Summary
Met behulp van een lipofiele l, 3'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI) kleuringstechniek, kan Ambystoma mexicanum vasculaire perfusie ondergaan om de vasculatuur gemakkelijk te visualiseren.
Abstract
Perfusionstechnieken zijn eeuwenlang gebruikt om de circulatie van weefsels te visualiseren. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is een soort salamander die is uitgekomen als een essentieel model voor regeneratie studies. Er is weinig bekend over hoe revascularisatie zich voordoet in de context van regeneratie bij deze dieren. Hier rapporteren wij een eenvoudige methode voor visualisatie van de vasculatuur in axolotl via perfusie van 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI). DiI is een lipofiele carbocyanine kleurstof die onmiddellijk in het plasmamembraan van endotheliale cellen inslaat. Perfusie wordt gedaan met behulp van een peristaltische pomp, zodat DiI de circulatie door de aorta binnentreedt. Tijdens perfusie vloeit de kleur door de bloedvaten van de axolotl en voegt zich in contact met de lipide bilayer van vasculaire endotheelcellen. De perfusieprocedure duurt ongeveer een uur voor een acht-inch axolotl. Onmiddellijk na perfusie wiTh DiI, kan de axolotl met een confocale fluorescerende microscoop worden weergegeven. De DiI licht licht in het rood-oranje bereik uit wanneer het opgewekt wordt met een groen fluorescerend filter. Deze DiI perfusie procedure kan gebruikt worden om de vasculaire structuur van axolotl te visualiseren of patronen van revascularisatie in regenererende weefsels te demonstreren.
Introduction
Visualisatie van vasculatuur speelt een belangrijke rol bij het begrijpen van de structuur en functie van organismen in vele soorten. Vanaf de 16e eeuw met Leonardo da Vinci zijn modellen en grafische voorstellingen van de circulatie 1 bestudeerd. Met behulp van wassen en rubberen matrijzen werden weefsels geperfuseerd om driedimensionale modellen van de vaatwortel te creëren, die de studie van organogenese en pathogenese 1 , 2 toonden. Harsen en wassen werden gekleurd met kleurstoffen zoals India Ink of Carmine Red om hun eenvoudige visualisatie 1 , 2 mogelijk te maken . Deze technieken veroorzaken echter veel problemen omdat hun hoge viscositeiten volledige perfusie van het weefsel van belang 1 verhinderden. Toen het veld verfijnder werd, kwam het gebruik van confocale en elektronenmicroscopen in het spel, waardoor de perfusie techniek Ues weg van gietvormen en naar vloeibare perfusies van de vaatwasser, waarvan sommige toegestaan zijn voor de perfusie en beeldvorming van bloedvaten zonder het aanvankelijke weefsel 3 te vernietigen. DiI, een fluorescerende carbocyanine kleurstof, is een dergelijke vlek die de perfusie van dieren mogelijk maakt zonder schade aan het vaatweefsel.
Carbocyanine kleurstoffen zijn lipofiele kleurstoffen die in contact komen met celmembranen. Deze kleurstoffen zorgen voor makkelijke en onmiddellijke kleuring van vasculaire endotheelcellen, die vervolgens onder een fluorescerende confocale microscoop kunnen worden bekeken. DiI beweegt via laterale diffusie in het lipidemembraan van cellen, zoals blijkt uit de etikettering en opsporing van neuronen 4 . Chemisch geven de twee alkylketens van DiI de hoge affiniteit voor celmembranen, terwijl twee geconjugeerde ringen van een fluorochroom die verantwoordelijk zijn voor het uitzenden van een rode golflengte wanneer het opgewekt wordt door groene fluorescerende lichtfilters> 4. DiI is in veel capaciteiten gebruikt, met inbegrip van succesvolle etikettering van het plasmamembraan en zowel anterograde als retrograde etikettering in neuronen 5 , 6 . DiI is eerder gebruikt in perfusieprotocollen terwijl het visualiseren van de vasculatuur van muizen 7 .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) zijn salamanders die uitsluitend in brakke meren in de buurt van Mexico City, Mexico leven. Deze dieren zijn een belangrijk model geworden voor het begrijpen van regeneratieve processen, aangezien zij volledige ledematen, staart (inclusief zenuwsnoer), delen van het hart en andere inwendige organen, en delen van het oog als volwassenen 8 , 9 kunnen regenereren. Bovendien, met de recente toepassing van genetische hulpmiddelen in axolotls, is nu ongekend inzicht in de moleculen en cellen die deze processen runnen 8 mogelijk. De succesvolle regeneRantsoen van een hele ledemaat vereist een uitgebreid revascularisatieproces, dat een belangrijke rol kan spelen in regeneratie, buiten de traditionele functies van bloedvaten bij het leveren van zuurstof en voedingsstoffen. Het begrijpen van revascularisatie in de context van weefselregeneratie is imperatief. Axolotl bloedvaten zijn eerder met India Ink in beeld gebracht, en hoewel de resultaten intrigerend zijn, is dit proces niet in de daaropvolgende decennia 10 herzien. Wij trachten een DiI perfusie protocol aan te passen dat is ontwikkeld voor gebruik in zoogdieren om een volledige perfusie en visualisatie van de axolotl vasculatuur 7 mogelijk te maken . Dit protocol beschrijft de stappen die zijn genomen om succesvol te perfectioneren en vervolgens de axolotl circulatie te visualiseren met een DiI-kleuringstechniek. Deze procedure zorgt voor een nauwkeurige visualisatie van octrooibloedschepen in homeostatische weefsels, evenals in regenererende weefsels, en biedt een nieuwe methode voor visualizatioN en analyse van het revascularisatieproces in de axolotl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle axolotl-experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het Institutional Animal Care and Use Committee van Brigham en Women's Hospital (BWH).
1. Stel Perfusion Experiment op
- Plaats een volwassene axolotl in een plastic container, gevuld met 0,1% tricaine oplossing (MS222) gedurende 15-20 minuten of tot het volledig verdoofd is. Zorg ervoor dat de container voldoende tricineoplossing is, zodat de axolotl volledig ondergedompeld is.
Opmerking: Alle procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierlijke zorg. Bij BWH wordt een axolotl als volledig verdoofd beschouwd als het een voetnijp test mislukt, wat betekent dat er geen reflexieve beweging is wanneer de voet zachtjes wordt geperst.
Let op: hoewel tricine een verdoving is die specifiek wordt gebruikt voor aquatische organismen, moet direct contact met de tricineoplossing voorkomen worden. - Stel het axolotl perfusie station op.
- Plaats deAbsorberend pad op een vlakke, vlakke oppervlakte met de absorberende kant naar boven gericht.
- Knip een gat in het polystyreen schuim frame dat de juiste grootte en vorm voor de verdoofde axolotl ligt in de rugliggende positie. Plaats het frame op het absorberende pad.
Opmerking: Sommige extra papieren handdoeken kunnen direct onder het frame geplaatst worden voor extra absorptie. - Laad de peristaltische pomp met de perfusiebuis. Zet de pomp aan op een stromingssnelheid van 0,7 ml / min, met de klok mee naar beneden.
- Maak de verdunningsoplossing met 0,7x PBS en 5% glucose in een 1: 4 mengsel.
- Meng 10 ml verdunningsoplossing met 200 μl van de DiI-voorraadoplossing in een 50 ml conische buis. Cap en meng door inversie. Bedek deze buis met aluminiumfolie om de werkoplossing tegen blootstelling aan licht te beschermen.
Opmerking: Volumes moeten proportioneel veranderd worden volgens de grootte van de axolotl. Deze waarden zijn voor een axolotl van ongeveer 15 cm (snout-naar-tail lengte). EENNimalen van deze grootte hebben mogelijk geen volledige seksuele volwassenheid bereikt, zodat dierlijk geslacht op dit moment niet kan worden bepaald. - Vul een 50 ml conische buis met 0,7x PBS.
Opmerking: PBS wordt gebruikt om de lus- en axolotl-exsanguinatie te primeren. - Bevestig de 27-gauge vlinder naald aan het einde van de perfusie buis. Vouw de vlindervleugels op elkaar en plaats de klemstand.
- Plaats het vrije uiteinde van de perfusiebuis in de 50 ml conische buis gevuld met 0,7x PBS en voer de perfusiepomp door totdat de volledige buis met oplossing is gevuld. Pauzeer de pomp zodra de hele buis gevuld is met PBS.
Opmerking: Zorg ervoor dat het buis te allen tijde vrij is van luchtbellen, omdat dit luchtembolie in de axolotl veroorzaakt en volledige perfusie voorkomt. - Plaats een papieren handdoek in de axolotl-vormige vorm in het polystyreen schuim frame. Gebruik een transferpipette, doek de handdoek met de tricineoplossing.
Opmerking: Knip een klein vierkant in het midden van het papierEl om de afvoer van vloeistoffen tijdens de perfusieprocedure mogelijk te maken. - Plaats de verdunde axolotl op de papierdoek in het polystyreen schuim frame.
2. Het openen van de Axolotl-borst
- Gebruik chirurgische tang om de huid langs de centrale as van de borst van de axolot te knijpen, net onder de schouderslijn. Optrekken.
- Gebruik een scalpel om een kleine snede te maken waar de huid is getrokken.
- Verwijder een vierkante patch van de huid over de borst om twee kraakbeenplaten te onthullen.
- Verwijder de huid om een raam over de thoracale holte te openen die groot genoeg is om het hart duidelijk te zien en ongeveer 5 mm van de aorta af te trekken van het hart.
- Zet het bindweefsel zorgvuldig door met behulp van pincet of de gesloten schaar, om te voorkomen dat alle belangrijke bloedvaten worden gesneden.
- Breng elke kraakplaat afzonderlijk met behulp van de tang en accijnst ze wMet de chirurgische schaar.
- Knip het pericardium met de tang vast, trek het op en steek het met behulp van de chirurgische schaar; Deze incisie moet net zo diep genoeg zijn om het zeer dunne pericardium te puncturen en moet groot genoeg zijn om het pericardium te verwijderen. Pas op om het hart niet te snijden.
- Verwijder het pericardium delicaat om het hart en de aorta bloot te leggen.
Opmerking: Gebruik een transferpipet om de borstholte en de kiemen periodiek met de tricineoplossing te spoelen om het gebied helder te houden en de axolotl verdoofd te houden.
3. Perfusie van de Axolotl
- Plaats de klemstang met de geladen vlindernaald naast het polystyreen schuimframe, zodat de arm van de klem gemakkelijk kan worden gemanipuleerd om de naald in de axolotl aorta te plaatsen. Steek de punt van de naald in de richting van het rostrale aspect van het dier tijdens het inbrengen en houd de naald evenwijdig aan de aorta om te voorkomen dat het door de opPositieve kant.
- Zet de peristaltische pomp aan. 0,7x PBS moet door de buis doorgaan.
- Steek de naald in de aorta.
- Schuif de tang onder de aortische boog en trek licht omhoog om gemakkelijk toegang te krijgen.
- Manoeuvreer de naaldklem combinatie zodanig dat de naald langs de lengte van de aorta loopt, naar boven gericht. Plaats de naald terwijl u de tang gebruikt voor ondersteuning achter de aorta.
Opmerking: De naald moet diep genoeg in de aorta worden ingebracht om ervoor te zorgen dat het niet tijdens perfusie zal glijden. Dit kan ongeveer 5 mm zijn voor een 15 cm axolotl. Zorg ervoor dat de naald perfect in lijn is met de aorta om volledige vulling van het vaartuig te vermijden. Door-en-door-puncturen kunnen massale bloeding veroorzaken en de succesvolumes van perfusie verminderen. Succesvolle invoeging kan worden bevestigd door zichtbare vergroting van de atria van het hart.
- Snijd een atrium snel met de sciSsors en laat bloed afvoeren.
- Spoel met tricineoplossing om bloedophoping en stollingsvorming in de borstholte te voorkomen.
- Perfuseer de axolotl met ongeveer 20-30 ml PBS. Het dier moet van lichtroze naar kleur veranderen in een succesvolle perfusie.
- Pauze de peristaltische pomp en beweeg het vrije uiteinde van de buis in de 15 ml buis DiI-oplossing. Start de pomp opnieuw op, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de buis ontstaan.
- Perfuse de axolotl met de volledige werkvoorraad van DiI.
Opmerking: in een succesvolle perfusie, de axolotl met veranderende kleur naar de heldere roze van de DiI. Dit zal het meest opvallend zijn in de kieuwen. - Pauze de pomp na de perfusie met DiI is compleet en plaats het vrije uiteinde van de buis in 4% Paraformaldehyde (PFA) oplossing om het weefsel vast te maken. Start de pomp opnieuw en vul tenminste 10 ml PFA aan.
Let op: PFA is giftig en moet worden behandeld en afgezondenGepast van Handschoenen en veiligheidsbril dienen te worden gedragen, en oplossingen moeten in een dampkoker worden aangebracht. Perfusie van de axolotl met PFA om het weefsel te repareren resulteert in de dood van het dier.
4. Beëindiging van de perfusie- en visualisatievoorbereiding
- Stop de peristaltische pomp en verwijder de naald uit de axolotl aorta.
- Plaats de axolotl op een plastic plaat.
Opmerking: Het gebruik van de helft van een grote Petri-schotel werkt goed en maakt het mogelijk om een kleine hoeveelheid Tricaine of PBS op de axolotl te gieten om zijn huid nat te houden en de visualisatie kwaliteit te verbeteren. - Verwijder alle gebruikte materialen in de betreffende afvalbakken. Schoon chirurgische gereedschappen met 70% ethanol, desinfecteren met behulp van een glaspiraal sterilisator tussen dieren en steriliseren door autoclaving volgens de procedure. Spoel de buizen met de PBS-oplossing en laat ze vervolgens afvoeren, drogen en opslaan voor verdere gebruik.
5. Visualisatie van de Perfused Axolotl
Opmerking: Om een beeld van hoge kwaliteit te verkrijgen, kunnen de volgende parameters worden gebruikt: blootstelling voor 1,1 s, winst van 1x, verzadiging van 1,0, vergroting van 2X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met DiI-kleuring kan de vasculatuur van de axolotl gemakkelijk worden visualiseerd. Bloedvaten van dieren geperfuseerd met de lipofiele kleurstof zijn direct zichtbaar onder een fluorescerende confocale microscoop. Figuur 1 .1-1.5 is een schematische weergave van het perfusieprotocol. Na perfusie met de helderroze kleurstof zal een succesvol geperforeerde axolotl roze verschijnen. Met behulp van een groen fluorescerend filter op een confocale microscoop verschijnt er een rode uitstraling van het vaatnetwerk. De DiI-kleuring vindt plaats in alle lichaamsweefsels wanneer perfusie succesvol is, met inbegrip van de staart, ledematen, kieuwen en ogen ( Figuur 2A , Figuur 2B , Figuur 2C , Figuur 2D , repectief). Mislukte perfusies resulteren in een gebrek aan roodgekleurde vasculatuur of in patchy vlekken van de vaten.
Ntent "voor: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 1: Schematisch van het perfusieprotocol. Axolotl's die succesvol geperfuseerd zijn met de lipofiele kleurstof, DiI, tonen volledige vlekvorming van de vasculatuur bij beeldvorming. 1: Full-back axolotl voor perfusie experiment. 2: De borst van de axolotl openen. 2: Axolotl met een open borstholte. 3: Inbrengen van de 27 G vlinder naald in de aorta van de axolotl. 4: Tubing moet eerst 0.7x PBS bevatten, daarna de DiI-werkoplossing en ten slotte 4% PFA. 5: Volledig geperfereerde axolotjes lijken roze. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beelden van een volledig perfuse Axolotl. Beelden van de axolotl vasculatuur werden genomen met behulp van een fluorescerende confocale microscoop na succesvolle perfusie met de DiI vlek. 2A: Staart. 2B: voet. 2C: Gillen. 2D: Oog. Imaging wordt gedaan met behulp van een confocale microscoop met een groene fluorescentemissie filterkubus. Vergroting voor afbeeldingen A, B, C en D, respectievelijk respectievelijk 1.74X, 2.16X, 1.18X en 5.69X. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Visualisatie van de vasculatuur van de axolotl kan succesvol worden bereikt via perfusie met de lipofiele carbocyanine kleurstof, DiI. In deze studie beschrijven we een nieuw protocol voor de perfusie van de axolotl met DiI met behulp van een peristaltische pomp. We tonen ook de latere visualisatie van de axolotl vasculatuur met behulp van een fluorescerende confocale microscoop. Dit protocol was een aanpassing van het knaagdier DiI perfusieprotocol gezien in Li et al. 7 , maar grote verschillen tussen het knaagdier en de axolotl vereisen een herziening van het protocol om het axolotl model te passen.
Deze studie bespreekt een methode van DiI perfusie van de axolotl om de vaatwand succesvol te visualiseren. Verschillen in de anatomie en fysiologie tussen de salamander en knaagdier eisen veranderingen in belangrijke aspecten van de perfusie, met inbegrip van de plaats van naaldinvoeging, perfusiemethode en de gebruikte reagentia. Om achEen succesvolle perfusie, we beperken de schade aan de vaatstelsel van de axolotl. Tijdens het openen van de borstholte werd er zorg besteed om het hart en de aorta volledig bloot te leggen en eventuele schade of laceraties op de belangrijkste bloedvaten te vermijden. Het beperken van het gebruik van de chirurgische schaar zorgde voor onbedoelde knippen van grote vaten, terwijl kleine insnijdingen de controle over de blootstelling van het hart en de aorta behouden. Succespercentages van perfusies namen toe toen de DiI-naald door de aorta werd geplaatst, in plaats van direct in de kamers van het hart. De axolotl heeft, in tegenstelling tot de muis, een hartkwartier met drie harten, die slechts één ventrikel bevat met veel minder spieren dan die van de muis. Vanwege deze verschillen moest de plaats van naaldinvoeging naar de stabielere aorta worden verplaatst. De aorta was vastbesloten om de optimale plaats te zijn voor het inbrengen van de perfusie-naald, aangezien het groot genoeg is om door een 27 G-naald te worden gebogen en met beperkte beweging. Beweging was minimaalOm ervoor te zorgen dat de perfusie-naald of door-en-door-punctie van de aorta per ongeluk wordt verwijderd of verwijderd. Hart perfusies met behulp van de ventrikel als een invoegpunt bleek een veel lager succes te hebben dan die met een aorta insertiepunt. Onjuiste punctie van de vaatwand resulteerde vaak in de vorming van embolie of voorkomende perfusie, wat resulteerde in zeer lage percentages van succesvolle vasculaire etikettering. Door gebruik te maken van een klemstand om de vlindernaald tijdens perfusie te houden, hebben we de beweging verminderd, waardoor de snelheid van succesvolle perfusies wordt verhoogd. Bovendien, als gevolg van de delicatesse van het axolotl weefsel, was in vergelijking met de muis een peristaltische perfusiepomp nodig, in tegenstelling tot de handmatige perfusie die eerder werd gebruikt. Het gebruik van deze pomp zorgde voor een hands-free aanpak van de axolotl perfusie om de foutieve doorlopen van de dunne weefsels te minimaliseren. Perfusies waren mislukt om vele andere redenen, inclusief door-en-door punctUre, stolling en embolie. In het geval dat de naald in de aorta werd geplaatst en een tweede puntje werd gecreëerd via de achterste wand, zou de DiI-oplossing direct in de borstholte stromen, in plaats van door de systemische circulatie door te gaan. Daarnaast vormde het bloed snel een bloedklont, die de perfusie zou kunnen belemmeren, zodra het bloed uit de vaat was. Klontjes en luchtbellen kunnen ook in de vaatvorming vormen, waardoor emboli voorkomt die succesvolle perfusie voorkomt. Tenslotte worden deze reagentia opgenomen reagentia aangepast aan de axolotl osmolaliteit, die aanzienlijk verschilt van die van het zoogdier. Aanpassing van dit protocol en de significante veranderingen die zijn gemaakt om het axolotl model te passen, zullen helpen bij het begrijpen van het proces van revascularisatie van weefsels tijdens regeneratie.
DiI, die roze van kleur is, zal het dier perfectioneren en een helderroze tint geven. Succesvol geperfectioneerde axoloten werden helderroze aan het blote oog, met sterkVascularized regio's verschijnen meer intens gekleurd. Perfuse dieren die worden bekeken met een fluorescerende confocale microscoop met een groen filter kunnen in het rood-oranje emissiespectrum worden weergegeven. Vasculatuur werd het best gevisualiseerd in dunner weefsels, waardoor onbedoelde DiI-kleuring van niet-vasculaire weefsels werd geminimaliseerd. Perfusie van het weefsel met 4% paraformaldehyde (PFA) onmiddellijk na dii perfusie moet worden gedaan om het weefsel te repareren.
DiI-perfusies zijn end-point experimenten voor de axolotl. Tijdens de procedure wordt het bloed van het dier daadwerkelijk gedreineerd en vervangen door 0,7x PBS, onmiddellijk gevolgd door DiI-oplossing en uiteindelijk 4% PFA. Dit verstoort het vermogen van de axolot om in de vitale handeling van gaswisseling te gaan en het verliest het vermogen om zijn lichaamsweefsels te oxygeneren. Vanwege deze eindpunt-natuur, vergt elke perfusie slechts een enkel tijdpunt van vasculaire groei en kan het dier niet later worden geperfereerd. Vanwege deze tijd limiTing factor, moeten meerdere dieren gebruikt worden om een tijdsbestek van vasculaire ontwikkeling te beschrijven.
Dit DiI-protocol, en de wijzigingen die zijn toegepast om het te verbeteren, kunnen gebruikt worden om de vaatwand van de axolotl succesvol te labelen en te visualiseren. Aangezien de axolotl een essentieel modelorganisme is voor de studie van regeneratie, bieden succesvolle perfusies mogelijkheden om het proces van angiogenese tijdens regeneratie te ondervragen. De axolotl is een model organisme voor de studie van regeneratie omdat het een neutraal dier is en daarom een opvallend vermogen behoudt om gedurende de volwassenheid 8 te regenereren. Het revascularisatieproces van regenererende weefsels is echter niet goed begrepen, daarom biedt de aanpassing van de DiI perfusie aan het axolotl systeem kansen om regeneratie te begrijpen die niet bij het zoogdiermodel beschikbaar waren. De perfusie van de axolotl met behulp van DiI is een nieuwe techniek voor het bestuderen van revasCularisatie van regenererend weefsel in dit diermodel, daarom kan dit protocol verder worden gebruikt om organogenese tijdens ontwikkeling en angiogenese tijdens ziekte te begrijpen en worden gebruikt als een belangrijk instrument tijdens de studie van regeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door het Brigham & Women's Hospital en de March of Dimes. De auteurs willen alle leden van het Whited Lab bedanken voor hun steun en advies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
