Summary
Med användning av en lipofil 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat (DiI) -färgningsteknik kan Ambystoma-mexicanum genomgå vaskulär perfusion för att möjliggöra enkel visualisering av vaskulaturen.
Abstract
Perfusionstekniker har använts i århundraden för att visualisera cirkulationen av vävnader. Axolotl (Ambystoma mexicanum) är en art av salamander som har uppstått som en viktig modell för regenereringsstudier. Lite är känt om hur revaskularisering sker i samband med regenerering hos dessa djur. Här redovisar vi en enkel metod för visualisering av kärl i axolotl via perfusion av 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat (DiI). DiI är ett lipofilt karbocyaninfärg som omedelbart sätter in i plasmamembranet av endotelceller. Perfusion görs med hjälp av en peristaltisk pump så att DiI går in i cirkulationen genom aortan. Under perfusion strömmar färgämne genom axolotls blodkärl och inkorporeras i lipid-dubbelskiktet i vaskulära endotelceller vid kontakt. Perfusionsproceduren tar ungefär en timme för en åtta tum axolotl. Omedelbart efter perfusion wiTh DiI kan axolotl visualiseras med ett konfokal fluorescerande mikroskop. DiI sänder ljus i röd-orange sortimentet när det är upphetsat med ett grönt fluorescerande filter. Detta DiI-perfusionsförfarande kan användas för att visualisera den axulära kärlstrukturen eller för att visa mönster för revaskularisering i regenererande vävnader.
Introduction
Visualisering av kärl spelar en viktig roll för att förstå organismernas struktur och funktion i många arter. Från och med 1600- talet med Leonardo da Vinci har modeller och grafiska representationer av cirkulationen studerats 1 . Med hjälp av vaxer och gummiproppar perfusionerades vävnader för att skapa tredimensionella kärlmodeller, vilket möjliggjorde studier av organogenes och patogenes 1 , 2 . Hartser och vaxer färgades med färgämnen som Indien Ink eller carmine Red för att möjliggöra deras enkla visualisering 1 , 2 . Dessa tekniker orsakade emellertid många problem eftersom deras höga viskositeter förhindrade fullständig perfusion av vävnaden av intresse 1 . När fältet blev mer sofistikerat kom användningen av konfokala och elektronmikroskop till spel och flyttade perfusionsteknik Ues bort från gjutformar och mot vätskeformiga perfusioner av vasculaturen, av vilka några tillåts för perfusion och avbildning av blodkärl utan att förstöra den ursprungliga vävnaden 3 . DiI, ett fluorescerande karbocyaninfärgämne, är en sådan fläck som tillåter perfusion av djur utan skada på vaskulär vävnad.
Carbocyaninfärger är lipofila färgämnen som införlivar i cellmembran vid kontakt. Dessa färgämnen möjliggör enkel och ögonblicklig färgning av vaskulära endotelceller, som sedan kan ses under ett fluorescerande konfokalmikroskop. DiI rör sig via sidodiffusion i lipidmembranet av celler, såsom visas i märkningen och spårningen av neuroner 4 . Kemiskt ger de två alkylkedjorna av DiI färgämnet sin höga affinitet för cellmembran, medan två konjugerade ringar från en fluorokrom som är ansvarig för att avge en röd våglängd när den exciteras av grön fluorescerande ljusfilter> 4. DiI har använts i många kapaciteter, inklusive framgångsrik märkning av plasmamembranet och både anterograd och retrograd märkning i neuroner 5 , 6 . DiI har tidigare använts i perfusionsprotokoll medan man visualiserar vasculaturen hos möss 7 .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) är salamandrar som lever exklusivt i bracka sjöar nära Mexico City, Mexiko. Dessa djur har blivit en viktig modell för att förstå regenerativa processer eftersom de kan regenerera hela lemmar, svans (inklusive näsnor), delar av hjärtat och andra inre organ och delar av ögat som vuxna 8 , 9 . Dessutom, med den senaste tillämpningen av genetiska verktyg i axolotl, är nu okomplicerad inblick i molekylerna och cellerna som driver dessa processer nu möjlig 8 . Den lyckade regenenRation av en hel extremitet kräver en omfattande revaskulariseringsprocess som kan spela en viktig roll vid regenerering utöver helt enkelt de blodkärlens traditionella funktioner för att tillhandahålla syre och näringsämnen. Förstå revaskularisering i samband med vävnadsregenerering är absolut nödvändigt. Axolotl blodkärl har tidigare visualiserats med hjälp av Indien Ink, och medan resultaten var spännande har denna process inte blivit omarbetad under de följande decennierna 10 . Vi försökte anpassa ett DiI-perfusionsprotokoll utvecklat för användning i däggdjur för att möjliggöra en fullständig perfusion och visualisering av axolotlvaskulaturen 7 . Detta protokoll beskriver de steg som tagits för att framgångsrikt perfekta och därefter visualisera axolotlcirkulationen med en DiI-färgningsteknik. Denna procedur kommer att möjliggöra exakt visualisering av patentblodkärl i homeostatiska vävnader, liksom i regenererande vävnader, och tillhandahåller en ny metod för visualizatioN och analys av revaskulariseringsprocessen i axolotl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt axolotl-experiment utfördes i enlighet med Brigham och Women's Hospital's (BWH) Institutionella Animal Care and Use Committee.
1. Sätt upp Perfusion Experiment
- Placera en vuxen axolotl i en plastbehållare fylld med 0,1% tricinlösning (MS222) i 15-20 minuter eller tills den är fullständigt bedövad. Se till att behållaren är fylld med tillräckligt med tricinlösning så att axolotl är helt nedsänkt.
Observera: Alla procedurer måste utföras enligt institutionella djurskyddsriktlinjer. Vid BWH anses en axolotl vara helt bedövad när den misslyckas med ett fotknippprov, vilket innebär att det inte finns någon reflexiv rörelse när foten försiktigt pressas.
Varning: Trots att tricin är en anestetik som används speciellt för vattenlevande organismer, bör direkt hudkontakt med tricinlösningen undvikas. - Ställ in axolotl-perfusionsstationen.
- PlaceraAbsorberande dynan på en plan, jämn yta med den absorberande sidan uppåt.
- Skär ett hål i polystyrenskumramen som är lämplig storlek och form för den bedövade axolotl att ligga i viloläget. Placera ramen på absorberingsplattan.
Obs! Några extra pappershanddukar kan placeras omedelbart under ramen för extra absorption. - Ladda peristaltikpumpen med perfusionsröret. Ställ pumpen till en flödeshastighet på 0,7 ml / min, som rinner iurs medurs.
- Gör utspädningslösningen med 0,7x PBS och 5% glukos i en 1: 4-blandning.
- Blanda 10 ml spädningsvätska med 200 μl av DiI-stamlösningen i ett 50 ml koniskt rör. Cap och blanda genom inversion. Täck detta rör med aluminiumfoliepapper för att skydda arbetslösningen från exponering för ljus.
Anm .: Volymen ska ändras i proportion till axolotlens storlek proportionellt. Dessa värden är för en axolotl på ca 15 cm (snout till svans längd). enNimaler av denna storlek kanske inte har uppnått full sexuell mognad, så djurkön kan inte bestämas vid denna tidpunkt. - Fyll ett 50 ml koniskt rör med 0,7x PBS.
Obs! PBS kommer att användas för priming av loop och axolotl exsanguination. - Fäst 27-gaugefjärilsnålen till utgångsänden på perfusionsröret. Vik fjärilsvingarna på varandra och placera dem i klämstället.
- Placera perfusionsrörets fria ände i det 50 ml koniska röret fyllt med 0,7x PBS och kör perfusionspumpen tills hela röret är fyllt med lösning. Pausa pumpen när hela röret är fyllt med PBS.
Obs! Var noga med att slangen är fri från luftbubblor, eftersom dessa kommer att orsaka luftemboli i axolotl och förhindra full perfusion. - Lägg en pappershandduk i den axolotformade formen i polystyrenskumramen. Använd en överföringspipett, dra i handduken med tricinlösning.
Obs! Skär ett litet torg mitt i pappersslädenEl för att tillåta dränering av fluider under perfusionsförfarandet. - Placera anestesierad axolotl liggande på pappershandduken inuti polystyrenskumramen.
2. Öppna Axolotl-bröstet
- Använd kirurgiska tångar för att nypa huden längs axelns axelns axelaxel, precis under axelns axel. Dra upp.
- Använd en skalpell för att göra ett litet snitt där huden har dragits.
- Ta bort en fyrkantig hudplast över bröstkorgen för att avslöja två broskplattor.
- Ta bort huden för att öppna ett fönster över brösthålan tillräckligt stor för att tydligt se hjärtat och ca 5 mm av aortan som förgrenar sig från hjärtat.
- Torka noggrant bindväven med hjälp av tång eller den stängda saxen för att undvika att skära några större blodkärl.
- Lyft varje broskplatta individuellt med hjälp av tang och plocka ut dem wMed den kirurgiska saxen.
- Kläm försiktigt perikardiet med tången, dra upp och punktera det med hjälp av den kirurgiska saxen; Detta snitt borde vara tillräckligt djupt för att punktera det mycket tunna perikardiet och bör vara stort nog för att möjliggöra avlägsnande av perikardiet. Var försiktig så att du inte skär ner hjärtat.
- Ta försiktigt bort perikardiet för att exponera hjärtat och aortan.
Obs! Använd en överföringspipett, skölj regelbundet bröstkaviteten och gallen med tricinlösning för att hålla området klart och behåll axolotan bedövad.
3. Perfusion av Axolotl
- Placera klämstället med den laddade fjärilnålen bredvid polystyrenskumramen, så att klämarmens arm lätt kan manipuleras för att sätta in nålen i axolotl-aortan. Peka nålens spets mot den rostrala delen av djuret under införandet och håll nålen parallell mot aortan för att undvika att punktera den genom öppningenPosite sida.
- Slå på peristaltikpumpen. 0,7x PBS bör fortsätta att flöda genom slangar.
- Sätt in nålen i aortan.
- Skjut tången under aortabågen och dra upp något för att möjliggöra enkel åtkomst.
- Manövrera nålklemskombinationen så att nålen löper längs längden på aortan och pekar upp mot huvudet. Sätt in nålen när du använder tången för stöd bakom aortan.
Obs! Nålen ska sättas djupt in i aortan för att säkerställa att den inte släpper ut under perfusion. Detta kan vara ca 5 mm för en 15 cm axolotl. Se till att nålen är helt i linje med aortan för att undvika fullständig punktering av kärlet. Genomgående punkteringar kan orsaka massiv blödning och minska framgångsgraden för perfusion. Framgångsrik införing kan bekräftas genom synlig förstoring av hjärtatriären.
- Snabbt lacerera ett atrium med sciSsorer och tillåta blod att tömma.
- Spola med tricinlösning för att förhindra bloduppbyggnad och koagulationsbildning i bröstkaviteten.
- Perfuse axolotl med ca 20-30 ml PBS. Djuren ska byta från ljusrosa till färg i en lyckad perfusion.
- Stanna in peristaltikpumpen och rör rörets fria ände i 15 ml rör av DiI-lösningen. Starta om pumpen, var försiktig för att undvika att skapa luftbubblor i röret.
- Perfuse axolotl med hela DiIs arbetslager.
Obs! I en lyckad perfusion, axolotl med förändring färg till den ljusa rosa av DiI. Detta kommer att vara mest märkbart i gärningarna. - Pause pumpen efter perfusion med DiI är klar och placera ledarens fria ände i 4% Paraformaldehyd (PFA) lösning för att fixera vävnaden. Starta om pumpen och perfusera minst 10 ml PFA.
Varning: PFA är giftigt och bör hanteras och disponerasSed av lämpligt. Handskar och skyddsglasögon ska bäras, och lösningar ska göras i en avluftningsdosa. Perfusion av axolotl med PFA för att fixera vävnaden resulterar i djurets död.
4. Avsluta perfusion och visualisering
- Stoppa peristaltikpumpen och ta bort nålen från axolotl aorta.
- Placera axolotl på en plastplåt.
Obs! Användning av hälften av en stor petriskål fungerar bra och möjliggör att man häller en liten mängd Tricaine eller PBS på axolotl för att hålla huden ren och förbättra visualiseringskvaliteten. - Kassera allt använt material i lämpliga avfallsbehållare. Rengör kirurgiska verktyg med 70% etanol, desinficera med hjälp av en glaspärlsterilisator mellan djur och sterilisera genom autoklavering enligt proceduren. Spola rör med PBS-lösningen och dränera, torka helt och lagra för vidare användning.
5. Visualisering av Perfused Axolotl
Obs! För att få en bild av hög kvalitet kan följande parametrar användas: exponering för 1,1 s, förstärkning av 1x, mättnad av 1,0, förstoring av 2X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med DiI-färgning kan axolotlens kärl lätt visualiseras. Blodkärl hos djur perfuserade med det lipofila färgämnet är omedelbart synliga under ett fluorescerande konfokalmikroskop. Figur 1 .1-1.5 är en schematisk representation av perfusionsprotokollet. Efter perfusion med det ljusa rosa färgämnet kommer en framgångsrikt perfuserad axolotl att bli rosa. Genom att använda ett grönt fluorescerande filter på ett konfokalt mikroskop visas en röd emission av det vaskulära nätverket. DiI-färgningen förekommer i alla kroppsvävnader när perfusion är framgångsrik, inklusive svans, lemmar, gula och ögon ( Figur 2A , Figur 2B , Figur 2C , Figur 2D , repektivt). Misslyckade perfusioner resulterar i brist på rödfärgad kärl eller vid fläckig färgning av kärlen.
Ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1: Schematisk av perfusionsprotokollet. Axolotls perfusionerades med lipofilt färgämne, DiI, demonstrerar full färgning av vaskulaturen vid bildbehandling. 1: Fullt bakre axolotl före perfusionsexperiment. 2: öppnar axolotlens bröstkorg 2: Axolotl med öppen bröstkavitet. 3: Inläggning av 27 G-fjärilsnålen i axelns aorta. 4: Tubing bör först innehålla 0,7x PBS, därefter DiI-arbetslösningen och till sist 4% PFA. 5: Fullt perfuserade axolotlar verkar rosa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bilder av en helt perfuserad Axolotl. Bilder av axolotlvaskulaturen togs med användning av ett fluorescerande konfokalt mikroskop efter framgångsrik perfusion med DiI-fläcken. 2A: Svans. 2B: fot. 2C: Gills. 2D: öga. Bildbehandling görs med hjälp av ett konfokalmikroskop med en grön fluorescerande filterfilterkub. Förstoring för bilderna A, B, C och D är henholdsvis 1,74x, 2,16x, 1,18x och 5,69x. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Visualisering av vaskulaturen hos axolotl kan framgångsrikt åstadkommas genom perfusion med det lipofila karbocyaninfärgämnet, DiI. I denna studie beskriver vi ett nytt protokoll för perfusion av axolotl med DiI med en peristaltisk pump. Vi visar också den efterföljande visualiseringen av axolotlvaskulaturen med hjälp av ett fluorescerande konfokalmikroskop. Detta protokoll var en anpassning av gnagare DiI-perfusionsprotokollet ses i Li et al. 7 , men stora skillnader mellan gnagaren och axolotl krävde en revision av protokollet för att passa axolotl-modellen.
Denna studie diskuterar en metod för DiI-perfusion av axolotl för att framgångsrikt kunna visualisera vaskulaturen. Skillnader i anatomi och fysiologi mellan salamander och gnagare kräver förändringar i huvudaspekterna av perfusionen, inklusive plats för nålinsättning, perfusionsmetod och de använda reagenserna. För att achEn lyckad perfusion begränsade vi skadorna på axolotlens kärl. Vid öppning av bröstkaviteten togs omsorg för att fullständigt utsätta hjärtat och aorta samtidigt som man undviker skador eller lacerationer i större blodkärl. Att begränsa användningen av den kirurgiska saxen förebyggde oavsiktlig klippning av större kärl medan små snitt upprätthöll kontroll över exponeringen av hjärtat och aortan. Framgångsgrader av perfusioner ökade också när DiI-nålen infördes genom aortan, snarare än direkt i hjärtat av hjärtat. Axolotl, till skillnad från musen, har ett trekammat hjärta som innehåller endast en ventrikel med signifikant mindre muskulatur än musens. På grund av dessa skillnader måste placeringen av nålinläggningen flyttas till den mer stabila aortan. Aortan var bestämd att vara den optimala platsen för införande av perfusionsnålen eftersom den är tillräckligt stor för punktering med en 27 G nål och har begränsad rörelse. Rörelsen var minimalFör att undvika oavsiktlig avlägsnande eller glidning av perfusionsnålen eller genom-och-genom-punktering av aortan. Hjärtperfusioner med hjälp av ventrikeln som införingspunkt visade sig ha en mycket lägre framgångshastighet än de med en aortinsättningspunkt. Felaktig punktering av vaskulaturen resulterade ofta i bildandet av emboli eller förhindrad perfusion, vilket resulterade i mycket låga hastigheter av framgångsrik vaskulär märkning. Genom att använda en klämstång för att hålla fjärilnålen under perfusion har vi minskat rörelsen, vilket ökar hastigheten på framgångsrika perfusioner. Dessutom, på grund av delikatessen hos axolotlvävnaden, var i jämförelse med musen en peristaltisk perfusionspump nödvändig, i motsats till den manuella perfusion som tidigare använts. Användningen av denna pump möjliggjorde en handsfri inställning till axolotl-perfusion för att minimera felaktig punktering av de tunna vävnaderna. Perfusioner misslyckades av många ytterligare anledningar, inklusive genom-och-genom punctUrea, koagulering och emboli. Om nålen infördes i aortan och en andra punktering skapades genom den bakre väggen, skulle DiI-lösningen strömma direkt in i bröstkaviteten i stället för att passera genom den systemiska cirkulationen. Dessutom, när blod utstod från vaskulaturen, bildade det snabbt en blodpropp som kunde hindra perfusion. Klor och luftbubblor kan också bildas i kärlkroppen, vilket orsakar emboli som utesluter framgångsrik perfusion. Slutligen justeras detta protokoll med reagens justerat för att passa axolotl-osmolaliteten, som skiljer sig avsevärt från den hos däggdjuret. Anpassning av detta protokoll och de signifikanta förändringar som gjorts för att passa axolotlmodellen kommer att bidra till att förstå processen för revaskularisering av vävnader under regenerering.
DiI, som är rosa i färg, kommer att perfektera djuret och ge den en ljusrosa färgton. Framgångsrikt perfuserade axolotter blev ljusa rosa till blotta ögat, med högtVaskulära områden som förefaller mer intensivt färgade. Perfekterade djur som ses med ett fluorescerande konfokalmikroskop med ett grönt filter kan visualiseras i det röda-orange-emissionsspektret. Vaskulaturen visades bäst i tunnare vävnader som minimerade oavsiktlig DiI-färgning av icke-vaskulära vävnader. Perfusion av vävnaden med 4% paraformaldehyd (PFA) omedelbart efter DiI-perfusion bör göras för att fixera vävnaden.
DiI-perfusioner är ändpunktsexperiment för axolotl. Under förfarandet dräneras allt djurets blod effektivt och ersätts med 0,7x PBS, följt omedelbart genom DiI-lösning och slutligen 4% PFA. Detta försvårar axolotlens förmåga att engagera sig i den vitala växeln av gasutbyte och det förlorar förmågan att syre dess kroppsvävnader. På grund av denna slutpunktskaraktär fångar varje perfusion endast en enda tidpunkt för vaskulär tillväxt, och djuret kan inte perfuseras ytterligare vid en senare tidpunkt. På grund av denna tidsbegränsningTing-faktor måste flera djur användas för att beskriva en tidskurs av vaskulär utveckling.
Detta DiI-protokoll och de ändringar som tillämpas för att förbättra det kan användas för att framgångsrikt märka och visualisera axulotlens kärl. Eftersom axolotl är en väsentlig modellorganisme för studier av regenerering, ger framgångsrika perfusioner möjligheter att förhöra processen för angiogenes under regenerering. Axolotl är en modellorganisme för studier av regenerering eftersom det är ett snyggt djur och därför behåller en anmärkningsvärd förmåga att regenerera under vuxen ålder 8 . Revaskulariseringsprocessen för regenererande vävnader är emellertid inte väl förstådd, därför ger anpassningen av DiI-perfusionen till axolotl-systemet möjligheter att förstå regenerering som inte var tillgänglig med däggdjursmodellen. Perfusion av axolotl med DiI är en ny teknik för studier av revasCularisering av regenererande vävnad i denna djurmodell, därför kan detta protokoll användas vidare för att förstå organogenes under utveckling och angiogenes under sjukdom såväl som användas som ett viktigt verktyg under studien av regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Brigham & Women's Hospital och March of Dimes. Författarna skulle vilja tacka alla medlemmar i Whited Lab för deras stöd och råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
