Summary
Поддержание охвата кроветворного мозга является ключевым фактором гомеостаза центральной нервной системы. Этот протокол описывает методы in vitro для определения фундаментальных и патологических процессов, которые модулируют покрытие гематоэнцефалического барьера.
Abstract
Охват гематоэнцефалического барьера (ВВВ) играет центральную роль в гомеостазе центральной нервной системы (ЦНС). BBB динамически поддерживается астроцитами, перицитами и эндотелиальными клетками мозга (BECs). Здесь мы подробно описываем методы оценки охвата ВВВ с использованием единых культур увековеченных человеческих BEC, одиночных культур первичных мышей BEC и гуманизированной модели тройной культуры (BEC, астроциты и перициты) BBB. Чтобы подчеркнуть применимость анализов к болезненным состояниям, мы описываем эффект олигомерного амилоида-β (oAβ), который является важным фактором развития болезни Альцгеймера (AD) при охвате BBB. Кроме того, мы используем эпидермальный фактор роста (EGF), чтобы осветить потенциал скрининга лекарственного средства этих методов. Наши результаты показывают, что одиночные и тройные культивированные BEC формируют сетчатые структуры в базовых условиях и что oAβ разрушает это образование ячеистых ячеек и дегенерирует предварительно сформированные сетчатые структуры,Но EGF блокирует это нарушение. Таким образом, описанные методы важны для анализа фундаментальных и связанных с заболеванием процессов, которые модулируют покрытие ВВВ.
Introduction
Гематоэнцефалический барьер (ВВВ) мозговых капилляров является самым большим связующим звеном между контактом крови и мозга и играет центральную роль в гомеостазе центральной нервной системы (ЦНС) 1 , 2 . Динамические процессы на BBB предотвращают поглощение нежелательных молекул из крови, удаляют отходы из ЦНС, подают необходимые питательные вещества и сигнальные молекулы в ЦНС и модулируют нейровоспаление 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Ущерб ВВВ распространен во время старения и несколько нейродегенеративных расстройств, включая болезнь Альцгеймера (AD), рассеянный склероз и инсульт 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Следовательно, дисфункция ВВВ может играть ключевую роль в нейродегенеративных нарушениях, в том числе в качестве терапевтической цели.
Сохранение покрытия судна важно для гомеостатических функций ВВВ. Тем не менее, in vivo и in vitro данные противоречат тому, являются ли процессы, связанные с нейродегенеративными нарушениями, более высоким или более низким охватом BBB 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , особенно в AD. Таким образом, существует сильное обоснование для разработки моделей in vitro с использованием соответствующих типов клеток для оценки и более всестороннего понимания динамики охвата ВВВ. Церебральные капилляры состоят из астроцитов, перицитов и эндотелиальных клеток мозга (BECs) 3 . В общем, методы клеточной культуры для оценки функции ВВВ представляют собой анализы проницаемости, проводимые на клетках, выращенных на фильтрационных вставках, или на оценку уровней ключевых белков BEC как после добавления стрессоров 14 , 15 , 16 . Хотя важно, эти анализы не фокусируются на охвате мозгового кровообращения.
Здесь наши предыдущие методы 17 подробно описаны для оценки охвата BEC и структур, подобных сетке, с использованием единых культур увековеченных человеческих BEC, одиночных культур первичных мышей BEC и гуманизированной тройной культуры(БЭК, астроциты и перициты) ВВВ. Целью было продемонстрировать пагубное влияние oAβ, которое считается важным фактором развития AD, на покрытие BEC. Защитный эффект эпидермального фактора роста (EGF) подчеркивает потенциал метода в качестве терапевтического инструмента для скрининга. Этот метод имеет несколько широких применений для фундаментальных и прикладных исследований, в том числе: 1) определение роли конкретных путей ангиогенеза и покрытия сосудов; 2) оценка влияния болезней и факторов, связанных с старением, на ангиогенез и покрытие сосудов; 3) выявление фармакологических цели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты следуют за протоколами Университета штата Иллинойс, Чикагский институт по уходу за животными и их использованию.
1. Общая подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ. Линия микрососудистой эндотелиальной клетки мозга (hCMEC / D3) представляет собой широко охарактеризованную иммортализованную линию BEC 14 , 15 , 16 , 18 , 19 человека . Культуру клеток hCMEC / D3 на колбах для тканевой культуры, покрытых коллагеном типа I (коллаген кожи, 1:20 разбавление 0,1% раствора в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS), содержащем Ca 2+ и Mg 2+ ) в базальной эндотелиальной основе Базальная среда (EBM-2), содержащего 2-5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10% аскорбиновой кислоты, 10% гентамицина сульфата, 25% гидрокортизона и 1/4 от общего объема добавленных добавок фактора роста на 500 мл среды [ Сосудистый эндотелий gr(VEGF), эпидермальный фактор роста (EGF), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) и человеческий основной фибробластический фактор роста (bFGF), см. Таблицу материалов ].
ПРИМЕЧАНИЕ. Средство EBM-2 с FBS и факторами роста упоминается как «EBM-2 complete». EBM-2 без FBS и добавок упоминается как «EBM-2 базаль». При полном слиянии клетки hCMEC / D3 составляют ~ 1 × 10 5 клеток / см 2 .
- Пропускайте клетки hCMEC / D3 в соотношении 1: 5 путем первой инкубации с HBSS в течение 3 мин без Ca 2+ и Mg 2+ с последующим отсоединением 5 мл трипсина / ЭДТА (0,25%) в течение 5 мин. Нейтрализуйте трипсин с использованием EBM-2 (нейтрализация 1: 1) и центрифугируйте при 290 × g в течение 5 мин при 4 ° C; Отбросьте супернатант. Повторно суспендируйте гранулу в EBM-2 в полном объеме и повторно поднимите при соотношении 1: 5.
- Культура первичных человеческих перицитов и астроцитов в соответствии с протоколом поставщика [ Таблица материалов ]. КУЛЬТУРАE перициты в перицитовой базальной среде с добавкой FBS и перицитом.
- Культура астроцитов человека в среде астроцитов, содержащей факторы роста астроцитов. Культура как перицитов, так и астроцитов в колбах для тканевой культуры, покрытых 3 мл поли-L-лизина (PLL) для клеточной адгезии и использования клеток между проходами 2 и 5.
- Усыпьте 7 мышей и удалите мозговые стебли и церебис с помощью щипцов; Отделите мозговые оболочки, аккуратно перевернув мозги на марлю. Mince оставшаяся ткань головного мозга в чашке Петри в минимальной основной среде (MEM) с HEPES (5 мл на мозг) со стерильным лезвием бритвы. Изолируйте первичные мышиные BEC от 2-месячных мышей C57BL / 6J в соответствии с ссылочным протоколом 20 .
- Перенесите измельченную мозговую ткань в 15 мл коническую трубку. Центрифугируют при 290 × g в течение 5 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и инкубируйте ткань в папаине (833,33 мкл на мозг) и ДНКазе (41,7 мкл на мозг)Раствор на водяной бане при 37 ° С в течение 1 ч для переваривания ткани.
- Разогрейте гомогенат последовательно через иглы 19 и 21 калибра, смешайте в соотношении 1: 1 с 22% раствором бычьей сыворотки альбумина (BSA) и центрифугируйте при 1360 × g в течение 10 минут при 4 ° C.
- Ресуспендируют полученный осадок в 1 мл EBM-2 и центрифугируют при 290 × g в течение 5 мин при 4 ° C. Ресуспендируют снова в 1 мл ЭБМ-2 и заполняют клетки (1 мл / лунку) на 6-луночных планшетах, покрытых коллагеном (~ 1 мозг на лунку).
- Замените носитель через 24 часа с помощью EBM-2, содержащего 4 мкг / мл гидрохлорида пуромицина; Замените его на EBM-2 через 2 дня. Первичные BEC культивируют как для клеток hCMEC / D3, так и при полном слиянии при 1 × 10 5 клеток / см 2 .
- Подготовьте 100 мкМ oAβ, за 24 часа до анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: oAβ считается подходящей для болезни формой A. Для oAβ используйте хорошо охарактеризованные препараты, описанные DahlgreN et al. 21 . - Оттепель основного раствора мембранной основы в течение ночи при 4 ° С и аликвоты в стерильные пробирки для ПЦР (8 пробирок) на 140 мкл мембраны основания на пробирку. Перемотайте каждую полосу и храните при -20 ° C. Оттереть одну полосу на 96-луночный планшет при 4 ° C, за 24 часа до анализа. Предварительно охладите наконечники пипетки, чтобы избежать затвердевания.
ПРИМЕЧАНИЕ. Вся обработка матричной мембраны основания должна выполняться на льду, чтобы избежать быстрого затвердевания. Поскольку в день анализа используют 10 мкл на лунку подвальной мембраны, каждая полоска достаточна для одной 96-луночной планшеты. - Инкубируйте полностью сливающиеся BEC в базальной части EBM-2, за 24 часа до анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ. Обоснование заключается в следующем: в состав EBM-2 входят дополнительные факторы и FBS с целью содействия оптимальному росту клеток; Однако те же молекулярные пути, которые способствуют росту клеток, также важны для охвата и динамики эндотелиальных клеток мозга, как в присутствии, так и в abseNce стрессора. Поэтому мы используем сыворотку и добавку, чтобы голодать от BEC, чтобы уменьшить смешение эффекта остаточной активации клеточных сигнальных путей. Следует отметить, что клетки кратковременно (5 мин) подвергаются воздействию FBS во время нейтрализации трипсинированных клеток до анализа. В отличие от BEC, перициты и астроциты не являются голодающими в сыворотке из-за необходимости различных факторов роста и относительной нестабильности этих типов клеток в ответ на голодание в сыворотке (лаборатория Тай, неопубликованные наблюдения).
ПРИМЕЧАНИЕ: базальт EBM-2 используется во время анализа для однократного и тройного культивирования и анализа разрушения сетки. Это имеет решающее значение для предотвращения смешивания сигналов, связанных с напряжением или обработкой.
2. Профилирование и разрушение в форме сетки
- Единичные анализы культуры BEC:
ПРИМЕЧАНИЕ. Три разных парадигмы для отдельных культур BEC показаны на рисунке 1A - В день анализа нанести пипеткой матрицу подвальной мембраны на 10 мкл / лунку в дно 96-луночных планшетов и дать установить на 1 час при 37 ° C.
- Приоритет лиофилизированного красителя для отслеживания зелёных клеток (см. Таблицу материалов ) в 10 мкл ДМСО для получения 10 мМ исходного раствора и разбавляют до 10 мкМ (1: 1000) в базальной части EBM-2. Удалите носитель из полностью конфлюентной колбы и замените базальтом EBM-2, содержащим краситель для отслеживания зеленой клетки (5 мл для колбы объемом 75 см 2 ). Предварительно загружайте BEC с помощью красителя для отслеживания зеленой клетки за 20 минут до начала анализа.
- Инкубируйте клетки в течение 20-30 мин при 37 ° С, удалите среду с помощью клеточного следящего красителя и отсоедините клетки, как описано в шаге 1.1. Нейтрализуйте среду с помощью EBM-2, содержащего 10% FBS, и центрифугируйте при 240 × g в течение 5 мин при 4 ° C. Ресуспендируют гранулу в 1 мл базального EBM-2.
- Пластины BEC в 96-луночном планшете на 10000 клеток / лунку в базальном базисе EBM-2 (0-часовая точка во всех парадигмах).
ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от используемой парадигмы в указанные моменты времени добавляются процедуры, стрессоры или средства управления транспортным средством. Во всех парадигмах среда собирают для последующего анализа ( например, анализ ELISA) и клетки фиксируют в течение 24 часов свежеприготовленным 4% параформальдегидом в фосфатной буферной сыворотке (PBS). В качестве альтернативного подхода для определения термина эффектов oAβ при образовании сетки протокол может быть модифицирован для предварительной инкубации сливных культуральных колб с oAβ, а затем выполнить парадигмы формирования сетки (+/- oAβ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Конечный объем в каждой лунке для всех парадигм составляет 70 мкл. Все обработки (oAβ, EGF и т. Д. ) Добавляют к их соответствующим лункам при разведении 1:20, т.е. 3,5 мкл на обработку. Для Paradigm 1 клетки добавляют в раствор суспензии клеток при 63 мкл /флигель. Немедленно oAβ, желаемые обработки и контрольные образцы добавляют по 3,5 мкл / лунку каждый, давая в общей сложности 70 мкл. Для Paradigm 2 добавляют 63 мкл клеточной суспензии и 3,5 мкл обработки ( например, 100 нг / мл EGF) в 0-часовой момент времени. После 4-часовой инкубации добавляют 3,5 мкл запаса oAβ ( например, для 100 нМ конечной концентрации oAβ, 3,5 мкл 2 мкМ oAβ). Для Paradigm 3 добавляют 63 мкл клеточной суспензии в 0-часовой момент времени и через 4 ч добавляют аАβ и желаемую обработку добавляют по 3,5 мкл / лунку каждый, давая в общей сложности 70 мкл. Эти объемы можно регулировать в соответствии с процедурами. Например, если требуется только одна обработка, объем суспензии клеток можно регулировать до 66,5 мкл (поддерживая 10 000 клеток / лунку), и объем обработки может оставаться на уровне 3,5 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ. В дополнение к анализу единственной культуры БЭК, мы разработали( Рис. 1B ), чтобы определить реакцию BEC, перицитов и астроцитов в рамках предварительно сформированных сетей на соответствующие стрессоры ( например, oAβ). BEC высевают в присутствии желаемых обработок в течение 0 часов. Через 4 ч к пластине осторожно добавляют перициты. Через 7 часов к пластине добавляют астроциты с последующим добавлением стрессора в 11 часов. Затем клетки инкубируют до 24 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для тройных анализов культуры важно учитывать сроки, чтобы гарантировать, что все ячейки сливаются одновременно. Человеческие астроциты и перициты следует культивировать за 1 неделю до анализа, тогда как клетки hCMEC / D3 необходимо покрывать или пассировать за 4-5 дней до даты анализа. Кроме того, важно использовать первичные клетки с низким проходом (2-5), чтобы избежать фенотипического дрейфа.
- Добавьте к рабочему раствору красителя для отслеживания зеленой клетки к ячейкам hCMEC / D3 за 20 минут до начала анализа. Пластины клеток hCMEC / D3 при 10, 000 клеток / лунка в базальной части EBM-2 (точка времени 0 ч). Используемые объемы составляют 45 мкл клеточной суспензии и 3,5 мкл лечения ( т.е. конечные концентрации EGF 50 нг / мл, 100 нг / мл или 1000 нг / мл из запасов, которые в 20 раз более концентрированы).
- После 3,5-часовой инкубации при 37 ° С добавьте рабочий раствор красителя для отслеживания синей ячейки (10 мкМ клеточного трекера голубого в базальном базисе EBM-2) к первичным перицитам человека. На 4-часовой временной интервал (~ 30 мин инкубации с клеточным следящим красителем) аккуратно добавьте 2000 мкл / лунку к пластине, содержащей hCMEC / D3, в объеме 6 мкл / лунку.
- После дополнительной 2,5-часовой инкубации (всего 6,5 ч с 0-часовой точки) добавьте рабочий раствор для окрашивания оранжевого клеточного следящего раствора (10 мкМ клеточного трекера оранжевого цвета в базальте EBM-2) к первичным астроцитам человека. В 7-часовой момент времени аккуратно добавьте 10000 астроцитов / лунку к пластине в объеме 12 мкл. Следовательно, общее клеточное соотношение для эндотелиальных клеток: перициты: астроциты iS 5: 1: 5. Кроме того, достигнутый до этого объем составляет 66,5 мкл.
- Добавить oAβ (3,5 мкл 100 мкМ запаса) через 4 часа (всего 11 ч с 0-часовой точки).
- Закрепите клетки через 13 часов в свежеприготовленном 4% параформальдегиде в PBS.
Осторожно: носите защитную одежду, перчатки и очки при обращении с параформальдегидом.
3. Количественная оценка
- Захват флуоресцентных изображений всей лунки 96-луночного планшета с увеличением 1,6 раза с временем экспозиции 2 с при максимальной мощности 50% с использованием рассекающего микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ. Эквивалентные микроскопы могут быть использованы; Тем не менее, крайне важно захватить всю скважину для всестороннего анализа. - Для количественного анализа обработайте изображения с помощью модуля 22 анализатора анализа изображения ImageJ, чтобы количественно определить количество ветвей, количество ячеек и общую длину ячейки (эти отсчеты автоматически отображаются в таблице с помощью softwaRe), как описано ниже. Подробный визуальный протокол этого шага представлен на рисунке 2 .
- Откройте fiji ImageJ, щелкнув значок программного обеспечения.
- Нажмите на двойные красные стрелки вправо, расположенные в конце панели инструментов, затем нажмите «Анализатор ангиогенеза».
- Выберите папку с файлами изображений, нажмите «Открыть».
- Когда появится окно «Настройки для анализа», нажмите «ОК».
- Когда появится окно «Обработка изображений», в котором указано количество обрабатываемых изображений, нажмите «ОК».
- Когда появится окно «окно пакетной обработки», которое указывает расчетное время обработки. В течение этого времени программа количественно определяет результаты, включая количество ветвей, количество ячеек и общую длину ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ. После того, как все изображения будут количественно определены, файл результатов появится в папке исходного изображения в виде документа электронной таблицы. - ВыбратьФайл электронной таблицы, содержащий результаты, и сравнить количество ветвей, сеток и общую длину ячейки между группами.
ПРИМЕЧАНИЕ. В тройном анализе культуры ImageJ дополнительно используется для анализа охвата и количества перицитов / астроцитов. Изображения порождаются слепым экспериментатором и функцией «анализировать частицы», используемой для генерации отсчетов. Фиксированные клетки и подобные трубе структуры также могут быть иммунизированы для Aβ 17 или других маркеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В отдельных культурах как клетки hCMEC / D3 ( фиг. 3A ), так и первичные мышиные BEC ( фиг. 3B ) образуют сетчатые структуры во всей лунке. Структуры характеризуются сеткой взаимосвязанных узлов ( рис. 3 ). Во всех описанных парадигмах ( рис. 1 ) структуры, подобные сетке, схожи через 24 часа в контрольных группах, образуя ~ 20 мешероподобных структур с общей длиной ячейки ~ 10 000 пикселей.
Чтобы подчеркнуть применимость методов к связанным с заболеванием стрессорам, oAβ был добавлен в hCMEC / D3 и первичные мышиные BEC в двух парадигмах. При разрушении образования ячеистых ячеек (Paradigm 1) oAβ и клетки высевают одновременно. При разрушении предварительно сформированной сетки (Paradigm 2) oAβ добавляется4 часа после нанесения покрытия на ячейки (см. Рис. 1А ). OAβ при 100 нМ индуцирует нарушение образования сетчатой структуры и дегенерацию предварительно сформированной сетки ( рис. 3А , 3В ). Например, используя клетки hCMEC / D3 в обеих парадигмах, количественная оценка полного покрытия / длины клеток на 16-20% ниже при 100 нМ oAβ 17 . Кроме того, количество сеток уменьшается на 40% при 100 нМ oAβ в обеих парадигмах 17 . Таким образом, связанный с заболеванием стресс-фактор вызывает аналогичное вредное воздействие на покрытие BEC человека и мышей.
Ключевым преимуществом системы клеточной культуры является способность идентифицировать факторы или методы лечения, которые предотвращают вред, наносящий вред здоровью, который затем может пройти к тестированию in vivo . В качестве доказательства принципиального эксперимента эффекты основных ангиогенных факторов роста на предотвращение индуцированного aAβ chaБыли оценены 17 . EGF предотвращал вызванное OAβ повреждение клеток hCMEC / D3. Основываясь на этих данных, EGF тестировалась в парадигме профилактики с использованием модели трансгенных мышей, которая повторяет критические аспекты AD-подобной патологии. Обработка EGF предотвратила дефицит когнитивного и ВВВ, включая дегенерацию сосудов 23 . Эти данные поддерживают предсказательный потенциал системы in vitro для активности in vivo . В настоящее время мы используем все три разработанные парадигмы для скрининга: 1) образование сетки, 2) предотвращение разрушения ячеистых ячеек и 3) одновременное лечение разрушения сетки. Как показано на рисунке 3 , EGF может защищать от индуцированного oAβ повреждения в культурах BEC, иммортализованных и первичных.
BBB состоит из BEC, перицитов и астроцитов, которые в совокупности способствуют общему цереброваскуОхват. Поэтому одним адаптацией системы in vitro является включение всех трех типов клеток BBB. Наша парадигма анализа тройной культуры включает клетки hCMEC / D3, первичные человеческие перициты и первичные человеческие астроциты, которые последовательно добавляются к матрице подвальной мембраны ( рис. 1B ). В парадигме тройного анализа культуры клетки hCMEC / D3 образуют аналогичную структуру сетки, как в отдельных культурах, но с перицитами и астроцитами, прикрепленными к узлам и соединительным ветвям ( рис. 4 ). Добавление 100 нМ oAβ индуцирует разрушение сетки (~ 10-15%) и уменьшение количества перицитов, контактирующих с BEC 17 . В корреляции с данными, полученными из парадигм анализа единственной культуры, индуцированное аАβ повреждение предотвращается обработкой EGF. Таким образом, модель BBB с тройной культурой хорошо подходит для исследований, посвященных интерактивным эффектам астроцитов, pericYtes и BEC по динамике судна.
Рисунок 1: Обзор методов формирования и разрушения сетки. ( A ) Парадигмы одиночной культуры. Парадигма 1, формирование сетки. Клетки, стрессоры и процедуры добавляются к пластине в 0-часовой момент времени. Парадигма 2, предотвращение разрушения сетки. Клетки высевают в присутствии желаемых обработок, инкубируют в течение 4 ч и добавляют стресс-фактор в 4-часовой момент времени. Парадигма 3, одновременное лечение разрушения сетки. Клетки высевают и дают возможность образовывать сетчатые структуры в течение 4 ч, прежде чем процедуры и / или стрессоры добавляют одновременно в 4-часовой момент времени. Все парадигмы заканчиваются в 24-часовой момент времени, а клетки фиксируются 4% параформальдегидом. ( B ) Парадигма тройной культуры. BEC (10 000 клеток / лунка) высевают в прессуВ течение 0 ч. В течение 4 ч перикарды (2000 клеток / лунку) осторожно добавляют к пластине. Через 7 часов к пластине добавляют астроциты (10 000 клеток / лунку) с последующим добавлением соответствующих стрессоров через 11 часов. Затем клетки инкубируют до 24-часовой временной точки и фиксируют с помощью 4% параформальдегида. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Количественный анализ. Все изображения открываются на Fiji ImageJ и обрабатываются партиями с помощью анализатора ангиогенеза 22 . Используется количественная оценка общей длины и количества ячеек. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию tЕго фигурой.
Рисунок 3: Анализы разрушения сетки: репрезентативные изображения. Все изображения получены из экспериментов с использованием Paradigm 2, сбой сети. ( A ) Репрезентативные изображения клеток hCMEC / D3, покрытых и обработанных транспортным средством (VC), EGF (100 нМ), oAβ (100 нМ) или oAβ (100 нМ) + EGF (100 нМ). Изображения с увеличением 10X, Шкала шкалы = 100 мкм. ( B ) Репрезентативные изображения первичных мышей BEC, покрытых и обработанных VC, EGF (100 нМ), oAβ (100 нМ) или oAβ (100 нМ) + EGF (100 нМ). Изображения с увеличением 10X, зеленый = BEC, Шкала шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Тройной анализ культуры: репрезентативные изображения. ( A ) Репрезентативные изображения клеток hCMEC / D3, первичных человеческих перицитов и первичных человеческих астроцитов, покрытых и обработанных VC, EGF (100 нМ), oAβ (100 нМ) или oAβ (100 нМ) + EGF (100 нМ) В соответствии с парадигмой, описанной на рисунке 1B . Изображения с увеличением 10X, зеленые = BEC, синий = перициты и красный (псевдоколор) = астроциты. Шкала шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные методы могут быть использованы для решения ряда фундаментальных биологических вопросов, связанных с охватом мозгового кровообращения 24 . В частности, они могут идентифицировать, какие рецепторы и сигнальные пути играют роль в ангиогенезе, покрытии сосудов в раковой ткани и периферических эндотелиальных клетках, имеющих отношение к головному мозгу. Примеры включают рецепторы ангиогенного фактора роста, оксид азота, сигнализацию митоген-активированной протеинкиназы и сигнализацию кальция 25 , 26 , 27 . HCMEC / D3 и первичные BEC изменяются для генетических подходов к нокдауну для содействия этим усилиям 18 . Механическое понимание может быть получено от культивирования BEC, изолированных от мышей с полным или эндотелиальным клеточным специфическим нокдауном ключевых белков с описанными методами. Кроме того, анализ тройной культуры позволяет провести углубленный анализ влияния астроцитов и перицитовE о функции эндотелиальных клеток головного мозга. Например, перициты и астроциты могут влиять на образование сосудов, подобных сосуду, путем производства растворимых медиаторов ( например, ангиопоэтина, цитокинов), а также через структурную поддержку 24 .
Модельная система также может быть применена к исследованиям болезней. Например, система может решить, добавляют ли стрессоры, связанные с заболеванием и старением, экзогенно способствуют ангиогенезу и / или разрушению сетки. Стрессоры могут иметь отношение к определенному расстройству, например, oAβ или более обобщенному, например, пероксиду водорода, цитокинам. Парадигма тройной культуры добавляет дополнительный уровень сложности, который может улучшить понимание критически важных механизмов, влияющих на заболеваемость, которые влияют на динамику ВВБ: определение того, активируют ли соответствующие стрессоры болезни астроциты и перициты, чтобы нарушить функцию BEC. Для однократного и тройного культуральных анализов первичные клетки могут быть изолированы отM мыши, которые имитируют расстройства, представляющие интерес для дальнейшего определения функциональных эффектов.
Существует ряд важных соображений для адаптации анализов, связанных с сеткой, и анализа разломов для разных типов клеток. Первая - плотность посева. Для каждой новой клеточной линии критически важным первым шагом является оптимизация плотности посева в матрице подвальной мембраны как для однократного, так и для тройного культуральных анализов. Образование сетки зависит от числа клеток, поскольку как слишком высокая, так и слишком низкая плотность клеток приводит к отсутствию образования сетки. Кроме того, даже для описанных здесь методов и ячеек целесообразно проводить сравнение плотности клеток для учета любых лабораторных изменений в обработке клеток до проведения экспериментов с крупномасштабными масштабами. Второе соображение - временная последовательность формирования сетки. Необходимо провести эксперименты с курсом времени, чтобы определить, как образуются и деградируют структуры, подобные сетке. Как правило, надежная сетка-lОбразование наблюдается при ~ 4 ч. Третье соображение - выбор среды перед посевом и во время эксперимента. BEC, перициты и астроциты культивируют в среде, которая содержит FBS и множество факторов роста, оптимизированных для роста клеток. Хотя предпочтительно, чтобы сыворотка и фактор роста голодали BEC за 24 часа до эксперимента, для некоторых типов клеток это может оказаться невозможным. Например, первичные клетки со специфическими нокдаунами рецепторов могут потребовать дополнительных факторов для облегчения роста. Эти соображения также применяются во время эксперимента, и выбор среды зависит от конкретного исследуемого вопроса. Однако при исследовании роли экзогенно добавленных стрессоров и потенциальных методов лечения, особенно факторов роста или родственных соединений, использование сыворотки и фактора роста без факторов во время эксперимента является идеальным. Кроме того, может быть возможным уменьшить длину голодания сыворотки BEC, но это зависит от сигаNaling pathway под следствием. Четвертое соображение - это время добавления стрессоров или лечения. Что касается выбора медикаментозного лечения, то тайминги основаны на научном вопросе. Анализ образования сетки более аналогичен ангиогенезу, тогда как анализ разрушения сетки может быть более уместным для зрелого ВВВ. По нашему опыту, когда они были установлены, анализы дают согласованные данные между экспериментами. Проблемы непротиворечивости часто связаны с расхождениями в плотности посева между персоналом, и, что важно, если компоненты среды или соответствующие реагенты неосознанно изменены.
Существуют ограничения и области дальнейшего развития описанных методов. Сила этой процедуры заключается в том, что низкие концентрации стрессора ( т.е. oAβ) могут быть использованы для индуцирования разрушения сетки, т.е. nM по сравнению с μM, которые являются более физиологически релевантными. Однако эта сила также может быть ограничением. Действительно, выше, bUt все еще нетоксичен, концентрации αAβ могут потребоваться для целей скрининга наркотиков, чтобы повысить чувствительность, которая будет применяться к другим связанным с заболеванием стрессорам. Ограничение метода заключается в том, что сетка ячеек только стабильна в течение 24 часов в описанных протоколах. Действительно, через 24 ч клеточные сетки начинают дегенерировать. Поэтому мы добавляем oAβ через относительно короткое время (4 часа) после образования сетки, чтобы обеспечить полное время инкубации oAβ в течение 18 часов. Возможно, более низкое значение плотности посева может позволить более длительные протоколы лечения. Еще одним потенциальным ограничением является то, что система in vitro не может имитировать стабильную сетку клеток, как это наблюдается в in vivo . Изоляция клеток от старых мышей может более точно имитировать сценарий in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Леон Тай финансируется фондами начальных фондов Чикагского университета штата Иллинойс.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
