültürlerin optik yoğunlukları arzu edilen hasat noktası yaklaştıkça, ≥5 dakika boyunca 35 mm işlemden geçirilmemiş olan Petri çanağı ve kuru buz üzerinde ön-soğutma çözeltinin söndürülmesi 1 ml.
NOT: "İstenilen hasat noktası" deneysel hedeflerine bağlı olarak değişecektir. Örneğin, tek bir m incelemek için olanetabolites aerobik büyüme sırasında, bu durumda ana göstergeleri asetat atılımı ve post-üstel gelişme fazı 32, 33 boyunca asetat yeniden asimilasyon bulunmaktadır. Genel olarak, bu noktada, özel bir gelişme aşamasında (örneğin, üstel faz) içinde olmalıdır. Bu aşamada ilişkili belirli OD600 değerleri farklı bakteriyel suşlara ve büyüme ortamı arasında değişebilir. - Bir kauçuk tıpa içinde (-20 ° C'ye kadar önceden soğutulmuş) bir paslanmaz çelik filtre hamuru yerleştirin ve bir ev tipi vakum veya vakum pompasına bağlı bir vakum şişesi üstüne yerleştirin.
- vakum uygulayın ve üstüne bir karışık selüloz ester zarı (0.22 um gözenek boyutu) yerleştirin.
NOT: frit eşit bir çapa sahip olan bir filtre kullanımı ve uygun örnek bir filtreden yerine kenar üzerine çekilir emin olmak için bu filtre merkezi kritiktir. Buz soğukluğunda steril H membran ıslatma 2 O yardımcı olabilirbir membran yerleştirmek ile.
4. Örnek Hasat
- OD 600 ~ 0.4-0.5 'de, şişeye kültüre 13 mL kaldırmak için serolojik bir pipet kullanın ve filtreye örnek uygulamak.
- Numunenin tamamı, filtre edildikten sonra, hemen orta ilişkili metabolitleri yıkamak için buz soğukluğunda PBS ≥5 mL ile filtre yıkayın.
- vakum ayırın ve frit filtreyi kaldırmak için steril bir cımbız kullanın. Önceden soğutulmuş söndürme çözeltisi içine filtre (hücre tarafı aşağı) ters çevirin.
Sıvı metabolik aktiviteyi kontrol altına alınması, hücrelerin hızlı söndürme sağlamak için kaldırılmıştır kısa sürede (saniye içinde, örneğin) hızlı bir şekilde yukarıdaki adımları gerçekleştirmek için önemlidir ve: NOT. - ≥20 dakika boyunca kuru buz üzerinde soğutma çözelti içinde filtre inkübe edin.
- Petri kabındaki filtre (hücre tarafı yukarıda) tersine ve t ve hücreler durulama için bir mikropipet kullanarak steril cımbız kullanarako söndürme çözeltisi içine membrana.
- ve söndürme çözeltisi içinde hücreler süspansiyon haline yeniden daha sonra 0.1 mm silis boncuklar ~ 100 uL içeren steril 2 ml darbeye dayanıklı tüp hücre süspansiyonu aktarın. kuru buz üzerinde ya da -80 ° C'de bu saklayın.
5. metabolit Ekstraksiyon
- ıslak buz üzerinde çözülme örnekler ve döngüler arasındaki kuru buz üzerinde 2 dakika soğutma süreleri ile, 6,000 rpm'de dört 30 s açılışları olan bir homojenleştiricide hücreleri parçalamak.
- Maksimum hızda önceden soğutulmuş, soğuk mikrosantrifüj içinde 15 dakika için lizatları netleştirmek (yani ≤4 ° C'de 18.213 x g'de).
- Temiz bir mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın.
- Mikropipet kullanılarak, adım 6'da kalıntı peptit içeriğinin miktarının belirlenmesi için bir mikrosantrifüj tüpüne numunenin çok küçük bir kısmını aktarmak; -80 ° C'de kalan saklayın.
Not: yedek numune hacmi aşama 6.1'de kullanılan BCA bağlı olarak değişir. BuNumune derhal analiz için ıslak buz üzerinde saklanır ya da -80 ° C'de donduruldu olmalıdır.
6. Bikinkoninik asit (BCA) deneyi
- Her bir örnek için kalıntı peptit konsantrasyonunu belirlemek için aşama 5.4 numuneleri kullanılarak, bu kit, üretici tarafından tavsiye edildiği gibi bir BCA deneyi gerçekleştirmek.
7. LC-MS
- LC-MS çözücü B 75 uL, 75 uL S. aureus özü, aşama 1.4'te hazırlanan karıştırın.
- Girdap 5 dakika boyunca 13.000 x g'de karıştırın ve sıkma için.
- bir sıvı kromatografisi (LC) şişenin içine yüzer maddelerinden 100 uL yerleştirin ve kapağı. hiçbir hava kabarcığı numunede sıkışıp emin olun.
- LC-MS otomatik numune alıcı üzerine LC şişeleri yükleyin ve yazılımda çalışan listesini düzenlemek "Çevrimdışı Çalışma Listesi Editör."
- "Örnek Adı" doldurun (örn vahşi tip-1), "Örnek pozisyonu" (örneğin, P1-A1), "Yöntem" (örneğin, Formik Acid-Negatif Yöntem) ve "Veri Dosyası" (örneğin, vahşi tip-1) sütun. düğmesi "Kaydet Çalışma Listesi" butonuna tıklayın. "Kütle Spektrometresi Veri Toplama İş İstasyonu" yazılım ve giriş önceden kaydedilmiş Çalışma listesi açın. Sürekli LC-MS ölçümü başlatmak için "Başlat Çalışma Listesi Çalıştır" butonuna tıklayın.
- LC sistemi ile TOF spektrometre, bir sütun üzerinde örnekleri Ayrı bir uçuş (TOF) spektrometrenin bir zamana sütun bağlantı ve çift. aşağıdaki gibi, bir mobil faz gradyanı kullanın: 0-2 dak% 85 solvent B; 3-5 dakika, 80% solvent B; 6-7 dk,% 75 çözücü B; 8-9 dk,% 70 çözücü B; 10-11,1 dakika,% 50 çözücü B; 11,1-14 dakika,% 20 çözücü B; ve 14,1-24 dakika,% 5 solvent B; % 85 Çözücü B 10 dakika yeniden dengeleme süresi ve 0.4 ml min-1 bir akış oranı ile sona erer.
- Izokratik pompa kullanılarak, aynı anda toplu eksen kalibrasyonu olanak sağlamak için çalışma ile bir referans kütlesi çözeltisi aşılamak.
NOT: Bu adımStandart TOF spektrometresi kılavuzunda dayanmaktadır.- asetik asit D4 ve heksakis (1H, 1H, 3H-tetrafloropropoksi) referans kütlesi çözeltisi olarak phosphazine gerçek zamanlı kalibrasyonu gerçekleştirmek için karışımını kullanarak. 2.5 ml dak akış hızı ile izokratik pompa -1 infüzyon için kullanılır.
İyon sayar 8. Toplu düzeltme
- (1 çoğaltmak, örneğin, vahşi tip) bir toplu düzeltme için bir referans örnek olarak hizmet etmek için herhangi bir örnek belirtin.
- Referans numune içindeki tüm metabolitler için iyon sayımı toplamını hesaplar. Tüm numuneler için bu hesaplamayı tekrarlayın.
- oranı oluşturmak için, referans numunenin toplam iyon sayımı ile her bir numunenin toplam iyon sayısı bölün.
- Her bir metabolit için bir toplu düzeltilmiş iyon sayımı elde etmek için örnek / referans oranı ile bir numune içinde her bir metabolitin iyon sayısı bölün.
9. Peptid Normalleştirme
- DHer bir metabolit için normalleştirilmiş bir değer elde etmek için aşama 6'da BCA analizi peptit konsantrasyonu ile adım 8'de elde edilen her bir numune için seri düzeltilmiş iyon sayım değerlerinin ivide.
Not: Aşama 9.1'de elde edilen her bir metabolit için normalleştirilmiş, toplu toplu düzeltilmiş iyon sayısı ile doğrudan suşları arasında karşılaştırıldı ve istatistiksel analizi (-test örneğin, bir Mann-Whitney U) tabi tutulabilir. Seçenek olarak ise, bilinen bir metabolit değişmeden ya tedavisi veya genetik arka tarafından ayrışma metabolit nedeniyle değişiklikleri tespit etmek için bir değer olarak kullanılabilir olması. Ekstraksiyon tamponu L-norvalinyl veya gluraric asit, bilinen bir miktarının sisteme duhul edilmesi Örnek işleme 34 boyunca kaybını düzeltmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz zengin, karmaşık ortamda in vitro büyüme sırasında S. aureus hücre içi metabolit havuzları analiz ettik. Prensip kanıtı olarak, karşılaştırıldığında, metisiline duyarlı S. aureus osteomiyelit arasında metabolit profilleri UAMS-1 (vahşi tip [WT]) ve küresel bir transkripsiyonel düzenleyici Cody (Δ codY) 26 eksik izogenik soy izole eder. Protokol aşama 2'de tarif edildiği gibi kararlı durum, WT ve Cody soylarının üstel kültürleri, TSB ortamı içinde kurulmuştur. Yabani tip ve Cody -null mutant kültürlerinin büyümesi davranışı büyüme verimi ve hızı (Şekil 1) sadece hafif farklılıkları ile benzerdi. RNA Seq ve mikro-dizi teknolojisi kullanılarak, ve diğerleri aspartattan türeyen amino asitlerin biyosentezinde yer alan enzimleri kodlayan birden fazla gen Cody -null mutant c de-bastırılmış olduğunu ortaya koymuşturTSB in vitro büyüme (Şekil 2), 25, 27, 30 boyunca WT hücrelerine ompared. Ayrıca, brnQ1 ve brnQ2, dallı zincirli amino asit permeases kodu, codY- boş mutant 30, 35 aşın ifade edilmektedir.
Boş mutantta değiştirilmiş bu yolak ile bağlantılı metabolitlerin sabit durum hücre içi bolluğu, biz LC-MS-esaslı metabolit profil gerçekleştirilen ne ölçüde belirlemek. WT ve codY- boş mutant hücrelerin biyolojik sabit duruma büyütüldü ve protokolün adım 4'te tarif edildiği gibi numune alındı. Biz (Malzeme listesi) analitik bir yazılım paketi kullanılarak her bir kromatografik olarak çözüldü metabolit için yoğunluk iyon tepe alanların integrasyonu ile metabolit bolluğunu belirlenir. Biz fark için düzeltilmişHer numunenin kalıntı peptit konsantrasyonuna metabolit bolluğunu normalize edilmesi ile biyokütle arklar ı. Biz ayrıca, her bir numune içindeki tüm metabolitler için ortalama iyon sayısı hesaplanarak ve referans değeri olarak vahşi tip örneği kullanarak, örnekler arasında potansiyel bir parti etkileri için bu değerler düzeltildi. Bu yaklaşım koşulları karşısında metaboliti bolluk arası örneklem karşılaştırmalar sağladı. Belirli bir örnek içinde arası metabolit karşılaştırmalar Benzer önce standart ekleme yöntemi kullanılarak belirlenir miktarlarda molar iyon sayımlarından normalize metabolit bolluğunu dönüştürerek elde edilebilir.
Biz UAMS-1 ve codY- boş mutant aspartat yolunun anahtar ara maddelerinin seviyeleri bakımından karşılaştırdık. Şekil 3'te de görüldüğü gibi, (örneğin, treonin ve (izo) -lösin) bu yolun son ürünler, Cody -null mutan hücrelerde daha bol bulunan prekürsörlerle ise (örneğin,aspartat ve O-asetil homoserin) WT hücrelerinde daha bol miktarda bulunmaktadır. BrnQ kombine upregülasyonu 36 permeases ve ILV biyosentetik yol muhtemelen izolösin ve lösin 30 artışlara neden olur. farklar (<4-kat) göreceli olarak küçük olsa da, miktar tayini ve toplu düzeltme Cody aracılık ettiği kopyalama değişiklikler ile tutarlıdır sağlam ve istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik ortaya LC-MS-esaslı.
Şekil 1: S. aureus UAMS-1 Büyüme davranışı ve TSB içinde izogenik codY -null mutantı. Ön kültürler bir OD 600 ± 1 elde sonra zaman kararlı durum üstel büyüme geçirdiği hücreleri genişletmek için, kültürler taze ortam içinde 0.05 bir optik yoğunluk geri-seyreltildi. LC-MS metabolit analizi için numuneler toplandıDeney kültürleri ~ 0.5 (oklar) bir optik yoğunlukta. Gösterilen veriler, üç biyolojik çoğaltır temsil etmektedir.
Şekil 2: aspartat elde seçilen metabolitlerin şeması. Genler ve, ürünleri italik olarak gösterilmiştir aspartat-aile amino asitlerin sentezini katalize operonlar; RNA seq analizi 29 ile belirlenen bir codY -null mutant kopya miktarı artış, vahşi tip ile karşılaştırıldığında, aynı zamanda not edilmelidir. DHP, 2,6-diaminoheptanedioate (2,6-diaminopimelat).
Şekil 3: aspartat ailede metabolit miktarlarının bir codY mutantta değiştirilir. Seçilen metabolitlerin günlük 2 kat değişiklikleriUAMS-1 (WT) ile karşılaştırıldığında codY- boş mutant gösterilmiştir. Değişim WT suşu üç biyolojik çoğaltır ortalama bolluk tarafından codY- boş suşu üç biyolojik çoğaltır ortalama bolluğu bölünmesi ile tespit edilmiştir. her bir metabolitin biyolojik çoğaltır standart hata% 35 <idi. Kesik çizgiler bir günlük 2 1.5-kat değişiklik, bu deneyde kullanılan cutoff gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tüm küçük moleküllü metabolitleri merkez metabolik yollardaki ortak kökenli aracılığıyla birbirine bağlanır. üstel büyüme sırasında, bakteriyel hücreler, belirli koşullar altında, fizyolojik durumunun bir görüntü sağlar, biyolojik ve metabolik kararlı halde bulunmaktadır. Cody ilv ve GTP yanıt vererek besin yeterliliğini izler. Ilv ve GTP havuzları damla olarak, Cody aktivitesi büyük olasılıkla artan besin tüketme 30 artan uyum, hedef genlerin ekspresyonunu ayarlama azalır. Bir Cody eksikliği suşu ILV ve GTP ortamından tüketilmiştir gibi davranır ancak Cody-yetkin suşuna büyüme davranışı göreli olarak çok hafif bir fark (Şekil 1) gösterir. Böylece, bu suşlarda metabolitlerin kararlı durum havuzlarının karşılaştırma besin kıt olduğunda metabolizma yeniden edildiği ölçüde ortaya çıkarmak için eşsiz bir fırsat bize sağlar. Bu unutulmamalıdır ouCody aktivitesi (ilv ve GTP üslü fazda en bol olan) büyütüldüğünde r deneyler metabolit bolluklarını araştırmak. Ancak, diğer sorular büyümenin diğer aşamalarında ele alınabilir. Örneğin, üslü fazda, trikarboksilik asit (TCA) döngüsü etkinliği çok düşüktür; sonrası üslü fazda, TCA döngüsü 36 etkinleştirilir. metabolit miktarlara içeren fenotip bir miktarının, bu aktivasyon üzerine bağlıdır. Buna ek olarak, agr çekirdek algılama sistemi sabit faz 37 üstel büyüme geçiş sırasında etkin hale gelir. sonrası üslü veya sabit fazda örneklerin toplanması, bu konuları ele çalışmalar için daha uygun olabilir. Ne olursa olsun örnekler hasat edilir bölgesinin kararlı durum bozulur oluşan metabolit devir en aza indirmek için, toplama yıkayın ve (s içinde, örneğin) mümkün olduğunca çabuk ekstraksiyon tamponuna örnekleri transferi için önemlidir.
Burada tarif edilen kromatografik yöntem, polar ve polar olmayan amino asitler ve merkezi karbon metabolizması bileşikleri analiz için uygundur. Bununla birlikte, ilave sınıf özel yöntemler kromatografik bu yöntemle çözülmezse ilgi çekici bir spesifik bileşikler ölçmek için kullanılabilir. Örneğin, bir katkı maddesi, izolösin ve lösin 38 çözünürlüğünü sağlamak için rapor edildiği gibi asetik asit ile formik asit yerine kromatografik mobil faz pH değerini değiştirerek. ekstraksiyon prosedürü değiştirme benzer Burada kullanılan ekstraksiyon yöntemi duyarlı kararsız metabolitlerin kurtarma ve kantifikasyonunu etkinleştirebilirsiniz. Örneğin, disülfid bağı oluşumuna eğilimlidir sistein gibi bileşiklerinin potansiyel Ellman maddesi 39 ile türetme, aşağıdaki elde edilebilir. Azot gazı ile serpme ekstraksiyon tampon NAD + ve NADH koruyabiliroranlar, hücresel redoks durumuna 40 bir değerlendirme için sağlanır. Nükleosid trifosfatlar, bazik ya da tamponsuz Çözeltilerin ayrıştırmak; Ekstraksiyon solüsyonu asidifiye Bu moleküllerin 41 kurtarma artırabilir.
katlanarak büyüyen bakteri kültürü olarak, bir veya daha fazla besin tüketme büyüme sonrası üstel ve sabit fazlar için geçişe yol açar. Bu büyüme fazlar farklı metabolik durum 42 ile karakterize edilir. Kemostat tabanlı kültürler gen ifadesi ve fizyolojik çalışmalar için neredeyse sürekli biyolojik kararlı durum ideali üretir. Ancak bu yöntemin, özel ekipman gerektirir teknik olarak ve bir besleyici sınırlama akışı altında hücrelerin istikrarlı bir nüfusu korumak için uygulanan getirilmesini zorunlu kılmaktadır. ikinci şartı nedeniyle değişken veya yeniden dışındaki faktörler transkripsiyonel ve fizyolojik düzensizlikler neden olurgulator analiz edilen. hacim oranı (yol açabilir oksijen seviyelerinde hafif değişiklikler: eden şişe bazlı sonuçlar kararlı bir halde olup, iki faz arasında bir geçiş katlanarak büyüyen hücrelerin temsil etmesini sağlamak için, tutarlı bir şişe olan bir çift arka seyreltme stratejisi istihdam değiştirilmiş metabolizması 36, 42). Bunlar, 0.5 ~ OD'ye 600 ulaştığı zaman, gece boyunca kültürün ilk seyreltildikten sonra, bu hücreler bir OD 600 -0.05 geri seyreltilmiş, OD 600 ~ 1.0 yetiştirilir ve toplanır. Böyle bir yöntem, aynı zamanda stabil RNA 'de dahil olmak üzere, gece boyunca büyümeleri sırasında biriken sitoplazmik molekülleri seyreltir. Gerçekten de, RNAIII agr çekirdek algılama sisteminin etkili, bu tür bir RNA olduğu ve Cody 25, 43, 44 ile aynı gen hedefleri bazı ekspresyonunu regüle eder. Birikmiş RNAIII Cody-dep maskeleyebilirendent düzenlemesi, Cody (Sharma ve Brinsmade, yayınlanmamış sonuçlar) baskıya veya stimülasyon kuvvetinin tahminlerin yol açar.
Bu analizin bir sınırlaması, hücre içinde metabolit bolluk anlık bir belirti temin etmesidir; bir sonuç herhangi bir yol aracılığıyla akıdaki değişim ile ilgili sonuçlar çıkarılabilir. Örneğin, codY- boş suşunda biyosentetik enzimlerin de-baskıya rağmen değişmedi incelenen iki suş arasında lizin ve metiyonin bolluğu, (Şekil 2 ve 3). CodY -null suşu aslında daha lizin ve metiyonin üreten olabilir, fakat hızla diğer bileşiklere dönüştürülebilir; Böylece bu moleküller, birikmez. 13 C- veya 15 kullanılarak, N-işaretli karbon veya azot kaynakları ABD önemli metabolik birleşme 45 <karbon ve azot iskeletleri takip sağlayacaksup> 46.
Tanımlanan S. aureus metabolit havuzlarında değişiklikleri ortaya çıkarmak için bir yöntem, B. subtilis 29 Mycobacterium tuberculosis 47 ve Enterococcus faecium 48 kullanılır, ancak yöntem, diğer dahil olmak üzere, diğer Gram-pozitif ve Gram-negatif bakterilere tatbik edilebilir insan patojenleri laboratuvarda kolaylıkla ekili. Nitekim metabolomic ve transkriptomik bilgileri bir araya getirecek enfeksiyonları tedavi etmek için yeni stratejiler yol açabilecek metabolizması ve virülans arasındaki beklenmedik bağlantıları ortaya çıkarabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma, bir Kurtuluş Ödülü NIH Pathway (GM 099893 hibe) ve fakülte başlangıç fonları SRB yanı sıra bir Araştırma Projesi Grant (GM 042219 hibe) tarafından kısmen finanse edildi. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve yorumlama veya yayın için çalışmalarını göndermek için karar hiçbir rolü olmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipmenta | |||
| DeLong Culture Flask (250 mL) | Belco | 2510-00250 | |
| Sidearm Flask, 500 mL | Pyrex | 5340 | |
| 3-hole Rubber Stopper, #7 | Fisher | 14-131E | |
| Stainless Steel Filter holder/frit | VWR | 89428-936 | |
| Petri Dish, 35 mm | Corning | 430588 | Not tissue culture treated |
| Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size | Millipore | GSWP02500 | |
| Impact-resistant tubes, 2 mL | USA Scientific | 1420-9600 | |
| Silica Beads, 0.1 mm | Biospec Products Inc | 11079101Z | |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119-200-RD000.0 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce (Thermo Scientific) | 23235 | |
| Cogent Diamond hydride type C column | Agilent | 70000-15P-2 | |
| Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series | Agilent | G6230B | |
| Quat Pump, 1290 Series | Agilent | G4204A | |
| Bin Pump, 1290 Series | Agilent | G4220A | |
| Valve Drive, 1290 Series | Agilent | G1107A | |
| Isocratic Pump, 1290 Series | Agilent | G1310B | |
| TCC, 1290 Series | Agilent | G1316C | |
| Sampler, 1290 Series | Agilent | G4226A | |
| Thermostat, 1290 Series | Agilent | G1330B | |
| Chemical | |||
| Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211825 | |
| Difco Agar, Granulated | Becton Dickinson | 214530 | Solid media contains 1.5% [w/v] agar |
| Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x | Ambion | AM9624 | Dilute fresh to 1x with ultra-pure water |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-500 | Optima LC-MS |
| Methanol | Fisher Scientific | A456-500 | Optima LC-MS; toxic |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318 | For mass spectrometry, 98% |
| Software | |||
| MassHunter | Agilent | G3337AA | |
| Bacterial Strain | Species | Strain | Genotype |
| SRB 337 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | wild type |
| SRB 372 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | ΔcodY::erm |
| aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies. | |||
References
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
- Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
- Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
- Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
- Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
- Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
- Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
- Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
- Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
- Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
- Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
- Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , [Epub ahead of print] (2016).
- Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
- Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
- Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
- Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
- den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
- Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
- Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
- Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
- Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
- Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
- Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
- Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
- Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
- Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
- Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
- Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
- Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
- Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W.
- Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
- Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
- Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
- Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
- Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
- Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
- Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
- Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
- Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
- Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
- Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
- Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
- Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767 (2013).
- Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
- Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
- de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
- Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).
