Summary
Presentamos un protocolo para generar un linaje condrogénico a partir de sangre periférica humana (PB) a través de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando un método de integración libre, que incluye la formación de células embrionarias (EB), expansión de células fibroblásticas y inducción condrogénica.
Abstract
En este estudio, hemos utilizado las células sanguíneas periféricas (PBC) como células de semillas para producir condrocitos a través de inducida por células madre pluripotentes (iPSCs) en un método de integración libre. Después de la formación del cuerpo embrionario (EB) y la expansión de las células fibroblásticas, las iPSC se indujeron para la diferenciación condrogénica durante 21 días en condiciones sin suero y sin xeno. Después de la inducción de los condrocitos, los fenotipos de las células se evalúan mediante análisis morfológicos, inmunohistoquímicos y bioquímicos, así como por el análisis cuantitativo en tiempo real de los marcadores de diferenciación condrogénica. Los gránulos condrogénicos muestran coloración alcian azul positivo y tinción con azul de toluidina. La inmunohistoquímica de la tinción con colágeno II y X también es positiva. El contenido de glicosaminoglicano sulfatado (sGAG) y los marcadores de diferenciación condrogénica COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 y AGGRECAN están significativamente regulados positivamente en chondGránulos rogénicos en comparación con hiPSCs y células fibroblásticas. Estos resultados sugieren que los PBC pueden ser utilizados como células de semilla para generar iPSCs para la reparación del cartílago, que es específico del paciente y rentable.
Introduction
El tejido del cartílago tiene una capacidad muy baja para auto-reparación y regeneración. Varias intervenciones quirúrgicas y tratamientos biológicos se utilizan para restaurar el cartílago y la función de las articulaciones, con resultados insatisfactorios. El reciente desarrollo de la tecnología de células madre puede cambiar todo el campo de reparación de cartílago 1 . Varias células madre han sido estudiadas como células de semillas, pero las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSCs) parecen ser la opción más prometedora, ya que pueden proporcionar muchos tipos de células específicas del paciente sin causar reacciones de rechazo 2 . Además, pueden superar la limitada naturaleza proliferativa de las células adultas y mantener su auto-renovación y habilidades pluripotentes. Además, la orientación génica puede usarse para cambiar el genotipo para obtener tipos específicos de condrocitos.
Los fibroblastos han sido ampliamente utilizados para generar iPSCs porque sus potenciales de reprogramación también han sido bien estudiados.Sin embargo, todavía hay algunas limitaciones que deben ser superadas, como la biopsia dolorosa de los pacientes y la necesidad de la expansión in vitro de los fibroblastos, lo que puede dar lugar a mutaciones genéticas [ 3] . Recientemente, los PBCs resultaron ventajosos para la reprogramación 4 ; Además, eran comúnmente utilizados y abundantemente almacenados. Es posible que puedan reorientar el enfoque del estudio de la piel. Sin embargo, a nuestro leal saber y entender, hay pocos informes sobre reprogramación PBC seguida de diferenciación en condrocitos.
En el presente estudio, utilizamos PBCs como una fuente alternativa de reprogramar en iPSCs y luego diferenciar el iPSCs en el linaje condrogénico a través de un sistema de cultivo de pellets con el fin de imitar la formación de condrocitos.
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Protocol
El protocolo para la generación de HiPSCs de PBC se puede encontrar en nuestro estudio anterior [ 5] . El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de nuestra institución.
1. Formación del Cuerpo Embrionario (EB)
- Hacer 50 ml de medio hiPSC: medio de Eagle modificado de Knockout Dulbecco (DMEM) suplementado con un reemplazo de suero knockout al 15% (KSR), suero bovino fetal al 5% (FBS), 1 x aminoácidos no esenciales, 2-mercaptoetanol 55 μM, 2 mM L -glutamina y 8 ng / ml de factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF).
- Hacer 50 ml de medio de formación de EB: DMEM suplementado con KSR al 15%, FBS al 5%, aminoácidos no esenciales 1x, 2-mercaptoetanol 55 μM y L-glutamina 2 mM.
- Hacer 50 ml de medio de cultivo basal: DMEM suplementado con 20% de FBS, 1 × aminoácidos no esenciales, 2-mercaptoetanol 55 μM y 2 mM de L-glutamina.
- Preparar 10 ml de solución dispasa, 1 mg / ml en DMEM knockout.
- CultuRe hiPSCs en placas de cultivo de tejidos de 60 mm con células alimentadoras ( es decir, una monocapa de células de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados). Cuando las células son 80-90% confluentes, disociar las células con dispase y paso de los hiPSCs 1: 3 cada 4-5 días. Colocar las células en una incubadora de 37 ° C y 5% de CO 2 .
- Se diseccionan las colonias hiPSC indiferenciadas en trozos más pequeños (aproximadamente 50 - 100 mu m de diámetro) usando una aguja de vidrio de extracción de fuego cuando las iPSC son confluentes al 80 - 90%. Generalmente, se usan colonias de hiPSC en un plato de 60 mm para generar EB en una placa de Petri de 100 mm.
- Cultivar menos de 100 pequeños trozos de colonias en una placa de Petri no adherente de 100 mm que contenga 10 ml de medio de formación de EB. Coloque los platos en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 .
- Reemplazar aproximadamente el 25% del medio inicial con una cantidad igual del medio basal de cultivo cada 2 días. Incline el plato para dejar que los EBs se asienten. Retire con cuidado 3 mLDel medio superior y agregar 4 ml de medio de cultivo basal fresco. No molestar a los EBs.
NOTA: Los EBs se caracterizan morfológicamente por las piezas de colonias, teniendo una apariencia redonda con bordes lisos bajo el microscopio. - Después de 10 días de cultivo en la placa de Petri no adherente, se cubre un nuevo plato de cultivo de tejidos de 100 mm con 4 ml de gelatina al 0,1% durante 30 minutos a 37ºC antes de su uso.
- Transferir el medio más EBs de 100 mm, una placa de Petri no adherente a un tubo cónico de 15 ml. Deje que los EBs sedimenten durante 4-5 min. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y dejar menos de 0,5 ml de medio más EBs
- Sembrar menos de 100 EB en un plato de cultivo de tejidos recubierto de gelatina de 100 mm con 10 ml de medio de cultivo basal. Coloque los platos en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 .
2. Formación de pastillas celulares y diferenciación de condrocitos
- Hacer 10 ml de tripsina / ácido etilendiaminotetraacético al 0,25% (EDTA). Hacer 80 ml de basAl medio de cultivo: DMEM suplementado con FBS al 20%, aminoácidos no esenciales 1x, 2-mercaptoetanol 55 μM y L-glutamina 2 mM.
- Hacer 10 ml de medio de diferenciación condrogénica: DMEM (glucosa alta) suplementado con solución de insulina-transferrina-selenio (ITS) al 10%, dexametasona 0,1 μM, ácido ascórbico 1 mM, piruvato sódico al 1% y factor de crecimiento transformante 10 ng / Beta 1 (TGF-β1).
- Refrescar el medio con 10 ml de medio de cultivo basal después de 48 h. A continuación, refrescar el medio cada tres días con 10 ml de medio de cultivo basal.
NOTA: Después de 10 días en cultivo, las proliferaciones de células fibroblásticas deberían haberse expandido desde los EB.- Recubrir las placas de 100 mm con 4 ml de gelatina al 0,1% durante 30 minutos a 37 ° C antes de su uso. Deseche el sobrenadante celular y lave las células con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) una vez.
- Se digieren las células con 3 ml de tripsina / EDTA al 0,25% a 37 ° C durante 5 min y se neutralizan con 4 mL de medio de cultivo basal.
- Disociar las células en células individuales pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces y pasarlos a través de una malla de nylon de 70 μm. Centrifugar la suspensión celular a 200 xg durante 5 min. Vuelva a sembrar las células en un nuevo plato de cultivo de tejidos recubierto de gelatina de 100 mm con 10 ml de medio de cultivo basal.
- Refrescar el medio con 10 ml de medio de cultivo basal después de 48 h. A continuación, refrescar el medio cada tres días con 10 ml de medio de cultivo basal.
NOTA: Las células adquieren una morfología homogénea similar a los fibroblastos. - Cuando se alcanza la confluencia del ~ 90-100% ( es decir, aproximadamente 5-7 días), se cosechan las células con 3 ml de tripsina / EDTA al 0,25% a 37 ° C durante 5 min. Neutralizar con 4 ml de medio de cultivo basal. Disociar las células en células individuales pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Utilice un hemocitómetro para contar el número de células.
- Coloque 3 x 10 5 células en un tubo de polipropileno de 15 ml. Centrifugar a 200 xgDurante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Re-suspender las células en 1 ml de medio de diferenciación condrogénica.
- Centrifugar las células a 300 xg durante 3 min y mantener las células en forma de pellets pequeños. Colocar el tubo en el 37 ° C y 5% CO 2 incubadora durante 21 días. No atornille la tapa firmemente y deje que el intercambio de gas.
- Reemplazar 3/4 del medio de cultivo cada tres días con medio de diferenciación condrogénica fresca.
NOTA: Después de 21 días en cultivo, deben formarse gránulos hiPSC-condrogénicos (hiPSC-Chon). También se recogen células madre mesenquimatosas humanas (MSC), como control positivo, y se cultivan en el medio de diferenciación condrogénica durante 21 días para formar pastillas condrogénicas (hMSC-Chon).
3. Análisis de la diferenciación condrogénica
- Preparar 10 ml de formalina con tampón neutro al 10%.
- Preparar 50 ml de reactivo azul alciano al 0,1% y 50 ml de reactivo azul de toluidina al 1%.
- PrEpare 1 mL de los anticuerpos primarios: anticuerpos policlonales de conejo contra el colágeno II (1:50) o anticuerpos monoclonales de ratón contra el colágeno X (1:50). También, preparar anticuerpos secundarios de conejo o de ratón.
- Hacer 1 mL de solución de papaína: 10 U / mL en PBS con acetato de sodio 0,1 M, EDTA 2,4 mM y L-cisteína 5 mM.
- Hacer 100 ml de solución de colorante azul de dimetilmetileno (DMMB): 100 μl de azul de 1,9-dimetilmetileno 16 mg / L, glicina 40 mM, NaCl 40 mM y HCl 9,5 mM; PH 3,0.
- Evaluar la diferenciación condrogénica por azul alcian y azul toluidina manchas de las secciones de pellets.
- Fijar un gránulo hiPSC-Chon o pellet hMSC-Chon en 1 mL de formalina con tampón neutro al 10% durante 24 h.
- Transferir el pellet a 1 ml de etanol al 70% en H 2 O. deshidratar el pellet con 1 ml de una serie de etanol graduada (es decir, 25, 50, 75, 90, 95, 100, y 100%, 3 minutos cada uno).
- Aclare el gránulo en 1 ml de xileno al 100% tres veces. InfiltratE el gránulo con parafina durante 1 h en un horno a 65 ° C. Incrusta el gránulo en bloques de parafina con un molde de 7 x 7 x 5 mm 3 bases, siguiendo los procedimientos histológicos de rutina 6 .
- Hacer secciones adyacentes por microtomo con un grosor de aproximadamente 4 μm 7 . Adherir las secciones sobre diapositivas de vidrio.
- Seque los portaobjetos durante 2 h a 60 ° C en un horno. Desparafinar las secciones en tres ciclos (3 min cada uno) utilizando 100% de xileno.
- Utilice una serie de alcohol decreciente para la rehidratación ( es decir, 100, 100, 95, 95, 70, 50 y 25% en H 2 O, 3 min cada uno) y luego realice un enjuague final con agua desionizada durante 5 min.
- Mancha las secciones con 0,1% de azul alciano reactivo o 1% toluidina tinción azul durante 4-5 h y luego enjuagar con agua destilada.
- Deshidratar con una serie graduada de etanol ( es decir, 25, 50, 75, 90, 95, 100 y 100%, 3 min cada), seguido de tresEps de clarificación en xileno al 100%. Montar las diapositivas y visualizarlas bajo un microscopio.
- Realizar la inmunohistoquímica.
NOTA: Las secciones de pellets adicionales se evalúan adicionalmente mediante inmunohistoquímica.- Después de la desparafinización y la rehidratación, llevar las diapositivas a ebullición en 1 mM EDTA, pH 8,0 (impermeable en agua hervida por autoclave). Dejarlos reposar durante 8 min a una temperatura de sub-ebullición y luego dejar que los portaobjetos se enfríen a TA.
- Enjuague los portaobjetos con agua desionizada 3 veces. Incubar las secciones en 3% H 2 O 2 solución en metanol a TA durante 15 min para bloquear la actividad peroxidasa endógena.
- Enjuagar los portaobjetos con agua desionizada y sumergirlos en DPBS durante 5 min. Aplique 50-100 μl de anticuerpo primario diluido apropiadamente (1:50) a las secciones de los portaobjetos y luego incube en una cámara humidificada a RT durante 1 h.
- Lavar los portaobjetos 3 veces (5 min cada uno) con DPBS. Incubar la saMples con los correspondientes anticuerpos secundarios ( es decir, anti-conejo o ratón) durante 15 min a RT.
- Lavar los portaobjetos 3 veces (durante 5 min cada uno) con DPBS. Realizar la detección de DAB bajo un microscopio.
- Lavar los portaobjetos con DPBS 3 veces (2 min cada uno). Contraste los núcleos de las células sumergiendo los portaobjetos en hematoxilina durante 1-2 min. Deshidratar con una serie de etanol graduada (25, 50, 75, 90, 95, 100 y 100%, 3 min cada uno) seguido de tres pasos consecutivos de clarificación con xileno. Finalmente, monte las diapositivas y visualícelas bajo el microscopio.
- Detectar el contenido de sGAG.
- Digerir gránulos condrogénicos en solución de papaína a 60 ° C durante 2 h.
- Determinar el contenido de ADN utilizando el kit de ensayo dsDNA y el sistema de fluorómetro. Mida el contenido de sGAG mezclándolo con solución de colorante DMMB bajo medición de absorbancia a 525 nm 8 .
- Calcular la concentración de sGAG frente a una curva estándar deSulfato de condroitina de tiburón.
- Realice el análisis PCR en tiempo real de los marcadores de diferenciación condrogénica en píldoras HiPSC-Chon.
- Coseche 3-4 de los mismos gránulos condrogénicos añadiendo 500 μl de reactivo de extracción enfriado con hielo a un tubo. Vórtice bien. Incubar la muestra durante 5 min a TA.
- Añadir 0,1 ml de cloroformo. Vórtice la muestra durante 15 s e incubar a RT durante 3 min. Centrifugar la muestra durante 15 min a 12.000 xg y 4 ° C. Transferir la fase acuosa superior (aproximadamente 250 μl) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 25 μl de acetato de sodio y 1 μl de glucógeno a la muestra. Precipitar el ARN mezclándolo con 250 μl de alcohol isopropílico. Mezcle bien. Incubar la muestra a RT durante 10 min.
- Centrifugar durante 10 min a 12.000 xg y 4 ° C. Retire completamente el sobrenadante. Lavar el sedimento de ARN dos veces con 500 μl de etanol al 75%.
- Centrifugar durante 5 minA 7.500 xg y 4 ° C. Retire todo el etanol restante y seque con aire la pastilla de ARN durante 5-10 minutos. Disolver el ARN en 10 μl de agua libre de nucleasa.
- Convertir el ARN en cDNA utilizando un sistema de transcriptasa inversa. Sujeción de las muestras de cDNA a PCR en tiempo real utilizando qPCR kit master mix (2x) y un sistema de PCR en tiempo real [ 9] .
NOTA: Las secuencias de cebadores son:
H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
H beta - ACTIN - F : TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
H beta - ACTIN - R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
H COL2 - F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
H COL2- R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
H SOX9 - F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
H SOX9- R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
H COL10- R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.
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Representative Results
Diferenciación condrogénica de hiPSCs:
El medio de formación EB y el medio basal de cultivo se utilizaron para diferenciar los hiPSCs en el linaje mesenquimal. Se utilizó un método de cultivo en múltiples etapas ( Figura 1 ). En primer lugar, los hiPSCs se diferenciaron espontáneamente a través de EB formación durante 10 días (D10, Figura 2A ]. En segundo lugar, las células superaron los EBs durante otros 10 días (D10 + 10). Durante estos dos pasos, los iPSCs perdieron gradualmente sus morfologías originales y obtuvieron morfologías en forma de huso ( Figura 2B ), que luego cambiaron a una forma fibroblástica después del paso. En tercer lugar, las células se expandieron en monocapa después de la subcultura ( Figura 2C ). Las células indiferenciadas residuales fueron excluidas durante este paso. A continuación, las células se expandieron y se comprometieron a células fibroblásticas después de5-7 días en cultivo monocapa (D10 + 10 + 7). En cuarto lugar, cuando el hiPSC-fibroblástica-como las células (hiPSC-F) alcanzó alrededor de 90% de confluencia, que se indujeron a diferenciarse en condrocitos a través de un cultivo de pellets 3D ( Figura 2D ] [ 10] .
Caracterización de los gránulos de hiPSC-Chon:
HiPSC-F se cultivaron en tubos de polipropileno de 15 ml en pellet durante 21 días. Las células condrogénicas pueden ensamblarse in vitro y producir una matriz extracelular característica cuando están en cultivo de alta densidad. Al final del cultivo, pudimos observar un denso agregado de tipo cartílago, el gránulo hiPSC-Chon, que tenía hasta 2-3 mm de largo y 3 mm de espesor ( Figura 2D ). Las células fueron positivas para azul alcian ( Figura 3A ) y toluidina azul ( Figura 3B ) tinción, que indicó el successfUl de diferenciación condrogénica de gránulos de hiPSC. El análisis de inmunohistoquímica para colágeno II ( Figura 3C ) y colágeno X ( Figura 3D ) demostró además que los gránulos de hiPSC-Chon habían desarrollado un fenotipo de tipo condrocito. Se realizaron controles negativos de inmunohistoquímica para colágeno II y colágeno X para probar mejor la tinción positiva (datos no mostrados) 5 .
SGAG análisis también se realizó después de la diferenciación condrogénica ( Figura 3E ]. Se detectaron contenidos de sGAG en gránulos de hiPSC-Chon, hiPSC-F, EBs y los hiPSC indiferenciados. El contenido de sGAG fue significativamente regulado positivamente en gránulos de hiPSC-Chon que en los otros grupos ( P <0,05). En el control positivo de hMSC-Chon, el contenido sGAG también fue significativamente upregulated ( P <0,05) en comparación con hMSCs. Sin embargo, el contenido de sGAGEntre los gránulos de hMSC y los gránulos de hiPSC-Chon no demostró diferencias ( P > 0,05).
Expresión génica de los marcadores de diferenciación condrogénica:
Se utilizó la expresión génica de los marcadores de diferenciación para el linaje condroprogenitor ( SOX9 y COL2 ) y condrocitos completamente diferenciados ( AGGRECAN y COL10 ) para caracterizar el fenotipo de los gránulos condrogénicos ( Figura 4 ). En las comparaciones entre hiPSCs, hiPSC-F y gránulos de hiPSC-Chon, expresiones de COL2 , COL10 , SOX9 y AGGRECAN fueron significativamente reguladas positivamente en hiPSC-Chon que en los otros grupos ( P <0.05). En el control positivo de hMSC-Chon, la expresión de estos marcadores también fue significativamente upregulated que en hMSCs ( P <0,05). Sin embargo, la expresión génica entre hMSC y los gránulos de hiPSC-Chon no mostraron diferencias ( P > 0,05). En total, estos resultados sugieren un exitoso proceso de diferenciación condrogénica de las iPSC humanas.
Figura 1: Esquema general del protocolo. Un método de cultivo de múltiples etapas utilizado para diferenciar iPSCs humanos en condrocitos, incluyendo : 1) diferenciación espontánea vía EB formación, 2) crecimiento celular de EBs, 3) cultivo de células monocapa después de la subcultura, y 4) cultivo de pellets 3D. El fenotipo de los condrocitos se evalúa mediante análisis histológico, análisis bioquímico y expresión de genes condrogénicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Generación de condrocitos a partir de hiPSCs. ( A ) formación de EB en D10. Barra de escala = 100 μm. ( B ) Excrecencia celular de EBs en D10 + 10. Barra de escala = 100 μm. ( C ) Cultivo celular monocapa en D10 + 10 + 7. Barra de escala = 100 μm. ( D ) cultivo de pellets 3D. Esta cifra se ha modificado de nuestro estudio anterior 5 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización de gránulos de hiPSC-Chon. ( A ) Tinción con azul de Alcian y ( B ) tinción con azul de toluidina de glicosaminoglicanos y proteoGlicanos. Barra de escala = 100 μm. ( C y D ) Inmunohistoquímica para colágeno II y colágeno X. Barra de escala = 100 μm. ( E ) Caracterización bioquímica de gránulos de hiPSC-Chon frente a hiPSCs, EBs y hiPSC-F en comparación con hMSC-Chon frente a hMSCs. SGAG por ADN. La barra representa la media ± SEM. N = 3, * P & lt; 0,05. Esta cifra se ha modificado de nuestro estudio anterior 5 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de expresión génica. RT-qPCR análisis de la expresión génica de los marcadores de diferenciación condrogénica ( COL2 , COL10 , SOX9 , y AGGRECAN ) en hiPSC-Chon frente hiPSCs y hiPSCF en comparación con hMSC-Chon versus hMSCs. La barra representa la media ± SEM. N = 3, * P & lt; 0,05. Esta cifra se ha modificado de nuestro estudio anterior 5 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, proporcionamos un protocolo para generar condrocitos de PBCs a través de iPSCs. Debido a que los PBC son más comunes y ampliamente utilizados en el campo clínico, se presentan como una alternativa potencial para la reprogramación. En este estudio, los vectores episomales (EV) se utilizaron para reprogramar PBCs en iPSCs, siguiendo el método establecido por Zhang et al. 11 . Este enfoque libre de integración no implica la integración de la genotoxicidad asociada a virus, que se cree que tiene un amplio efecto en el campo clínico [ 12 , 13] . La eficiencia de reprogramación de generar iPSCs sin integración de células sanguíneas en este estudio fue satisfecha. Más de 30 iPSCs podrían ser producidos a partir de 2 mL de sangre periférica. Por lo tanto, PBCs tienen el potencial de ser las células de semillas utilizadas para generar iPSCs para la ingeniería del cartílago y otras aplicaciones clínicas.
Los principales pasos de chondrogenic difierenNación de los hiPSCs incluyen: formación de EB, crecimiento celular de EBs, cultivo monocapa y cultivo de pellets 3D. Las colonias hiPSC indiferenciadas se diseccionan en piezas más pequeñas usando una aguja de vidrio extraída por el fuego. El método mecánico, aunque más técnico, es mejor que la digestión enzimática (como la dispasa o la colagenasa) debido al daño reducido y al tamaño específico (50 - 100 μm de diámetro) en la adquisición. Además, la digestión mecánica puede disponer manualmente de las células alimentadoras, lo que reprimirá la diferenciación hiPSC. HiPSCs se diferencian espontáneamente para formar EBs, que se caracterizan como los agregados tridimensionales, multicelulares con bordes lisos. Varias EBs pueden agruparse juntas para formar formas irregulares. Con el fin de mantener los EB en buenas condiciones, se cultivan menos de 100 EBs en una placa de Petri no adherente de 100 mm, con 10 ml de medio de formación de EB. Se cree que alrededor de 50 EBs en un plato de 100 mm es la mejor concentración. Los EBs se sembraron luego en A 10 cm, platos recubiertos de gelatina con medio de cultivo basal. La densidad de la distribución de EBs es importante para el crecimiento suficiente de EBs. Se cultivan menos de 100 EB en un plato de 100 mm. Dentro de los 10 días de cultivo, las células fibroblásticas son gradualmente superadas y expandidas de las EB. La etapa monocapa se realiza para excluir células indiferenciadas residuales presentes en los EB, así como para expandir células comprometidas con el linaje mesenquimal. 0,5-1 x 10 6 células se siembran en una placa de 100 mm para el cultivo celular monocapa. La expresión de los marcadores de superficie celular en HiPSC-F se analizaron mediante análisis de citometría de flujo en nuestro estudio anterior [ 5] . Los resultados mostraron que la mayoría de hiPSC-F expresaron CD73 (81,81 ± 2,05%) y CD105 (endoglina, 81,90 ± 1,61%), que se sabe que son los marcadores mesenquimales humanos positivos. Además, seis diferentes iPSCs y una célula madre embrionaria humana (ESC) se han utilizado para reproducir estos métodos.
La diferenciación condrogénica inducida de las células pluripotentes es también un proceso clave complejo En vista de esto, se utilizó el medio clondrogénico clásico para la inducción de la condrogénesis a partir de los hiPSCs. El TGF-beta1 y la dexametasona se suplementan en el medio de cultivo de pellets. se ha demostrado que tiene una influencia significativa en las capacidades potenciales condrogénicas 14. Otra diferencia de otros protocolos fue la concentración de 10% SU, que es mucho más alta que la normalmente informado 1% ITS 15, 16. 1% ITS más 10% de FBS mejorada La formación de cartílago en otros métodos 17 , 18. Los ITS como sustitutos de suero pueden promover la proliferación y formación de condrocitos y retener los fenotipos condrogénicos Para reemplazar los componentes animales de FBS, se actualizó la concentración de ITS al 10%, lo que se ha demostrado Para promocionar eficientementeDiferenciación de los condrocitos 7 .Un cultivo celular de alta densidad es otro factor esencial para la diferenciación condrogénica. Existen muchos otros métodos de cultivo celular que pueden usarse para inducir la diferenciación condrogénica, como el cultivo de micromass, el co-cultivo con otras células, el cultivo basado en biomateriales y la manipulación genética [ 1 , 19 , 15] . El cultivo de pellets 3D en nuestro estudio, que resulta en una alta densidad celular y alta interacción célula-célula, es más fácil de realizar sin otras células o materiales. Dado que se realiza en los tubos de centrífuga de 15 ml, una limitación es que sólo puede utilizarse en un ensayo de diferenciación condrogénica a pequeña escala. Sin embargo, las placas de 96 pocillos con fondos redondos podrían utilizarse como una alternativa prometedora 7 . Por lo tanto, otras mejoras en los métodos de cultivo podrían promover la eficiencia de los condrogenosDiferenciación in vitro . En nuestro estudio, la inducción condrogénica durante tanto tiempo como 21 días se realizó en condiciones sin suero y libre de xeno, durante el cual todos los componentes relacionados con los animales fueron eliminados. Por lo tanto, el procedimiento en nuestro estudio es adaptable para futuras aplicaciones clínicas.
Se cree que las células madre autólogas serían la elección ideal para la reparación del cartílago, ya que pueden no sólo disminuir el rechazo, sino también lograr la regeneración de los tejidos, aprovechando el curso natural del desarrollo embrionario [ 20 , 21] . Sin embargo, se encontró que tienen limitado potencial proliferativo in vitro [ 22] . Por lo tanto, un método libre de integración para generar condrocitos a partir de PBCs a través de iPSCs puede ser un enfoque más prometedor para la ingeniería de tejidos de cartílago. Con nuestro método, 2 ml de sangre podrían ser suficientes para inducir a los condrocitos específicos del paciente necesarios para el defecto del cartílagoTs Además, también usamos hMSCs como un control positivo para comparar con células diferenciadas de iPSCs, lo que sugiere que iPSCs tienen un buen potencial de diferenciación condrogénica.
En conclusión, este estudio demostró que los PBC pueden ser utilizados como candidatos para la regeneración de condrocitos. Esto podría reflejar aún más una dirección futura para generar células de semilla para la reparación del cartílago en un paciente específico y rentable enfoque de la medicina regenerativa.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Xiaobin Zhang por su plásmido. También damos las gracias a Shaorong Gao y Qianfei Wang por su amable ayuda durante el experimento. Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81101346, 81271963, 81100331), el proyecto de talento de alto nivel de Beijing 215 (No.2014-3-025) y el Fondo del Hospital Chao-Yang de Beijing (No CYXX-2017-01), y la Asociación de Promoción de la Innovación Juvenil de la Academia China de Ciencias (YL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | TMS-002-C | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| 2-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
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