Summary
Het behoud van de bloeddrukbarriere dekking is de sleutel voor de homeostase van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft in vitro technieken om de fundamentele en pathologische processen te definiëren die de bloeddrukbeperking moduleren.
Abstract
Bloed-hersenbarrière (BBB) dekking speelt een centrale rol in de homeostase van het centrale zenuwstelsel (CNS). De BBB wordt dynamisch onderhouden door astrocyten, pericytes en hersenendotheelcellen (BEC's). Hier worden details beschreven om BBB-dekking te beoordelen met behulp van enkele culturen van onsterfelijke menselijke BEC's, enkele culturen van primaire muis-BEC's en een gehumaniseerd triple culture-model (BEC, astrocyten en pericyten) van de BBB. Om de toepasbaarheid van de analyses op ziektetoestanden te benadrukken beschrijven we het effect van oligomere amyloïde-ß (oAβ), die een belangrijke bijdrage levert aan de ziekte van Alzheimer (AD), op BBB-dekking. Verder gebruiken we de epidermale groeifactor (EGF) om het drugscreeningspotentieel van de technieken te verlichten. Uit onze resultaten blijkt dat enkelvoudige en drievoudige gecultiveerde BEC's meshwork-achtige structuren vormen onder basale omstandigheden en dat oAβ deze celwerkvorming vormt en de voorgevormde maasstructuren ontaardt,Maar EGF blokkeert deze verstoring. Zo zijn de beschreven technieken belangrijk voor het analyseren van fundamentele en ziekte-relevante processen die de BBB-dekking moduleren.
Introduction
De bloed-hersenbarrière (BBB) van hersenschapsvaten is de grootste interface van bloed-tot-hersencontact en speelt een centrale rol in de homeostase van het centrale zenuwstelsel (CNS) 1 , 2 . Dynamische processen bij de BBB verhinderen de opname van ongewenste moleculen uit het bloed, verwijderen afvalstoffen uit het CNS, leveren essentiële voedingsstoffen en signaalmoleculen aan het CNS, en moduleren neuro-inflammatie 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-schade komt voor bij veroudering en verschillende neurodegeneratieve stoornissen waaronder de ziekte van Alzheimer (AD), multiple sclerose en beroerte 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Daarom kan BBB-disfunctie een sleutelrol spelen bij neurodegeneratieve stoornissen, ook als therapeutisch doel.
Het behoud van de vaartuigdekking is belangrijk voor de homeostatische functies van de BBB. In vivo en in vitro gegevensconflicten echter of de processen die bij neurodegeneratieve stoornissen betrokken zijn, een hoger of lager BBB-dekking veroorzaken 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , met name in AD. Daarom is er een sterke reden voor de ontwikkeling van in vitro modellen met behulp van relevante celtypen om de dynamiek van BBB-dekking te beoordelen en beter te begrijpen. Serebrale capillairen zijn samengesteld uit astrocyten, pericyten en hersenendotheelcellen (BEC's) 3 . In het algemeen zijn de celcultuurtechnieken voor het beoordelen van BBB-functie permeabiliteitsbepalingen uitgevoerd op cellen die op filterinzetten worden gegroeid, of het beoordelen van niveaus van belangrijke BEC-eiwitten, beide na de toevoeging van stressors 14 , 15 , 16 . Hoewel belangrijk, concentreren deze analyses zich niet op de cerebrovasculaire dekking.
Hier zijn onze vorige methoden 17 gedetailleerd om BEC-dekking en meshwork-achtige structuren te beoordelen met behulp van enkele culturen van onsterfelijke menselijke BEC's, enkele culturen van primaire muis-BEC's en een gehumaniseerde triple cultuurModel (BEC, astrocyten en pericytes) van de BBB. Het doel was om het schadelijke effect van oAβ te demonstreren, die wordt beschouwd als een belangrijke bijdrage aan AD progressie, op BEC dekking. Het beschermende effect van de epidermale groeifactor (EGF) benadrukt het potentieel van de techniek als therapeutisch screeningsinstrument. De techniek heeft verschillende brede toepassingen voor basis- en toegepast onderzoek, waaronder: 1) het bepalen van de rol van specifieke pathways bij angiogenese en dekking van het vaatstelsel; 2) het evalueren van de effecten van ziekte- en verouderingsrelevante factoren op angiogenese en vaatbescherming; en 3) het identificeren van farmacologische targets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten volgen de protocols van de Universiteit van Illinois, Chicago Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Algemene Voorbereiding
OPMERKING: De microvasculaire endotheliale cellijn van de hersenen (hCMEC / D3) is een extensief gekenmerkt immortalized human BEC lijn 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Cultuur de hCMEC / D3-cellen op weefselkweekflessen gecoat met collageen Type I (kalfhuid, 1:20 verdunning van 0,1% oplossing in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) die Ca 2+ en Mg 2+ bevat ) in basaal Endothelial Growth Basal Medium (EBM-2) bevattende 2-5% foetale boviene serum (FBS), 10% ascorbinezuur, 10% gentamicinesulfaat, 25% hydrocortison en 1/4 van het totale volume van de toegevoerde groeifactor supplementen per 500 ml media [ Vaat endothelium grOvth-factor (VEGF), epidermale groeifactor (EGF), insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1) en humane basis fibroblastische groeifactor (bFGF), zie tabel van materialen ].
OPMERKING: EBM-2 medium met FBS en groeifactoren wordt aangeduid als "EBM-2 compleet". EBM-2 zonder FBS en supplementen wordt aangeduid als "EBM-2 basaal". Bij volledige confluentie zijn de hCMEC / D3 cellen ~ 1 x 10 5 cellen / cm 2 .
- Passage de hCMEC / D3 cellen in een verhouding van 1: 5 door eerst gedurende 3 minuten met HBSS te incuberen zonder Ca 2+ en Mg 2+, gevolgd door afscheiding met 5 ml trypsine / EDTA (0,25%) gedurende 5 minuten. Neutraliseer de trypsine met behulp van EBM-2 compleet (1: 1 neutralisatie) en centrifugeer bij 290 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C; Weggooi de supernatant. Resuspendeer de pellet in EBM-2 compleet en herplatteer bij een verhouding van 1: 5.
- Cultuur de primaire menselijke pericytes en astrocyten volgens het protocol van de leverancier [ Lijst van stoffen ]. CulturE de pericytes in pericyte basaal medium met FBS en pericyte groei supplement.
- Cultuur de menselijke astrocyten in astrocytemedium die astrocytegroei factoren bevatten. Cultuur zowel de pericytes als de astrocyten in weefselkweekflessen bekleed met 3 ml poly-L-lysine (PLL) voor celadhesie en gebruik de cellen tussen de passages 2 en 5.
- Euthanize 7 muizen en verwijder de hersenstengels en cerebella met tang; Verwijder de meninges door de hersenen zorgvuldig te rollen op gaas. Knip het resterende hersenweefsel in een Petri schotel in Minimal Essential Medium (MEM) met HEPES (5 ml per hersen) met een steriel scheermesje. Isoleer de primaire muis-BEC's uit 2 maanden oude C57BL / 6J-muizen volgens het beschreven protocol 20 .
- Breng het gehakte hersenweefsel over in een 15 ml conische buis. Centrifugeer bij 290 xg gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en incubeer het weefsel in een papain (833,33 μL per hersen) en DNase (41,7 μL per hersen)Oplossing, in een 37 ° C waterbad gedurende 1 uur, om het weefsel te verteren.
- Triturateer het homogenaat sequentieel door middel van 19 en 21 gauge naalden, meng bij een verhouding van 1: 1 met een 22% Bovine Serum Albumin (BSA) oplossing en centrifugeer bij 1360 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de resulterende pellet in 1 ml EBM-2 compleet en centrifugeer bij 290 xg gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer opnieuw in 1 ml EBM-2 en vul de cellen (1 ml / putje) op 6-putjes platen bedekt met collageen (~ 1 brein per putje).
- Vervang de media 24 uur later met EBM-2 compleet met 4 μg / ml puromycine hydrochloride; Vervang met EBM-2 compleet na 2 dagen. De primaire BEC's worden gekweekt als voor de hCMEC / D3-cellen en zijn bij volledige confluentie bij 1 x 105 cellen / cm2.
- Bereid een 100 μM oAβ, 24 uur voor de test op.
OPMERKING: oAβ wordt beschouwd als de ziekte relevante vorm van A. Voor oAβ, gebruik de goed gekarakteriseerde preparaten beschreven door DahlgreN et al. 21 . - Ontdooi de keldermembraan voorraadoplossing 's nachts bij 4 ° C en evenwijd in steriele PCR buisstrips (8 buizen) bij 140 μl keldermembraan per buis. Bevestig elke strip en berg bij -20 ° C. Doe één strip per 96-putjesplaat op 4 ° C, 24 uur voor de test. Pre-afkoel de pipet tips om stolling te vermijden.
OPMERKING: Alle afhandeling van de basismembraanmatrix moet op ijs worden uitgevoerd om snelle stolling te vermijden. Aangezien 10 μl per putje keldermembraan op de dag van de test gebruikt wordt, is elke strip voldoende voor een 96-putjesplaat. - Incubeer volledig confluente BEC's in EBM-2 basaal, 24 uur voorafgaand aan de test.
OPMERKING: De reden is: EBM-2 compleet bevat aangevulde factoren en FBS met als doel de optimale celgroei te bevorderen; Echter, dezelfde moleculaire trajecten die celgroei bevorderen, zijn ook belangrijk voor de dekking van de endotheelcel en de dynamiek van de hersenen, zowel in aanwezigheid als in abseNce van een stressor. Daarom verhogen serum en supplement de BEC's om het confounding effect van de resterende activatie van cellulaire signaalwegen te verminderen. Van de notitie worden de cellen kort (5 min) blootgesteld aan FBS tijdens de neutralisatie van getriptineerde cellen voorafgaand aan de test. In tegenstelling tot BEC's zijn de pericytes en astrocyten niet gehongerd aan het serum, door de eis van verschillende factoren voor groei en de relatieve instabiliteit van deze celtypes in reactie op serumhongersnood (Tai laboratorium, ongepubliceerde waarnemingen).
OPMERKING: EBM-2 basaal wordt gebruikt tijdens de analyse voor de single en triple cultuur meshwork formatie en ontwrichting assays. Dit is van cruciaal belang om te voorkomen dat de stressor of de behandelingsafhankelijke signalering confronteren.
2. Meshwork-achtige Formation and Disruption Assays
- Enkele BEC-kweekassays:
OPMERKING: Drie verschillende paradigma's voor de enkele culturen van BEC's worden getoond in Figuur 1A - Op de dag van de test pipetteert u de membraanmatrix van de kelder bij 10 μl / putje in de bodem van 96-putjes platen en laat u gedurende 1 uur bij 37 ° C instellen.
- Suspenseer de gelyofiliseerde groene cel tracking kleurstof (zie Tabel van Materialen ) in 10 μL DMSO om een 10 mM voorraadoplossing te genereren en verdund tot 10 μM (1: 1000) in EBM-2 basaal. Verwijder het medium uit de volledig samenvloeiende fles en vervang met EBM-2 basaal die de groene celvolgorde bevat (5 ml voor een 75 cm 2 fles). Preload BEC's met de groene cel tracking kleurstof, 20 minuten voorafgaand aan het begin van de test.
- Incubeer de cellen gedurende 20-30 minuten bij 37 ° C, verwijder het medium met cell tracking kleurstof en los de cellen zoals beschreven in stap 1.1. Neutraliseer de media met EBM-2 die 10% FBS bevat en centrifugeer bij 240 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resulteer de pellet in 1 ml EBM-2 basaal.
- Plateer de BEC's in de 96-putjesplaat bij 10.000 cellen / put in EBM-2 basaal (0 uur tijdspunt in alle paradigma's).
OPMERKING: Afhankelijk van het paradigma dat wordt gebruikt, worden behandelingen, stressors of voertuigcontroles op de aangegeven tijdstippen toegevoegd. In alle paradigma's wordt het medium geoogst voor latere analyse ( bijv. ELISA-analyse) en cellen worden 24 uur vastgemaakt met vers bereid 4% paraformaldehyde in fosfaatbufferde serum (PBS). Als een alternatieve aanpak om de term effecten van oAβ op maasvorming te bepalen, kan het protocol worden aangepast om samenvloeiende celkweekflessen met oAβ te incuberen en vervolgens de maaswerkvormingsparadigma's (+/- oAβ) uit te voeren.
OPMERKING: Het uiteindelijke volume in elke put voor alle paradigma's bedraagt 70 μL. Alle behandelingen (oAβ, EGF, enz. ) Worden aan hun respectieve putjes toegevoegd bij een verdunning van 1:20, dwz 3,5 μl per behandeling. Voor Paradigm 1 worden de cellen toegevoegd in een cel suspensie oplossing bij 63 μl / well. Onmiddellijk oAp, gewenste behandelingen en controles worden toegevoegd bij 3,5 μl / putje elk, waardoor in totaal 70 μl wordt verkregen. Voor Paradigm 2 worden 63 μl cel suspensie en 3,5 μl behandeling ( bijv. 100 ng / ml EGF) toegevoegd op het 0 h tijdspunt. Na 4 uur incubatie wordt 3,5 μl van een oAβ-voorraad toegevoegd ( bijv. Voor 100 nM laatste oAp-concentratie, 3,5 μl van 2 uM oAβ-voorraad). Voor Paradigm 3 wordt 63 μl cel suspensie toegevoegd op het 0 h tijdspunt en bij 4 uur worden oAp en gewenste behandelingen toegevoegd bij 3,5 μl / putje elk, waardoor in totaal 70 μl wordt verkregen. Deze volumes kunnen worden aangepast volgens de behandelingen. Bijvoorbeeld, als er maar één behandeling nodig is, kan het celsuspensievolume worden aangepast aan 66,5 μL (handhaven 10.000 cellen / putje) en het behandelingsvolume kan bij 3,5 μl blijven.
OPMERKING: Naast de enkele cultuuranalyses van BEC's, hebben we ontwikkeldEen triple culture assay paradigma ( Figuur 1B ) uit te voeren om de respons van BEC's, pericytes en astrocyten binnen voorgevormde netwerken aan relevante stressoren te bepalen ( bijv. OAβ). BEC's worden geplateerd in aanwezigheid van gewenste behandelingen op 0 uur. Om 4 uur worden pericytes zachtjes aan de plaat toegevoegd. Om 7 uur worden astrocyten toegevoegd aan de plaat, gevolgd door de toevoeging van een stressor op 11 uur. Cellen worden vervolgens geïncubeerd tot het 24 h tijdspunt.
OPMERKING: Voor de drievoudige cultuuranalyses is het belangrijk timing te overwegen om ervoor te zorgen dat alle cellen tegelijkertijd samenvloeien. Menselijke astrocyten en pericyten moeten 1 week vóór de test worden gekweekt, terwijl de hCMEC / D3-cellen 4-5 dagen vóór de testdatum moeten worden geplateerd of doorgevoerd. Verder is het belangrijk om lage passage (2-5) primaire cellen te gebruiken om fenotypische drift te vermijden.
- Voeg de werkzame oplossing van de groene celopsporing toe aan de hCMEC / D3-cellen 20 minuten voordat de test wordt gestart. Platte de hCMEC / D3 cellen op 10, 000 cellen / put in EBM-2 basaal (0 uur tijdspunt). De gebruikte hoeveelheden zijn 45 μL cel suspensie en 3,5 μl behandeling ( dwz de uiteindelijke EGF concentraties van 50 ng / mL, 100 ng / mL of 1000 ng / mL uit voorraden die 20 keer meer geconcentreerd zijn).
- Na de incubatie van 3,5 uur bij 37 ° C, voeg de werkende oplossing met blauwe celopsporingskleur toe (10 μM celtracker blauw in EBM-2 basaal) aan de menselijke primaire pericytes. Voeg bij het 4 h tijdspunt (~ 30 min incubatie met cell tracking kleurstof) 2,000 pericytes / putje op de plaat die de hCMEC / D3 bevat in een volume van 6 μL / putje.
- Na een extra 2,5 uur incubatie (totaal 6,5 uur vanaf 0 uur tijdspunt), voeg de werkende oplossing met oranje celopsporingsverf (10 μM celtracker oranje in EBM-2 basaal) toe aan de menselijke primaire astrocyten. Voeg bij het 7 h tijdspunt zachtjes 10.000 astrocyten / putjes toe aan de plaat in 12 μl volume. Daarom is de totale cellulaire verhouding voor endotheelcellen: pericytes: astrocyten iS 5: 1: 5. Verder is het volume op dit punt bereikt 66,5 μL.
- Voeg oAβ (3,5 μL 100 μM voorraad) 4 uur later (totaal 11 uur vanaf 0 uur tijdspunt).
- Zet de cellen 13 uur later in vers bereide 4% paraformaldehyde in PBS.
Voorzichtigheid: Draag beschermende kleding, handschoenen en bril tijdens het hanteren van paraformaldehyde.
3. Kwantificering
- Vang fluorescentiebeelden van de hele put van de 96-putjesplaat bij 1,6x vergroting met een belichtingstijd van 2 s bij maximaal 50% maximale vermogen met behulp van een dissectiemicroscoop.
OPMERKING: gelijkwaardige microscopen kunnen worden gebruikt; Het is echter van cruciaal belang om de hele put vast te leggen voor uitgebreide analyse. - Voor kwantitatieve analyse verwerk de beelden met behulp van de ImageJ angiogenese analysator plugin 22 om het aantal takken, aantal mazen en totale cellengte te kwantificeren (deze uitlezingen worden automatisch door de softwa getabuleerdRe) zoals hieronder beschreven. Een gedetailleerd visueel protocol van deze stap is verschaft in figuur 2 .
- Open Fiji ImageJ door op het software icoon te klikken.
- Klik op de dubbele rode voorwaartse pijlen aan het einde van de werkbalk en klik vervolgens op "Angiogenesis Analyzer".
- Selecteer de map met beeldbestanden, klik op "Openen".
- Wanneer het vak 'Instellingen voor analyse' verschijnt, klikt u op 'OK'.
- Wanneer het vak "Bewerkingsafbeeldingen" verschijnt, wat het aantal beelden aangeeft dat u wilt verwerken, klikt u op "OK".
- Wanneer het vak "Progress progress window" verschijnt, die de geschatte verwerkingstijd aangeeft. Tijdens deze tijd kwantificeert het programma de uitgangen, waaronder het aantal takken, aantal mazen en totale cellengte.
OPMERKING: Nadat alle beelden gekwantificeerd zijn, verschijnt het resultaatbestand in de originele afbeeldingsmap als een spreadsheetdocument. - kiezenHet spreadsheetbestand bevat resultaten en vergelijk het aantal takken, mazen en totale cellengte tussen groepen.
OPMERKING: In de triple cultuuranalyse wordt ImageJ verder gebruikt om percyte / astrocyt dekking en aantal te analyseren. Beelden worden gedrempeld door een verblind experimentator en de functie "analyse deeltjes" die gebruikt wordt om uitlees te genereren. Vaste cellen en buisvormige structuren kunnen ook immunostained zijn voor Aβ 17 of andere markers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In enkele culturen vormen zowel de hCMEC / D3-cellen ( Figuur 3A ) en de primaire muis-BEC's ( Figuur 3B ) meshwerkvormige structuren in de put. De structuren worden gekenmerkt door een netwerkwerk van onderling verbonden knooppunten ( Figuur 3 ). In alle beschreven paradigma's ( Figuur 1 ) zijn de meshwork-achtige structuren gelijk na 24 uur in de controlegroepen, die 20 meshwork-achtige structuren vormen met een totale cellulaire lengte van ~ 10.000 pixels.
Om de toepasbaarheid van de methoden voor ziekte relevante stressoren te benadrukken, werd oAβ toegevoegd aan de hCMEC / D3 en de primaire muis-BEC's in twee paradigma's. Bij de verstoring van de celmaaswerkvorming (Paradigm 1) worden oAβ en cellen tegelijkertijd geplateerd. Bij de verstoring van het voorgevormde netwerkwerk (Paradigm 2) wordt oAβ toegevoegd4 uur na plating van de cellen (zie figuur 1A ). OAp bij 100 nM veroorzaakt verstoring van de meshwork-achtige vorming en degeneratie van voorvormig netwerkwerk ( Figuur 3A , 3B ). Bijvoorbeeld, met behulp van de hCMEC / D3 cellen in beide paradigma's, is kwantificering van de totale cel dekking / lengte 16-20% lager met 100 nM oAβ 17 . Verder wordt het aantal mazen verminderd met 40% met 100 nM oAp in beide paradigma's 17 . Zo veroorzaakt een ziekte-relevante stressor een soortgelijk schadelijk effect op de humane en muizen BEC dekking.
Een belangrijk voordeel van het celcultuur systeem is het vermogen om factoren of behandelingen te identificeren die ziekteverwante schade voorkomen, die vervolgens kan worden ingezet voor in vivo testen. Als bewijs van principe experimenten, de effecten van de belangrijkste angiogene groeifactoren op het voorkomen van oAβ-geïnduceerde chaNges tot de dekking van de vaartuig werd beoordeeld 17 . Het EGF voorkomde oAβ-geïnduceerde schade aan de hCMEC / D3 cellen. Gebaseerd op die gegevens werd EGF getest in een preventieparadigma met behulp van een transgene muismodel dat kritieke aspecten van AD-achtige pathologie recapituleert. EGF-behandeling voorkomt de cognitieve en BBB-tekorten, inclusief degeneratie van de vaten 23 . Deze gegevens ondersteunen het predictieve potentieel van het in vitro systeem voor in vivo activiteit. Momenteel gebruiken we alle drie ontwikkelde paradigma's voor screening: 1) maasvorming, 2) preventie van het verstoren van de celwerk, en 3) gelijktijdige behandeling van meshwork-verstoring. Zoals gemarkeerd in figuur 3 , kan EGF beschermen tegen oAβ-geïnduceerde schade in onsterfelijke en primaire muis BEC culturen.
De BBB bestaat uit BEC's, pericytes en astrocyten die samen bijdragen aan de algehele cerebrovascUlar dekking. Daarom is één aanpassing van het in vitro systeem de opneming van alle drie de typen van BBB-cellen. Ons triple culture assay paradigma bevat de hCMEC / D3 cellen, primaire menselijke pericytes en primaire menselijke astrocyten, die sequentiaal worden toegevoegd aan de basismembraan matrix ( Figuur 1B ). In het triple cultuurassayparadigma vormen de hCMEC / D3-cellen een soortgelijk maaswerkpatroon als in de enkele culturen, maar met de pericytes en astrocyten die aan de knooppunten en aan de takken verbonden zijn ( Figuur 4 ). De toevoeging van 100 nM oAβ veroorzaakt meshwork verstoring (~ 10-15%) en een vermindering van het aantal pericytes in contact met de BEC's 17 . In correlatie met de data afgeleid van de enkele kweekassay paradigma's, wordt oAβ-geïnduceerde schade door EGF behandeling voorkomen. Zo is het triple culture BBB model goed geschikt voor studies gericht op de interactieve effecten van astrocyten, pericYtes en BEC's op schipdynamiek.
Figuur 1: Overzicht van meshwork formatie en ontwrichting assays. ( A ) Enkele cultuur analyse paradigma's. Paradigm 1, meshwork formatie. Cellen, stressors en behandelingen worden allemaal toegevoegd aan de plaat op het 0 h tijdspunt. Paradigm 2, preventie van meshwork verstoring. Cellen worden geplateerd in aanwezigheid van gewenste behandelingen, geïncubeerd gedurende 4 uur en een stressor wordt toegevoegd op het 4 h tijdspunt. Paradigma 3, gelijktijdige behandeling van meshwork verstoring. Cellen worden geplateerd en mogen meshwork-achtige structuren vormen gedurende 4 uur voordat behandelingen en / of stressoren tegelijkertijd worden toegevoegd op het 4 h tijdspunt. Alle paradigma's eindigen op het 24 h tijdspunt en cellen worden vastgezet met 4% paraformaldehyde. ( B ) Trippelcultuuranalyseparadigma. BEC's (10.000 cellen / putjes) zijn in de druk geplateerdInhoud van gewenste behandelingen op 0 uur. Op het 4 uur tijdspunt worden pericytes (2.000 cellen / putje) zachtjes aan de plaat toegevoegd. Bij 7 uur worden astrocyten (10.000 cellen / putjes) aan de plaat toegevoegd, gevolgd door de toevoeging van relevante stressoren op 11 uur. Cellen worden vervolgens geïncubeerd tot het 24 h tijdspunt en gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kwantitatieve analyse. Alle beelden worden geopend op Fiji ImageJ en batchverwerkt met behulp van de Angiogenesis Analyzer 22 . Kwantificering van de totale lengte en het aantal mazen worden gebruikt. Klik hier om een grotere versie van t te zienZijn figuur
Figuur 3: Meshwork disruption assays: representatieve afbeeldingen. Alle afbeeldingen zijn afgeleid van experimenten die gebruik maken van Paradigm 2, meshwork verstoring. ( A ) Representatieve afbeeldingen van de hCMEC / D3-cellen geplateerd en behandeld met vehikelcontrole (VC), EGF (100 nM), oAp (100 nM) of oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Beelden bij 10X vergroting, Schaalbalk = 100 μm. ( B ) Representatieve afbeeldingen van de primaire muis-BEC's die werden geplateerd en behandeld met VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) of oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Beelden bij 10X vergroting, groen = BEC, Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Drievoudige cultuuranalyse: representatieve afbeeldingen. ( A ) Representatieve afbeeldingen van de hCMEC / D3-cellen, primaire menselijke pericyten en primaire menselijke astrocyten, geplateerd en behandeld met VC, EGF (100 nM), oAp (100 nM) of oAβ (100 nM) + EGF (100 nM) Volgens het in figuur 1B beschreven paradigma. Beelden bij 10X vergroting, groen = BEC, blauw = pericytes en rood (pseudocolor) = astrocyten. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven methoden kunnen worden gebruikt om verschillende fundamentele biologische vragen aan te pakken die betrekking hebben op cerebrovasculaire dekking 24 . Specifiek kunnen zij identificeren welke receptoren en signaalwegen een rol spelen bij angiogenese, vaatdekking in kankerweefsel en perifere endotheliale cellen die relevant zijn voor de hersenen. Voorbeelden omvatten angiogene groeifactorreceptoren, stikstofoxide, mitogeen geactiveerde proteïne kinase signalering en calcium signalering 25 , 26 , 27 . De hCMEC / D3 en de primaire BEC's zijn te wijten aan genetische knockdown benaderingen om deze inspanning te vergemakkelijken 18 . Mechanisch inzicht kan worden verkregen uit het cultiveren van BEC's geïsoleerd van muizen met volledige of endotheliale celspecifieke knockdown van sleutelproteïnen met de beschreven methoden. Verder maken de triple culture assays een diepgaande analyse van de astrocytische en pericyte influenc mogelijkE op de endotheliale celfunctie van de hersenen. Pericytes en astrocyten kunnen bijvoorbeeld meshvormige vaatvorming beïnvloeden door middel van de productie van oplosbare mediators ( bijvoorbeeld angiopoietine, cytokinen) en ook via structurele ondersteuning 24 .
Het model systeem kan ook toegepast worden op ziekteonderzoek. Bijvoorbeeld kan het systeem aanpakken of ziekte- en verouderingsrelevante stressoren exogene bevorderen van angiogenese en / of meshwork verstoring. Stressors kunnen relevant zijn voor een specifieke aandoening, bijvoorbeeld oAβ, of meer generalized, bijvoorbeeld waterstofperoxide, cytokines. Het triple cultuur paradigma voegt een extra laag complexiteit toe die het begrip van kritische, ziekte-relevante mechanismen kan verbeteren die de dynamiek van BBB beïnvloeden: het bepalen of ziekte-relevante stressoren astrocyten en pericytes activeren om de BEC-functie te verstoren. Voor zowel enkelvoudige als drievoudige kweekanalyses kunnen de primaire cellen geïsoleerd wordenM muismodellen die afwijken van belangstellende aandoeningen om de functionele effecten verder te definiëren.
Er zijn een aantal belangrijke overwegingen voor het aanpassen van de meshwork-achtige vorming en ontwrichting assays voor verschillende cellen typen. De eerste is de zaaddichtheid. Voor elke nieuwe cellijn optimaliseert een kritische eerste stap de seedichtheden in de basismembraanmatrix voor zowel de enkelvoudige als drievoudige kweekanalyses. De maasvorming is afhankelijk van het celnummer, omdat zowel te hoge als te lage celdichtheid resulteert in een gebrek aan meshworkvorming. Verder, zelfs voor de hierin beschreven methoden en cellen, is het verstandig om celdichtheidsvergelijkingen te verrichten om rekening te houden met eventuele laboratoriumvariaties in celverwerking voorafgaand aan het uitvoeren van grotere experimenten. De tweede overweging is de tijdelijke volgorde van de maaswerkvorming. Tijdschool experimenten moeten worden uitgevoerd om te identificeren wanneer meshwork-achtige structuren vormen en degraderen. Typisch een robuuste meshwork-lIke vorming wordt waargenomen bij ~ 4 uur. De derde overweging is de keuze van medium voor het zaaien en tijdens het experiment. BEC's, pericytes en astrocyten worden gekweekt in medium dat FBS bevat en een overvloed aan groeifactoren die zijn geoptimaliseerd voor celgroei. Hoewel het de voorkeur heeft aan serum en groeifactor de BEC's 24 uur voor het experiment verhongeren, kan dit voor bepaalde celtypes niet haalbaar zijn. Bijvoorbeeld, primaire cellen met specifieke receptor knockdowns kunnen extra factoren vereisen om de groei te vergemakkelijken. Deze overwegingen gelden ook tijdens het experiment, en de keuze van het medium is afhankelijk van de specifieke vraag die wordt onderzocht. Bij het onderzoek naar de rol van exogeen toegevoegd stressoren en potentiële behandelingen, in het bijzonder groeifactoren of gerelateerde verbindingen, is het gebruik van serum- en groeifactorvrij medium tijdens het experiment ideaal. Daarnaast kan het mogelijk zijn om de lengte van de serumhongering van de BEC's te verminderen, maar dit is afhankelijk van het sigNaling route onderzocht. Een vierde overweging is het timing van stressors of behandelingen toevoegen. Wat de keuze voor middelgrote behandeling betreft, zijn de timingen gebaseerd op de wetenschappelijke vraag. De maaswerkvormingsassay is meer analoog aan angiogenese, terwijl de meshwork disruption assay meer relevant kan zijn voor een volwassen BBB. In onze ervaring, die ooit opgericht zijn, produceren de analyses consistente gegevens tussen experimenten. Consistentieproblemen zijn vaak te wijten aan de verschillen in het dichtheidsdichtheid tussen personeel, en vooral als componenten van het medium of relevante reagentia onbewust veranderd zijn.
Er zijn beperkingen en gebieden van verdere ontwikkeling van de beschreven methoden. Een kracht van deze procedure is dat lage concentraties stressor ( dwz oAβ) kunnen worden gebruikt om meshwork verstoring te veroorzaken, dwz nM vergeleken met μM, die meer fysiologisch relevant zijn. Deze kracht kan echter ook een beperking zijn. Inderdaad, hoger, bNog steeds niet-toxisch, kunnen concentraties van oAβ nodig zijn voor het screenen van geneesmiddelen om de gevoeligheid te verhogen, die van toepassing zal zijn op andere ziekteverwante stressoren. Een beperking van de methode is dat het netwerkwerk van cellen slechts 24 uur stabiel is in de beschreven protocollen. Inderdaad, na 24 uur beginnen de celnetwerken te ontaarden. Daarom voegen we na een relatief korte tijd (4 uur) oAβ na de maaswerkvorming toe, om een totale oAβ incubatietijd van 18 uur mogelijk te maken. Misschien kunnen lagere zaaddichtheiden langer behandelingsprotocollen mogelijk maken. Een verdere potentiële beperking is dat het in vitro systeem geen stabiel netwerkwerk van cellen mag nabootsen zoals in vivo werd waargenomen. Het isoleren van de cellen van oudere muizen kan het in vivo scenario nauwkeuriger nabootsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Leon Tai wordt gefinancierd door University of Illinois Chicago start-up fondsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
