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Developmental Biology

पेरीफरल रक्त व्युत्पन्न मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से चांड्रोसाइट्स को विभेदित करना

Published: July 18, 2017 doi: 10.3791/55722
Automatic Translation
2, 1, 3, 1
1Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University, 2Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, 3Clinical and Translational Research Center of Shanghai First Maternity & Infant Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University

Summary

हम एक एकीकरण-मुक्त पद्धति का उपयोग करते हुए प्रेरित उत्परिवर्तक स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) के माध्यम से मानव परिधीय रक्त (पीबी) से एक चोंड्रोजेनिक वंश उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जिसमें भ्रूण निकाय (ईबी) गठन, फाइब्रोब्लास्टिक कोशिकाओं के विस्तार और चोंड्रोजेनिक प्रेरण शामिल हैं।

Abstract

इस अध्ययन में, हम एक एकीकृत मुक्त तरीके से प्रेरक पुलिपरेट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससीएस) के माध्यम से चॉन्ड्रोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए बीज कोशिकाओं के रूप में परिधीय रक्त कोशिकाओं (पीबीसी) का इस्तेमाल करते हैं। भ्रूण निकाय (ईबी) के गठन और फाइब्रोब्लास्टिक सेल के विस्तार के बाद, आईपीएससी सीरम मुक्त और एक्सो-मुक्त शर्तों के तहत 21 दिनों के लिए चोंड्रोजेनिक भेदभाव के लिए प्रेरित होते हैं। चॉन्ड्रोसाइट प्रेरण के बाद, कोशिकाओं के फेनोटाईफ़्स को आकृति विज्ञान, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और जैव रासायनिक विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, साथ ही चोंड्रोजेनिक भेदभाव मार्करों की मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर परीक्षा द्वारा भी मूल्यांकन किया जाता है। Chondrogenic छर्रों सकारात्मक alcian नीले और toluidine नीले धुंधला दिखाई देते हैं। कोलेजन II और एक्स धुंधला के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री भी सकारात्मक है। सल्फाटेड ग्लाइकोमामिनोग्लाइकन (एसजीएजी) सामग्री और चोंड्रोजेनिक भेदभाव मार्करों कोलेजन 2 ( सीएल 2 ), कोलाग्नन 10 ( कॉल 10 ), एसओओएक्स 9 , और एग्रेकैन काफी महत्वपूर्ण हैं।हायपीएससी और फाइब्रोब्लास्टिक कोशिकाओं की तुलना में rogenic छर्रों। ये परिणाम बताते हैं कि उपास्थि मरम्मत के लिए आईपीएससी उत्पन्न करने के लिए पीबीसी का उपयोग बीज कोशिकाओं के रूप में किया जा सकता है, जो रोगी-विशिष्ट और लागत प्रभावी है।

Introduction

कर्टिलेज ऊतक में स्व-मरम्मत और पुनर्जनन के लिए बहुत कम क्षमता है। असंतोषजनक परिणामों के साथ, कार्टिलेज और संयुक्त समारोह को बहाल करने के लिए कई शल्य चिकित्सा के हस्तक्षेप और जैविक उपचार का उपयोग किया जाता है। हाल ही में स्टेम सेल टेक्नोलॉजी का विकास पूरे उपास्थि मरम्मत क्षेत्र 1 को बदल सकता है। विभिन्न स्टेम कोशिकाओं बीज कोशिकाओं के रूप में अध्ययन किया गया है, लेकिन मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs), सबसे होनहार विकल्प दिखाई देते हैं के रूप में वे अस्वीकृति प्रतिक्रियाओं 2 पैदा करने के बिना रोगी विशेष कोशिकाओं के कई प्रकार प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, वे वयस्क कोशिकाओं के सीमित प्रजनन प्रकृति को दूर कर सकते हैं और स्वयं-नवीकरण और प्लुरिपोटेंट क्षमता बनाए रख सकते हैं। इसके अलावा, विशिष्ट प्रकार के chondrocytes प्राप्त करने के लिए जीन लक्ष्यीकरण को जीनोटाइप बदलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

फाइब्रोब्लैस्टों का आईपीएससी उत्पन्न करने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है क्योंकि उनकी रिप्रोग्रागमिंग क्षमता का भी अध्ययन किया गया है।हालांकि, अभी भी कुछ सीमाएं हैं जिन्हें दूर करना चाहिए, जैसे कि रोगी से दर्दनाक बायोप्सी और फाइब्रोब्लास्ट्स के इन विट्रो विस्तार की आवश्यकता, जिसके परिणामस्वरूप जीन म्यूटेशन 3 हो सकते हैं हाल ही में, पीबीसी reprogramming 4 के लिए लाभदायक पाया गया; इसके अलावा, वे आमतौर पर इस्तेमाल किया गया था और प्रचुर मात्रा में संग्रहित। यह संभव है कि वे त्वचा से अध्ययन फोकस रीडायरेक्ट कर सकते हैं। हालांकि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, पीबीसी रीप्रोग्रैग्रामिंग पर कुछ रिपोर्टें हैं जो चांड्रोसाइट्स में भेदभाव करती हैं।

वर्तमान अध्ययन में, हम पीबीसी को एक वैकल्पिक स्रोत के रूप में उन्हें आईपीएससी में पुन: प्रोग्रामिंग करके और फिर आईपीसीसी को चोंड्रोजेनिक वंश में एक गोली संस्कृति प्रणाली के माध्यम से अलग करके चोंद्रासाइट गठन की नकल करने के लिए उपयोग करते हैं।

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Protocol

पीबीसी से एचपीएससी की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल हमारे पिछले 5 अध्ययनों में पाया जा सकता है। हमारे संस्थान की संस्थागत समीक्षा बोर्ड ने इस अध्ययन को मंजूरी दे दी थी।

1. एम्बॉयएड बॉडी (ईबी) फॉर्मेशन

  1. एचपीसीसी माध्यम के 50 एमएल बनाओ: नॉकआउट डुलबेको के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) 15% नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन (केएसआर), 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1 × अनावश्यक एमिनो एसिड, 55 माइक्रोन 2-मर्कैपोटोथेनॉल, 2 एमएम एल -ग्लूटामाइन और 8 एनजी / एमएल मूल फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (बीएफजीएफ)।
  2. 50 एमएलओफ़ ईबी गठन माध्यम बनाएं: डीएमईएम 15% केएसआर, 5% एफबीएस, 1x गैर-अनावश्यक अमीनो एसिड, 55 माइक्रोन 2-मेर्कैप्टोथनॉल, और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक।
  3. बेसल संस्कृति माध्यम के 50 मिलीलीटर बनाओ: 20% एफबीएस, 1 × अनावश्यक अमीनो एसिड, 55 माइक्रोन 2-मर्कैपोटोथेनॉल और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन के साथ डीएमईएम पूरक।
  4. 10 एमएल का प्रेषण समाधान तैयार करें, 1 एमजी / एमएल में पीटा डमएम्एम
  5. cultuफीडर कोशिकाओं के साथ 60 मिमी टिशू कल्चर व्यंजन पर hiPSCs ( यानी, विकिरणित माउस भ्रूणीय fibroblast कोशिकाओं का एक मोनोलायर)। जब कोशिकाओं में 80-90% मिला हुआ होता है, तब कोशिकाओं को अलग करना और एचपीएससी 1: 3 हर 4-5 दिनों के दौरान पारित हो जाते हैं। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें।
  6. आईपीएससी 80-90% मिला हुआ है, जब एक आग खींचा गिलास सुई का उपयोग करते हुए, छोटे टुकड़ों (लगभग 50-100 माइक्रोग्राम व्यास) में अल्पसंख्यक HIPSC कालोनियों काटना। आम तौर पर, एक 100 मिमी पेट्री डिश में ईबीएस उत्पन्न करने के लिए 60-एमएम डिश में हायपीएससी कॉलोनियों का उपयोग करें।
    1. एक 100 मिमी, गैर-अनुरुप पेट्री डिब्बे में 10 एमएल के ईबी फॉर्मेशन माध्यम युक्त 100 छोटे से कम कालोनियों की संस्कृति। व्यंजन को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें।
  7. प्रारंभिक माध्यम का लगभग 25% मूलभूत संस्कृति माध्यम की एक समान मात्रा के साथ हर 2 दिन प्रतिस्थापित करें। ईबीएस को व्यवस्थित करने के लिए पकवान झुकाएं सावधानी से 3 एमएल निकालेंऊपरी माध्यम का और ताजा मूल संस्कृति के माध्यम के 4 एमएल जोड़ें। ईबीएस को परेशान मत करो।
    नोट: खुदाई के तहत चिकनी सीमाओं के साथ एक गोल उपस्थिति लेने, EBs morphologically कालोनियों के टुकड़े द्वारा विशेषता है।
  8. गैर-अनुयायी पेट्री डिश में 10 दिनों की संस्कृति के बाद, काट एक नई 100 मिमी टिशू कल्चर डिशियम का उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 0.1 एमजेएल 0.1% जिलेटिन के साथ।
  9. एक 100 मिमी, गैर-अनुरुप पेट्री डिश से 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में मध्यम प्लस ईबी का स्थानांतरण करें। 4-5 मिनट के लिए ईबीएस तलछट दें सतह पर तैरने वाले को ध्यानपूर्वक अस्पष्ट करें और मध्यम प्लस ईबी के 0.5 एमएल से कम छोड़ दें
  10. 100 मिलीलीटर से कम बीज, बीजलेट संस्कृति माध्यम के 10 एमएल के साथ जिलेटिन-लेपित टिशू कल्चर डिशियम पर बीज। व्यंजन को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें।

2. सेल गोली संरचना और चौंड्रोसाइट भेदभाव

  1. 0.25% ट्रिप्सिन / एथिलेनेयनिएनेट एट्रिक एसिड (ईडीटीए) के 10 एमएल करें। 80 एमएल का बस बनाओअल संस्कृति माध्यम: 20% एफबीएस, 1x अनावश्यक अमीनो एसिड, 55 सुक्ष्ममापी 2-मर्कैपटोथानॉल, और 2 मिमी एल-ग्लूटामाइन के साथ डीएमईएम पूरक।
  2. 10 एमएल का चोंड्रोजनीक भेदभाव माध्यम: 10% इंसुलिन-ट्रांसफिरिन-सेलेनियम समाधान (आईटीएस), 0.1 माइक्रोन डेक्समैथासोन, 1 एमएम एस्कॉर्बिक एसिड, 1% सोडियम प्यूरवेट, और 10 एनजी / एमएल के साथ डीएमईएम (उच्च ग्लूकोज) को बढ़ाते हुए विकास कारक- बीटा 1 (टीजीएफ-β1)
  3. 48 घंटे के बाद बेसल संस्कृति माध्यम के 10 एमएल के साथ माध्यम को ताज़ा करें इसके बाद, हर तीन दिनों में बेसल संस्कृति माध्यम के 10 एमएल के साथ माध्यम को ताज़ा करें।
    नोट: संस्कृति में 10 दिनों के बाद, फाइब्रोब्लास्टिक सेल का विकास ईबी से बढ़ाया जाना चाहिए था।
    1. प्रयोग के पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 0.1 मिमी जिलेटिन के 4 एमएल के साथ 100 मिमी व्यंजन को कोट करें। सेल सतह पर तैरनेवाला को त्यागें और एक बार डुलबेको के फॉस्फेट-बफर्ड सलाईन (डीपीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    2. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 एमएल के 0.25% ट्रिप्सिन / ईडीटीए के साथ कोशिकाओं को डाइजेस्ट करें और 4 मीटर के साथ बेअसर करेंमूल संस्कृति संस्कृति का एल
  4. कोशिकाओं को एक कोशिकाओं में 5-10 बार pipetting और नीचे और उन्हें 70 माइक्रोन नायलॉन जाल के माध्यम से पारित करके अलग करना। 5 मिनट के लिए 200 xg पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र एक नए 100 मिमी, जिलेटिन-लेपित टिशू कल्चर डिश पर 10 मिलीलीटर बेसल संस्कृति माध्यम के साथ कोशिकाओं को फिर से बीज दें।
  5. 48 घंटे के बाद बेसल संस्कृति माध्यम के 10 एमएल के साथ माध्यम को ताज़ा करें इसके बाद, हर तीन दिनों में बेसल संस्कृति माध्यम के 10 एमएल के साथ माध्यम को ताज़ा करें।
    नोट: कोशिकाओं को एक समरूप, फाइब्रोब्लास्ट जैसे आकारिकी प्राप्त होता है।
  6. जब ~ 90-100% संगम तक पहुंच जाता है ( यानी, लगभग 5-7 दिन), तो 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 एमएल की 0.25% ट्रिप्सिन / ईडीटीए के साथ कोशिकाओं काटा। बेसल संस्कृति माध्यम के 4 एमएल के साथ बेअसर। कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं में 5 बार pipetting और नीचे pipetting द्वारा अलग करना। सेल नंबर की गणना करने के लिए एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करें
    1. 15 एमएल पॉलीप्रोपीलेन ट्यूब में 3 एक्स 10 5 कोशिका रखें। 200 XG पर अपकेंद्रित्रकमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए (आरटी) 1 एमएल ऑफ़ कॉंड्रोजेनिक भेदभाव माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करना।
  7. 3 मिनट के लिए 300 xg में कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित करें और छोटे गोली रूप में कोशिकाओं को बनाए रखें। ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 21 दिनों के लिए रखें। ढक्कन को कसकर पेंच और गैस एक्सचेंज को न दें।
  8. ताजा chondrogenic भेदभाव माध्यम के साथ 3/4 संस्कृति माध्यम हर तीन दिन बदलें।
    नोट: संस्कृति के 21 दिनों के बाद, हायपीएससी-चोंड्रोजेनिक छर्रों (हायपीएससी-चान) का गठन होना चाहिए था। मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी), सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, चोंड्रोजेनिक छर्रों (एचएमएससी-चान) बनाने के लिए 21 दिनों के लिए चोंड्रोजेनिक भेदभाव माध्यम में एकत्र और सुसंस्कृत होते हैं।

3. चोंड्रोजेनिक भेदभाव का विश्लेषण

  1. 10% तटस्थ buffered formalin के 10 एमएल तैयार करें
  2. 0.1% एलिसियन नीले अभिकर्मक के 50 एमएल और 1% टोलुइडाइन नीले अभिकर्मक के 50 एमएल तैयार करें।
  3. पीआरप्राथमिक एंटीबॉडी के 1 एमएल का संस्करण: कोलेजन II (1:50) या कोलेजन एक्स (1:50) के खिलाफ माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के खिलाफ खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी। इसके अलावा, विरोधी खरगोश या माउस माध्यमिक एंटीबॉडी तैयार करें
  4. पपीन समाधान के 1 एमएल करें: पीबीएस में 0.1 एम सोडियम एसीटेट, 2.4 एमएम ईडीटीए, और 5 एमएम एल-सिस्टीन के साथ 10 यू / एमएल।
  5. 100 एमएल डाइमिथाइलमैथिलीन नीले रंग (डीएमएमबी) डाई समाधान करें: 100 μL का 16 मिलीग्राम / एल 1 9-डाइमिथाइलमिथिलिन नीला, 40 मिमी ग्लाइसीन, 40 मिमी NaCl, और 9.5 मिमी एचसीएल; पीएच 3.0
  6. गोली वर्गों के एलिसियन नीले और टोलुइडाइन नीले दाग द्वारा चोंड्रोजेनिक भेदभाव का आकलन करें।
    1. 24 घंटे के लिए 10% तटस्थ buffered formalin के 1 एमएल में एक hiPSC- चोन गोली या एचएमएससी-चोन गोली ठीक करें।
    2. गोली को एच 2 ओ में 70% इथेनॉल में 1 एमएल तक स्थानांतरित करें। एक ग्रेडेड इथेनॉल श्रृंखला ( यानी, 25, 50, 75, 90, 95, 100, और 100%, 3 मिनट प्रत्येक) के साथ 1 एमएल गोली मारो।
    3. गोली को 1 एमएल 100% xylene में तीन बार बताएं। Infiltratएक 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में 1 घंटे के लिए पैराफिन के साथ गोली। 7 x 7 x 5 मिमी 3 आधार ढालना के साथ पैरिफिन ब्लॉकों में गोली को जमा करें, जो कि नियमित हिस्टोलॉजिकल प्रक्रियाओं के बाद 6 ।
    4. लगभग 4 माइक्रोन 7 की मोटाई के साथ माइक्रोटॉम द्वारा आसन्न वर्गों को बनाएं। कांच के स्लाइड्स पर वर्गों का पालन करें
    5. एक ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए स्लाइड्स सूखी। 100% xylene का उपयोग करते हुए तीन चक्रों (3 मिनट प्रत्येक) में वर्गों को अलग करना।
    6. रिहाइड्रेशन ( यानी, 100, 100, 95, 95, 70, 50 और 25% एच 2 ओ, 3 मिनट प्रत्येक में) के लिए घटते शराब श्रृंखला का उपयोग करें और फिर 5 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी के साथ अंतिम कुल्ला करें।
    7. 0.1% एलिसियन नीले अभिकर्मक या 4-5 घंटे के लिए 1% टोलुइडिन नीले धुंधले के साथ वर्गों को दाग़ाना और फिर उन्हें आसुत पानी से कुल्ला।
    8. एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला ( यानी, 25, 50, 75, 90, 95, 100 और 100%, 3 मिनट प्रत्येक) के साथ निर्जलीकरण, लगातार तीन बार100% xylene में स्पष्टीकरण की ईपीएस स्लाइड्स माउंट करें और उन्हें माइक्रोस्कोप के नीचे देखें।
  7. Immunohistochemistry प्रदर्शन
    नोट: अतिरिक्त गोली अनुभाग आगे immunohistochemistry द्वारा मूल्यांकन किया जाता है।
    1. डेराफिनाइजेशन और रिहाइड्रेशन के बाद, स्लाइड्स को 1 एमएम EDTA, पीएच 8.0 (आटोक्लेव द्वारा उबला हुआ पानी में पनरोक) में उबाल लें। उन्हें एक उप-उबलते तापमान पर 8 मिनट तक बैठने दें और फिर स्लाइड को आरटी पर शांत करने दें।
    2. विआयनीकृत पानी के साथ स्लाइड्स को कुल्ला 3 बार अंतर्जात पेरोक्साइड गतिविधि को अवरुद्ध करने के लिए 15 मिनट के लिए आरटी पर मेथनॉल में 3% H 2 O 2 समाधान में सेक्शन को सेते हैं।
    3. विआयनीकृत पानी के साथ स्लाइड्स कुल्ला और उन्हें डीपीबीएस में 5 मिनट के लिए विसर्जित करें। स्लाइड्स पर अनुभागों में उचित रूप से पतला (1:50) प्राथमिक एंटीबॉडी के 50-100 μL को लागू करें और फिर उन्हें 1 घंटे के आरटी पर एक आर्मिडिएटेड कक्ष में सेते हैं।
    4. डीपीबीएस के साथ स्लाइड्स को 3 गुना (प्रत्येक 5 मिनट) धो लें सा सेते हैंआरटी पर 15 मिनट के लिए संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी ( यानी, एंटी-खरगोश या माउस) के साथ नमूनों
    5. डीपीबीएस के साथ स्लाइड्स को 3 बार धोएं (5 मिनट प्रत्येक के लिए) माइक्रोस्कोप के तहत थपका पता लगाना
    6. डीपीबीएस के साथ स्लाइड्स को 3 गुना (2 मिनट प्रत्येक) धो लें 1-2 मिनट के लिए हेमटोक्सीकलीन में स्लाइड्स को डुबोकर सेल नाभिक का प्रतिरोध करें एक श्रेणीबद्ध इथेनॉल श्रृंखला (25, 50, 75, 90, 95, 100, और 100%; 3 मिनट प्रत्येक) के साथ निर्जलीकरण, xylene के साथ लगातार तीन चरणों का स्पष्टीकरण अंत में, स्लाइड्स माउंट करें और माइक्रोस्कोप के तहत उन्हें कल्पना करें।
  8. एसजीएजी सामग्री का पता लगाएं
    1. 2 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर पपैन समाधान में डायजेस्ट चोंड्रोजेनिक छर्रों
    2. डीएसडीएनए परख किट और फ्लोरामीटर सिस्टम का उपयोग करके डीएनए सामग्री का निर्धारण करें। 525 एनएम 8 पर शोषक को मापने के तहत डीएमएमबी डाई समाधान के साथ मिलाकर एसजीएजी सामग्री को मापें।
    3. एक मानक वक्र के खिलाफ एसजीएजी की एकाग्रता की गणना करेंशार्क चांड्रोइटिन सल्फेट
  9. HiPSC-chon छर्रों में चोंड्रोजेनिक भेदभाव मार्करों का वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण करें।
    1. एक ट्यूब के लिए 500 μL बर्फ-ठंड निष्कर्षण अभिकर्मक जोड़कर एक ही चोंड्रोजेनिक छर्रों का 3-4 काटा। भंवर अच्छी तरह से आरटी पर 5 मिनट के लिए नमूना सेते हैं
    2. क्लोरोफॉर्म के 0.1 एमएल जोड़ें। भंवर 15 एस के लिए नमूना और 3 मिनट के लिए आरटी पर इसे सेते हैं। नमूना 15 मिनट के लिए 12,000 xg और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र ऊपरी जलीय चरण (लगभग 250 μL) को एक नया 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. नमूनों में 25 μL सोडियम एसीटेट और 1 μL ग्लाइकोजन जोड़ें। इसे आरओएन को 250 μL आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ मिलाकर अवशोषित करें। अच्छी तरह से मिश्रण। 10 मिनट के लिए आरटी पर नमूना सेते
    4. अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 12,000 xg और 4 डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से निकालें आरएनए गोली को 500 μL 75% इथेनॉल के साथ दो बार धो लें।
    5. 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र7,500 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी बचे हुए इथेनॉल को निकालें और 5-10 मिनट के लिए आरएनए गोली हवा में डाल दें। 10 μL न्युकेलेज-फ्री पानी में आरएनए भंग करें।
    6. एक रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ सिस्टम का उपयोग करके सीएनएनए में आरएनए को परिवर्तित करें। सीडीएनए नमूनों को वास्तविक समय पीसीआर के लिए qPCR किट मास्टर मिश्रण (2x) और एक वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम 9 का प्रयोग करें ।
      नोट: प्राइमर अनुक्रम हैं:
      एच AGGRECAN- एफ: टीसीजीएजीएजीएजीसीजीएजीजीसीसी;
      एच अगर्गन -आर: टीसीजीजीजीजीटीजी TAG सीजीटीजीटीएजीएए;
      एच β-ACTIN -F: टीटीटीजीएटीएजीएटीएजीएसीटीटीसीजीटीसीसीसीसी;
      एच β-ACTIN -R: जीजीटीसीटीसीएएजीटीटीजीटीएसीएजीएजीएएजीसी;
      एच कॉल 2 -एफ: टीजीजीएसीएजीएटीसीएजीजीसीएजीएएसीसी;
      एच कॉल 2 -आर: जीसीटीसीसीजीजीएटीसीसीटीसीएएटीटीटी;
      एच एसओएक्स 9- एफ: एजीसीजीएसीएजीसीसीएसीएटीएसीएएएसीएसी;
      एच एसओएक्स 9 -आर: सीटीजी TAGGCGATCTGTTGGGG;
      एच कॉल 10- एफ: एटीजीसीटीसीसीसीएएएटीएसीसीसीटीटीटी;
      घंटा COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT

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Representative Results

हायपीएससी के चोंड्रोजेनिक भेदभाव:

ईईबी गठन माध्यम और बेसल संस्कृति माध्यम का इस्तेमाल हायपीएससी को मेसेनचिमल वंश में अंतर करने के लिए किया गया था। एक बहु-कदम संस्कृति पद्धति का उपयोग किया गया था ( चित्रा 1 )। सबसे पहले, एचईपीएससी को 10 दिनों (डी 10; चित्रा 2 ए ) के लिए ईबी के गठन के माध्यम से सहज रूप से विभेदित किया गया था। दूसरा, सेल 10 दिनों (डी 10 + 10) के लिए ईबी से आगे निकल गए। इन दो चरणों के दौरान, आईपीएससीएस ने धीरे-धीरे अपने मूल रूपों को खो दिया और स्पिंडल के आकार का आकारिकी ( चित्रा 2 बी ) प्राप्त किया, जो फिर बीतने के बाद एक फाइब्रोब्लास्टिक आकार में बदल गया। तीसरा, उपसंस्कृति ( चित्रा 2 सी ) के बाद मोनोलायर में कोशिकाओं का विस्तार किया गया। इस चरण के दौरान अवशिष्ट अंतर्निहित कोशिकाओं को बाहर रखा गया था। इसके बाद, कोशिकाओं को विस्तारित किया गया और बाद में फाइब्रोब्लास्टिक जैसी कोशिकाओं के लिए तैयार किया गयामोनोलेयर संस्कृति में 5-7 दिन (डी 10 + 10 + 7) चौथा, जब हायपीएससी-फाइब्रोब्लास्टिक जैसी कोशिकाएं (एचपीएससी-एफ) लगभग 9 0% संगम पर पहुंच गईं, तो उन्हें 3 डी गोली संस्कृति ( चित्रा 2 डी ) 10 के माध्यम से चांड्रोसाइट्स में अंतर करने के लिए प्रेरित किया गया।

हायपीएससी-चान छर्रों की विशेषता:

हायपीएससी-एफ 21 दिनों के लिए गोली में 15 एमएल पॉलीप्रोपीलेन ट्यूबों में सुसंस्कृत थे। चोंद्र्रोजनिक कोशिका इन विट्रो में इकट्ठा हो सकती हैं और उच्च घनत्व संस्कृति में जब एक विशिष्ट बाह्य मैट्रिक्स का उत्पादन कर सकता है। संस्कृति के अंत में, हम एक घने, कार्टिलेज जैसे कुल मिलाकर देख सकते हैं, हायपीएससी-चोन गोली, जो 2-3 मिमी लंबी और 3 मिमी मोटी ( चित्रा 2 डी ) तक थी। कोशिकाएं एलिसियन नीले रंग ( चित्रा 3 ए ) और टोलुइडिन नीले रंग ( चित्रा 3 बी ) धुंधला हो जाने के लिए सकारात्मक थीं, जिसने सफलता का संकेत दियाऊपरी छतरियों का उल चोंड्रोजेनिक भेदभाव कोलेजन II ( चित्रा -3 सी ) और कोलेजन एक्स ( चित्रा 3 डी ) के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विश्लेषण ने यह भी साबित कर दिया कि हायपीएससी-चान छर्रों ने एक क्रॉन्ड्रोसाइट की तरह फेनोटाइप विकसित किया था। कोलेजन द्वितीय और कोलेजन एक्स के लिए इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री की नकारात्मक नियंत्रण बेहतर सकारात्मक धुंधला साबित करने के लिए प्रदर्शन किया गया (डेटा नहीं दिखाया गया है) 5।

सीजीएजी विश्लेषण को क्ंड्रोोजेनिक भेदभाव ( चित्रा 3 ई ) के बाद भी किया गया था। एसईजीएजी सामग्री हायपीएससी-चान छर्रों, एचपीएससी-एफ, ईबीएस, और एफ़आईपीसीआईएटेड हायपीएससी में मिलीं। एसजीएजी सामग्री अन्य समूहों ( पी <0.05) की तुलना में hiPSC-chon छर्रों में भली भांति अपग्रेड कर दी गई थी। एचएमएससी-चोन के सकारात्मक नियंत्रण में, एसजीएजी सामग्री को भी एचएमएससी की तुलना में काफी कम कर दिया गया था ( पी <0.05)। हालांकि, एसजीएजी सामग्रीएचएमएससी छर्रों और हायपीएससी-चोन छर्रों के बीच कोई अंतर नहीं दिखा ( पी > 0.05)।

चोंड्रोजेनिक भेदभाव मार्करों के जीन अभिव्यक्ति:

चोंद्र-पूर्वज वंश ( एसओएक्स 9 और सीएल 2 ) के लिए भेदभाव के मार्करों की जीन की अभिव्यक्ति और चोंद्रेोजेनिक छर्रों ( चित्रा 4 ) के फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए पूरी तरह से विभेदित चॉन्ड्रोसाइट्स ( एग्रेकैन और कॉल 10 ) का इस्तेमाल किया गया था। एचपीसीएस , हायपीएससी -एफ, और हायपीएससी -चोन छल्ले के बीच तुलना में, सीओ 2 , सीओएलए , सीओएल , एसओएक्स 9 और एग्रेकैन के भाव अन्य समूहों ( पी <0.05) की तुलना में हायपीएससी -चोन में काफी हद तक कम हो गए हैं। एचएमएससी-चोन के सकारात्मक नियंत्रण में, इन मार्करों की अभिव्यक्ति भी एचएमएससी ( पी <0.05) की तुलना में काफी हद तक नियंत्रित हुई थी। हालांकि, एचएमएस के बीच जीन की अभिव्यक्तिसी छर्रों और hiPSC- चान छर्रों में कोई अंतर नहीं दिखा ( पी > 0.05)। कुल मिलाकर, ये परिणाम मानव आईपीएसएससी से एक सफल चोंड्रोजेनिक भेदभाव की प्रक्रिया का सुझाव देते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन मानव आईपीएसएससी को चौंड्रोसाइट्स में अंतर करने के लिए एक बहु-कदम संस्कृति पद्धति शामिल है, जिसमें निम्न शामिल हैं : 1) ईबी निर्माण के माध्यम से सहज अंतर, 2) ईबीएस से कोशिका परिणाम, 3) उपसंस्कृति के बाद मोनोलिएर सेल संस्कृति, और 4) 3 डी गोली संस्कृति। Chondrocyte phenotype का विश्लेषण हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, जैव रासायनिक विश्लेषण, और चोंड्रोजेनिक जीन अभिव्यक्ति द्वारा किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 2: हायपीएससी से चांड्रोसाइट्स की जनरेशन। ( ए ) डी 10 पर ईबी गठन स्केल बार = 100 माइक्रोन ( बी ) डी 10 + 10 पर ईबी से सेल का परिणाम स्केल बार = 100 माइक्रोन ( सी ) डी 10 + 10 + 7 पर मोनोलिएर सेल कल्चर स्केल बार = 100 माइक्रोन ( डी ) 3 डी गोली संस्कृति यह आंकड़ा हमारे पिछले 5 अध्ययन से संशोधित किया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: हायपीएससी-चान छल्ले का लक्षण वर्णन ( ए ) एल्शियम नीले धुंधला हो जाना और ( बी ) टोलुइडेन ब्ल्यू स्केनिंग ऑफ ग्लिसोसिनोग्लाइकेंस और प्रोटीयोग्लाइकान। स्केल बार = 100 माइक्रोन ( सी और डी ) कोलेजन II और कोलेजन एक्स के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ई) hiPSCs, ईबीएस, और hiPSC-एफ hMSCs बनाम hMSC-शॉन के साथ तुलना बनाम hiPSC-शोन छर्रों के बायोकेमिकल लक्षण वर्णन। एसजीएजी प्रति डीएनए बार मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है एन = 3, * पी <0.05 यह आंकड़ा हमारे पिछले 5 अध्ययन से संशोधित किया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। एचपीएससी -चान बनाम एचपीएससीएस और हायपीएस में चोंड्रोजेनिक भेदभाव मार्करों ( सीओ 2 , कॉल 10 , एसओएक्स 9 और एग्रेकैन ) का आरटी-क्यूपीसीआर जीन एक्सप्रैक्शन विश्लेषणएचएमएससी-चोन बनाम एचएमएससी की तुलना में सीएफ़ बार मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है एन = 3, * पी <0.05 यह आंकड़ा हमारे पिछले 5 अध्ययन से संशोधित किया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

यहां, हम आईपीएससी के माध्यम से पीबीसी से चॉन्ड्रोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। क्योंकि पीबीसी अधिक सामान्य और चिकित्सीय क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, उन्हें रिप्रोग्रागम के लिए संभावित विकल्प के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस अध्ययन में, एपिसोमोल वैक्टर (ईवी) का प्रयोग पीबीसी को आईपीएससी में reprogram करने के लिए किया गया, झांग एट अल द्वारा स्थापित विधि के अनुसार 11 इस एकीकरण से मुक्त दृष्टिकोण में वायरस-संबद्ध जीनोटॉक्सिसिटी को एकीकृत करने की आवश्यकता नहीं है, जिसे माना जाता है कि नैदानिक ​​क्षेत्र 12 , 13 में इसका व्यापक प्रभाव है। इस अध्ययन में रक्त कोशिकाओं से एकीकरण-मुक्त आईपीएससीएस तैयार करने की रिप्रोग्रागमिंग दक्षता संतुष्ट थी। परिधीय रक्त के 2 एमएल से 30 से अधिक iPSC का उत्पादन किया जा सकता है इसलिए, पीबीसी में उपास्थि इंजीनियरिंग और अन्य नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए आईपीएससीएस उत्पन्न करने वाली बीज कोशिकाओं की क्षमता है।

चोंद्र्रोजनिक अंतर के मुख्य कदमएचपीएससी से उद्घोषणा शामिल है: ईबी निर्माण, ईबी, सेलोलयर कल्चर और 3 डी गोली संस्कृति से सेल आउटग्राथ। अंडरिपिन्फेनिएटेड हायपीएससी कॉलोनियों को अग्नि-खींचा गिलास सुई का उपयोग करके छोटे टुकड़ों में विच्छेदित किया जाता है। अधिग्रहण पर कम क्षति और विशिष्ट आकार (व्यास में 50 - 100 माइक्रोन) की वजह से यांत्रिक तकनीक, हालांकि अधिक तकनीकी, एंजाइमेटिक पाचन (जैसे डिस्पेज या कोलेजनेश) से बेहतर है। इसके अलावा, यांत्रिक पाचन मैन्युअल रूप से फीडर कोशिकाओं का निपटान कर सकता है, जो हायपीएससी भेदभाव को दबानेगा। हिमाचल प्रदेश एसईएस ईएस बनाने के लिए स्वैच्छिक रूप से अंतर करते हैं, जो चिकनी सीमाओं के साथ त्रि-आयामी, बहु-सेलुलर समुच्चय के रूप में वर्णित हैं। कई ईबीएस अनियमित आकार बनाने के लिए एक साथ क्लस्टर कर सकते हैं। ईबी को अच्छी परिस्थितियों में बनाए रखने के लिए, 100 एमबी से कम, 100 एमबी, गैर-अनुज्ञापत्र पेट्री डिश में 10 एमएल ईबी फॉर्मेशन माध्यम के साथ सुसंस्कृत किया जाता है। एक 100 मिमी पकवान में लगभग 50 ईबीएस सर्वोत्तम एकाग्रता माना जाता है। फिर ईबीएस पर वरीयता दी जाती है 10 सेमी तक, बेसल संस्कृति माध्यम के साथ जिलेटिन-लेपित व्यंजन। ईबी के पर्याप्त परिणाम के लिए ईबीएस के वितरण का घनत्व महत्वपूर्ण है। 100 एमबी डिश पर कम से कम 100 ईबी सुसंस्कृत हैं संस्कृति के 10 दिनों के भीतर, फाइब्रोब्लास्टिक कोशिकाओं को धीरे-धीरे खत्म कर दिया जाता है और ईबी से विस्तार किया जाता है। ईओबी में मौजूद शेष अवनीत कोशिकाओं को छोड़ने के साथ-साथ मेसेनचिमल वंश के लिए प्रतिबद्ध कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए monolayer कदम किया जाता है। 0.5-1 x 10 6 कोशिकाओं को मोनोलायर सेल संस्कृति के लिए 100 मिमी के डिब्बे में वरीयता दी जाती है। एचपीसीसी-एफ पर सेल की सतह के मार्करों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण हमारे पिछले अध्ययन 5 में प्रवाह-साइटमैट्रिक विश्लेषण द्वारा किया गया था। परिणाम दिखाते हैं कि एचपीएससी-एफ के बहुमत ने सीडी 773 (81.81 ± 2.05%) और सीडी 10 5 (एंडोग्लिन; 81.90 ± 1.61%) को व्यक्त किया है, जो कि सकारात्मक मानव मेसेनचिमल मार्कर हैं। इसके अलावा, इन तरीकों के पुनरुत्पादन के लिए छह अलग आईपीएससी और एक मानव भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) का उपयोग किया गया है

Plutipotent कोशिकाओं का प्रेरित chondrogenic भेदभाव भी एक जटिल प्रक्रिया है, इस दृष्टि से, क्लासिक क्रोन्डरोजेनिक माध्यम को हिमशिप सीसेज़ से चोंड्रोजेनेसिस के लिए उपयोग किया जाता है। टीजीएफ-बीटा 1 और डेक्सैमेथेसोन को गोली संस्कृति माध्यम में पूरक बनाया गया है। chondrogenic संभावित क्षमताओं 14 पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव प्रदर्शन किया गया है। अन्य प्रोटोकॉल से एक और अंतर यह 10% इसके की एकाग्रता, जो की तुलना में आम तौर पर सूचना दी 1% इसके 15, 16। 1% इसके प्लस 10% एफबीएस बढ़ाया बहुत अधिक है था अन्य तरीकों 17 , 18 में उपास्थि गठन। सीरम के विकल्प के रूप में यह चोंड्रोसाइट विस्तार और गठन और चोंड्रोजेनिक फेनोटाइप को बढ़ावा दे सकता है। एफबीएस के पशु घटकों को बदलने के लिए, हमने इसकी 10% की एकाग्रता को उन्नत किया, जो साबित हो चुका है कुशलता प्रोमो के लिएते चांड्रोसाइट भेदभाव 7

एक उच्च-घनत्व सेल संस्कृति, चोंड्रोजेनिक भेदभाव के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है। कई अन्य कोशिका संस्कृति के तरीकों का उपयोग किया जा सकता है जो कि चोंद्रजन्य भेदभाव, जैसे कि माइक्रोमास संस्कृति, अन्य कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति, जैव-सामग्री-आधारित संस्कृति और आनुवंशिक हेरफेर 1 , 1 9 , 15 को प्रेरित करता है। हमारे अध्ययन में 3 डी गोली संस्कृति, जिसके परिणामस्वरूप एक उच्च कोशिका घनत्व और उच्च सेल-सेल इंटरैक्शन होता है, अन्य कोशिकाओं या सामग्रियों के बिना प्रदर्शन करना आसान है। चूंकि यह 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में किया जाता है, एक सीमा यह है कि यह केवल एक छोटे पैमाने पर चोंड्रोजेनिक भेदभाव परख में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, गोल-पूंछ के साथ 96-अच्छी तरह प्लेटें एक होनहार विकल्प 7 के रूप में इस्तेमाल की जा सकती हैं। इसलिए, सांस्कृतिक तरीकों में अन्य सुधारों में चोंड्रोजेनिक की दक्षता को बढ़ावा दिया जा सकता हैइन विट्रो में भेदभाव हमारे अध्ययन में, 21 दिन तक चोंड्रोजेनिक प्रेरण सीरम मुक्त और एक्सो-मुक्त स्थिति के तहत किया जाता था, जिसके दौरान सभी पशु-संबंधित घटक हटा दिए गए थे। इसलिए, हमारे अध्ययन की प्रक्रिया भविष्य के नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलनीय है।

ऐसा माना जाता है कि ऑटोलॉगस स्टेम कोशिका उपास्थि की मरम्मत के लिए आदर्श विकल्प होगी, क्योंकि न केवल अस्वीकृति में कमी आ सकती है, लेकिन भ्रूण के विकास के प्राकृतिक पाठ्यक्रम 20 , 21 का फायदा उठाकर ऊतक पुनर्जनन प्राप्त भी हो सकता है। हालांकि, वे इन विट्रो 22 में सीमित प्रजनन क्षमता पाए गए थे। इसलिए, आईपीएससी के माध्यम से पीबीसी से चांड्रोसाइट्स पैदा करने के लिए एक एकीकरण-मुक्त पद्धति उपास्थि टिशू इंजीनियरिंग के लिए एक अधिक आशाजनक दृष्टिकोण हो सकती है। हमारे विधि के साथ, 2 मिलीलीटर का रक्त रोगी-विशिष्ट क्रोंड्रोसाइट्स को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त हो सकता है जो कार्टिलेज के शौच के लिए आवश्यक होता हैts। इसके अलावा, हम एचएमएससी को आईपीएससी से विभेदित कोशिकाओं के साथ तुलना करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में भी इस्तेमाल करते थे, जो सुझाव देते हैं कि आईपीएससी में अच्छा चोंड्रोजेनिक भेदभाव संभावनाएं हैं।

निष्कर्ष में, यह अध्ययन साबित करता है कि पीबीसी का उपयोग चोंद्रासाइट पुनर्जनन के लिए उम्मीदवारों के रूप में किया जा सकता है। इससे पुनर्योजी दवा के लिए रोगी-विशिष्ट और लागत प्रभावी दृष्टिकोण में उपास्थि की मरम्मत के लिए बीज कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए भविष्य की दिशा को और भी प्रदर्शित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक अपने प्लास्मिड के लिए ज़ियाओबिन जांग को धन्यवाद देना चाहते हैं। प्रयोग के दौरान हम अपनी तरह की मदद के लिए शेरोंग गाओ और क़ियान्फी वाँग का भी धन्यवाद करते हैं। यह अध्ययन चीन के नेशनल नैचुरल साइंस फाउंडेशन (नं। 81101346, 81271 9 63, 81100331), बीजिंग 215 उच्च स्तरीय प्रतिभा परियोजना (नोयर -3-3255), और बीजिंग चाओ-यांग अस्पताल फंड (नं। । सीवाईएक्स-2017-01), और यूथ इनोवेशन प्रमोशन एसोसिएशन ऑफ चाइनीज़ एकेडमी ऑफ साइंसेज (वाईएल)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knockout DMEM Invitrogen 10829018 Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium
Knockout Serum Replacement (KSR) Invitrogen 10828028 A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone sh30070.03 Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture
Nonessential amino acids Chemicon TMS-001-C Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability
L-glutamine Invitrogen TMS-002-C An amino acid required for cell culture
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Peprotech 100-18B A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs
Dispase Invitrogen 17105041 Used for hiPSC dissociation for subculture
DMEM Gibco C11960 Basal medium used for MSC culture medium
0.1% gelatin Millipore ES-006-B Used for cell attachment onto the dishes
0.25% trypsin/EDTA Gibco 25200072 Used for cell dissociation
DPBS Gibco 14190250 A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing
2-mercaptoethanol invitrogen 21985023 Used as a growth supplement in all the cell culture medium.
ITS invitrogen 41400045 Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation.
Ascorbic acid Sigma 4403 Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property.
Sodium pyruvate Gibco 11360070 Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose.
Transforming growth factor-beta 1 Peprotech AF-100-21C A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation.
Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II Abcam ab34712 This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues.
Mouse monoclonal antibodies to Collagen X Abcam ab49945 This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes.
Permount Fisher Scientific SP15-100 For mounting and long-term storage of slides
Toluidine blue Sigma 89640 Used for proteoglycans detection.
Alcian blue Amresco #0298 Used for glucosaminoglycans detection.
Papain Sigma P4762-25MG Used to digest chondrogenic pellets.
Dimethylmethylene blue Sigma 341088-1G Used to quantitate glycosaminoglyans
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage Sigma C4384-250MG Used to draw the standard curve for sGAG content measurement.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851 (100) Used to determine DNA content
TRIzol Invitrogen 15596018 Used for RNA isolation from cells
Reverse Transcriptase System Promega A3500 Used to convert RNA into cDNA
SYBR FAST qPCR kit Master Mix Kapa KK4601 Used for Real-time PCR

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References

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Li, Y., Hai, Y., Chen, J., Liu, T. Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (125), e55722, doi:10.3791/55722 (2017).

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