Summary
Opprettholdelse av blod-hjerne barriere dekning er nøkkelen til homeostasis av sentralnervesystemet. Denne protokollen beskriver in vitro teknikker for å avgrense de grunnleggende og patologiske prosessene som modulerer blod-hjerne barriere dekning.
Abstract
Blod-hjernebarriere (BBB) dekning spiller en sentral rolle i homeostasen i sentralnervesystemet (CNS). BBB holdes dynamisk av astrocytter, pericytter og hjerne endotelceller (BEC). Her beskriver vi metoder for å vurdere BBB-dekning ved bruk av enkeltkulturer av immortaliserte humane BEC, enkeltkulturer av primære mus-BEC, og en humanisert triple-kulturmodell (BEC, astrocyter og pericytter) av BBB. For å markere anvendelighet av analysene til sykdomstilstander, beskriver vi effekten av oligomer amyloid-β (oAβ), som er en viktig bidragsyter til Alzheimers sykdom (AD) -progresjon, på BBB-dekning. Videre benytter vi den epidermale vekstfaktoren (EGF) for å belyse stoffets screeningspotensial av teknikkene. Våre resultater viser at single og triple cultured BECs danner meshwork-lignende strukturer under basale forhold, og at oAβ forstyrrer denne celle meshwork formasjonen og degenererer de preformed mesh strukturer,Men EGF blokkerer denne forstyrrelsen. Således er de beskrevne teknikkene viktige for å dissekere grunnleggende og sykdomsrelevante prosesser som modulerer BBB-dekning.
Introduction
Blodhjernebarrieren (BBB) av cerebrale kapillærer er det største grensesnittet mellom blod-til-hjernekontakt og spiller en sentral rolle i hemostasen i sentralnervesystemet (CNS) 1 , 2 . Dynamiske prosesser på BBB forhindrer opptak av uønskede molekyler fra blodet, fjerner avfallsprodukter fra CNS, leverer essensielle næringsstoffer og signalmolekyler til CNS, og modulerer nevrologi 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-skade er utbredt ved aldring og flere nevrodegenerative forstyrrelser, inkludert Alzheimers sykdom (AD), multippel sklerose og slag 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Derfor kan BBB-dysfunksjon spille en nøkkelrolle i neurodegenerative lidelser, inkludert som et terapeutisk mål.
Opprettholdelse av fartøyets dekning er viktig for de homeostatiske funksjonene til BBB. Imidlertid er in vivo og in vitro datakonflikt om hvorvidt prosessene involvert i nevrodegenerative forstyrrelser forårsaker høyere eller lavere BBB-dekning 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , spesielt i AD. Derfor er det en sterk begrunnelse for utviklingen av in vitro- modeller ved bruk av relevante celletyper for å vurdere og forståere dynamikken til BBB-dekning. Serebral kapillærer består av astrocytter, pericytter og hjerne endotelceller (BEC)
Her er våre tidligere metoder 17 detaljert for å vurdere BEC-dekning og meshwork-lignende strukturer ved bruk av enkeltkulturer av immortaliserte humane BEC'er, enkeltkulturer av primære mus-BEC'er og en humanisert trippelkulturModell (BEC, astrocyter og pericytter) av BBB. Målet var å demonstrere den skadelige effekten av oAβ, som anses som en viktig bidragsyter til AD-progresjon, på BEC-dekning. Den beskyttende effekten av epidermal vekstfaktoren (EGF) fremhever potensialet av teknikken som et terapeutisk screeningsverktøy. Teknikken har flere brede anvendelser for grunnleggende og anvendt forskning, herunder: 1) avgrense rollen av spesifikke veier angiogenese og fartøy dekning, 2) evaluere effektene av sykdom og aldringsrelevante faktorer på angiogenese og fartøy dekning, og 3) identifisere farmakologiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter følger University of Illinois, Chicago Institutional Animal Care og Use Committee protokoller.
1. Generell forberedelse
MERK: Hjernens mikrovaskulære endotelcellelinje (hCMEC / D3) er en omfattende karakterisert immortalisert human BEC linje 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Kultur hCMEC / D3-celler på vevskulturflasker, belagt med kollagen Type I (kalveskinn, 1:20 fortynning av 0,1% oppløsning i Hank Balanced Salt Solution (HBSS) som inneholder Ca 2+ og Mg 2+ ) i basalt endotell vekstbasalt medium (EBM-2) inneholdende 2-5% føtalt bovint serum (FBS), 10% askorbinsyre, 10% gentamicinsulfat, 25% hydrokortison og 1/4 av totalvolumet av de tilveiebragte vekstfaktor-supplementene per 500 ml medier [ Vaskulært endotelium grOvf-faktor (VEGF), epidermal vekstfaktor (EGF), insulinlignende vekstfaktor 1 (IGF-1) og human basisk fibroblastisk vekstfaktor (bFGF), se tabell over materialer ].
MERK: EBM-2 medium med FBS og vekstfaktorer refereres til som "EBM-2 komplett". EBM-2 uten FBS og kosttilskudd refereres til som "EBM-2 basal". Ved full sammenblanding er hCMEC / D3-cellene ~ 1 x 105 celler / cm2.
- Passere hCMEC / D3-cellene i et forhold på 1: 5 ved først å inkubere med HBSS i 3 minutter uten Ca 2+ og Mg 2+ etterfulgt av løsrivelse med 5 ml trypsin / EDTA (0,25%) i 5 minutter. Nøytraliser trypsinet ved å bruke EBM-2 komplett (1: 1 nøytralisering) og sentrifuger ved 290 xg i 5 minutter ved 4 ° C; Kast supernatanten. Resuspender pelleten i EBM-2 komplett og replater i forholdet 1: 5.
- Kultur de primære menneskelige pericytene og astrocytter i henhold til leverandørens protokoll [ Tabel over materialer ]. KulturE pericytene i pericyte basalt medium med FBS og pericyte veksttilskudd.
- Kultur de menneskelige astrocytter i astrocytmedium som inneholder astrocytvekstfaktorer. Kultur både pericytene og astrocytene i vevskulturkolber belagt med 3 ml poly-L-lysin (PLL) for celleadhærens og bruk cellene mellom passasjer 2 og 5.
- Euthanize 7 mus og fjern hjernestamlene og cerebella med tang Løsne meninges ved å forsiktig rulle hjernen på gasbind. Hakk det gjenværende hjernevævet i en petriskål i Minimal Essential Medium (MEM) med HEPES (5 mL per hjerne) med et sterilt barberblad. Isoler primære mus-BEC fra 2 måneder gamle C57BL / 6J mus i henhold til den refererte protokollen 20 .
- Overfør det hakkede hjernevævet til et 15 ml konisk rør. Sentrifuger ved 290 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og inkuber vevet i en papain (833,33 μL per hjerne) og DNase (41,7 μL per hjerne)Oppløsning i et 37 ° C vannbad i 1 time for å fordøye vevet.
- Triturater homogenatet sekvensielt gjennom 19 og 21 gauge nåler, bland ved 1: 1 forhold med en 22% Bovine Serum Albumin (BSA) løsning og sentrifuger ved 1360 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender den resulterende pellet i 1 ml EBM-2 fullstendig og sentrifuger ved 290 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspender igjen i 1 ml EBM-2 og fyll opp cellene (1 ml / brønn) på 6 brønnplater belagt med kollagen (~ 1 hjerne per brønn).
- Bytt media 24 timer senere med EBM-2 komplett inneholdende 4 μg / ml puromycin hydroklorid; Bytt ut med EBM-2 komplett etter 2 dager. De primære BEC blir dyrket som for hCMEC / D3-cellene og er i full sammenfatning ved 1 x 105 celler / cm2.
- Forbered en 100 μM oAβ, 24 timer før analysen.
MERK: oAβ betraktes som den sykdomsrelaterte formen av A. For oAβ, bruk de godt karakteriserte preparatene beskrevet av DahlgreN et al. 21 . - Tør basalmembran-stamopløsningen over natten ved 4 ° C og alikvot i sterile PCR-rørstrimler (8 rør) ved 140 ul basalmembran pr. Rør. Frys hver stripe og lagre ved -20 ° C. Tørk en stripe per 96-brønnplate ved 4 ° C, 24 timer før analysen. Forkjøl pipettespissene for å unngå størkning.
MERK: All håndtering av kjellermembranmatrisen må utføres på is for å unngå rask størkning. Da 10 μl per brønn av kjellermembran blir brukt på analysedagen, er hver strimmel tilstrekkelig for en 96 brønnplate. - Inkubér fullt konfluente BEC i EBM-2 basal, 24 timer før analysen.
MERK: Begrunnelsen er: EBM-2 komplett inneholder supplerende faktorer og FBS med det formål å fremme optimal cellevekst; Imidlertid er de samme molekylære banene som fremmer cellevekst også viktig for hjerneendotelcelledekning og -dynamikk, både i nærvær og abseNese av en stressor. Vi sverker derfor serum og supplement til BEC for å redusere forstyrrende effekten av gjenværende aktivering av cellulære signalveier. Av oppmerksomhet blir cellene kort (5 min) utsatt for FBS under nøytralisering av trypsiniserte celler før analysen. I motsetning til BEC er pericytene og astrocytterne ikke sultede på grunn av kravet til forskjellige faktorer for vekst og den relative ustabiliteten til disse celletyper som respons på serumsulting (Tai-laboratorium, upubliserte observasjoner).
MERK: EBM-2 basal benyttes under analysen for enkelt- og trippelkultur meshwork-dannelse og avbruddstest. Dette er kritisk for å forhindre forstyrrende stressor eller behandlingsavhengig signaling.
2. Meshwork-lignende formasjons- og forstyrrelsesanalyser
- Enkelt BEC-kulturanalyser:
MERK: Tre forskjellige paradigmer for de enkelte kulturer av BEC er vist i figur 1A - På analysedagen pipetterer man kjellermembranmatrisen ved 10 μl / brønn inn i bunnen av 96-brønnplater og lar seg stille i 1 time ved 37 ° C.
- Suspensér den lyofiliserte grøntcellesporingsfargen (se tabell over materialer ) i 10 μl DMSO for å danne en 10 mM stockløsning og fortynne til 10 μM (1: 1000) i EBM-2 basal. Fjern mediet fra den fullt konfluente kolben og erstatt med EBM-2 basal som inneholder den grønne cellesporingsfargen (5 ml for en 75 cm 2 kolbe). Preload BECs med den grønne celle sporing fargestoff, 20 min før starten av analysen.
- Inkubér cellene i 20-30 minutter ved 37 ° C, fjern mediet med cellesporingsfargestoff og løsne cellene som beskrevet i trinn 1.1. Nøytraliser media med EBM-2 som inneholder 10% FBS og sentrifuger ved 240 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspender pelleten i 1 ml EBM-2 basal.
- Plasser BECene i 96-brønnplaten ved 10.000 celler / brønn i EBM-2 basal (0 timepunkt i alle paradigmer).
MERK: Avhengig av hvilket paradigme som benyttes, blir behandlinger, stressorer eller kjøretøykontroller lagt til på de angitte tidspunktene. I alle paradigmer høstes mediet for etterfølgende analyse ( f.eks. ELISA-analyse) og celler fastes på 24 timer med ferskt tilberedt 4% paraformaldehyd i fosfatbuffert serum (PBS). Som en alternativ tilnærming for å bestemme termeneffekter av oAβ på nettdannelse, kan protokollen modifiseres for å inkuberere sammenflytende cellekulturflaser med oAβ, og deretter utføre meshworkformasjonsparadigmaene (+/- oAβ).
MERK: Det endelige volumet i hver brønn for alle paradigmer er 70 μL. Alle behandlinger (oAβ, EGF, etc. ) blir tilsatt til deres respektive brønner ved en 1:20 fortynning, dvs. 3,5 μl per behandling. For Paradigm 1 blir cellene tilsatt i en celle-suspensjonsløsning ved 63 μl / well. Umiddelbart oAβ, ønskede behandlinger og kontroller blir tilsatt ved 3,5 μl / brønn hver, hvilket gir totalt 70 μl. For Paradigm 2 blir 63 μl cellesuspensjon og 3,5 μl behandling ( f.eks. 100 ng / ml EGF) tilsatt ved 0 h tidspunktet. Etter 4 timers inkubering tilsettes 3,5 ul av en oAβ-stamme ( f.eks. For 100 nM endelig oAp-konsentrasjon, 3,5 ul 2 μM oAβ-lager). For Paradigm 3 blir 63 μl celle suspensjon tilsatt ved 0 h tidspunktet og ved 4 timer tilsettes oAβ og ønskede behandlinger ved 3,5 μl / brønn hver og gir totalt 70 μl. Disse volumene kan justeres etter behandling. For eksempel, hvis bare en behandling er nødvendig, kan cellesuspensjonsvolumet justeres til 66,5 μL (opprettholde 10.000 celler / brønn) og behandlingsvolumet kan forbli ved 3,5 μl.
MERK: I tillegg til enkeltkulturanalysene av BEC har vi utviklet segUtgitt et trippel kulturanalyseparadigm ( figur 1B ) for å bestemme responsen av BEC, pericytter og astrocytter innenfor preformede nettverk til relevante stressorer ( f.eks. OAβ). BEC er plettet i nærvær av ønskede behandlinger ved 0 timer. På 4 timer legges pericytene forsiktig til platen. På 7 timer legges astrocyter til platen, etterfulgt av tilsetning av en stressor ved 11 timer. Celler blir deretter inkubert til 24 h tidspunktet.
MERK: For triple culture assays er det viktig å vurdere timing for å sikre at alle cellene er sammenflytende samtidig. Menneskelige astrocytter og pericytter bør dyrkes 1 uke før analysen, mens hCMEC / D3-cellene må plateres eller passeres 4-5 dager før analysedato. Videre er det viktig å bruke lavpassasje (2-5) primære celler for å unngå fenotypisk drift.
- Legg til den grønne cellesporingsfarvestoffløsningen til hCMEC / D3-cellene 20 minutter før analysen starter. Plater hCMEC / D3-cellene ved 10, 000 celler / brønn i EBM-2 basal (0 h tidspunkt). Volumene som brukes er 45 μl cellesuspensjon og 3,5 μL behandling ( dvs. endelige EGF-konsentrasjoner på 50 ng / mL, 100 ng / ml eller 1000 ng / ml fra bestandene som er 20 ganger mer konsentrerte).
- Etter 3,5 timers inkubering ved 37 ° C, tilsett den blå cellesporingsfargestoffløsningen (10 μM cellesporeblå i EBM-2 basal) til de menneskelige primære pericytene. På 4 h tidspunktet (~ 30 min inkubering med cellesporingsfargestoff), legg forsiktig 2,000 pericyt / brønn til platen som inneholder hCMEC / D3 i et volum på 6 μl / brønn.
- Etter en ekstra 2,5 timers inkubasjon (totalt 6,5 timer fra 0 timers tidspunkt), tilsett den oransje celleoppfølgingsfarget arbeidsløsning (10 μM cellesporingsorange i EBM-2 basal) til de menneskelige primære astrocytter. På 7 h tidspunktet, legg forsiktig 10 000 astrocyter / brønn til platen i 12 μl volum. Derfor er det totale cellulære forholdet for endotelceller: pericytes: astrocytes iS 5: 1: 5. Videre er volumet oppnådd til dette punkt 66,5 μL.
- Legg til oAβ (3,5 μL 100 μM lager) 4 timer senere (totalt 11 timer fra 0 timer).
- Fiks cellene 13 timer senere i ferskt tilberedt 4% paraformaldehyd i PBS.
Forsiktig: Bruk verneutstyr, hansker og briller når du håndterer paraformaldehyd.
3. Kvantifisering
- Fange fluorescensbilder av hele brønnen på 96-brønnsplaten ved 1,6x forstørrelse med en 2 s eksponeringstid ved 50% maksimal effekt ved hjelp av et disseksjonsmikroskop.
MERK: Ekvivalente mikroskoper kan benyttes; Det er imidlertid viktig å fange hele brønnen for omfattende analyse. - For kvantitativ analyse, behandle bildene ved hjelp av ImageJ angiogenesis analysator plugin 22 for å kvantifisere antall grener, antall masker og total cellelengde (disse lesingene blir automatisk tabulert av softwaRe) som beskrevet nedenfor. En detaljert visuell protokoll for dette trinnet er gitt i figur 2 .
- Åpne fiji ImageJ ved å klikke på programvareikonet.
- Klikk på dobbeltrørspolene fremover på verktøylinjen, og klikk deretter på "Angiogenesis Analyzer".
- Velg mappen med bildefiler, klikk "Åpne".
- Når boksen "Innstillinger for analyse" vises, klikker du på "OK".
- Når "Behandlingsbilder" -boksen vises, som angir antall bilder som skal behandles, klikker du på "OK".
- Når "Batch Progress Window" -boksen vises, som angir estimert behandlingstid. I løpet av denne tiden kvantifiserer programmet utgangene, inkludert antall grener, antall masker og total cellelengde.
MERK: Når alle bildene er kvantifisert, vises resultatfilen i den opprinnelige bildemappen som et regnearkdokument. - Plukke utRegnearkfilen inneholder resultater og sammenligne antall grener, masker og total cellelengde mellom grupper.
MERK: I triple culture analysen blir ImageJ ytterligere brukt til å analysere pericyte / astrocyt dekning og antall. Bilder terskeles av en blindet eksperimentator og funksjonen "analysere partikler" benyttes til å generere readouts. Faste celler og rørlignende strukturer kan også immunostaines for Ap 17 eller andre markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I enkelt kulturer danner både hCMEC / D3-celler ( figur 3A ) og primære mus-BEC ( figur 3B ) mesh-lignende strukturer gjennom brønnen. Strukturene er preget av et nettverk av sammenknyttede noder ( figur 3 ). I alle de beskrevne paradigmene ( figur 1 ) er de meshwork-lignende strukturer like etter 24 timer i kontrollgruppene, og danner ~ 20 mesh-lignende strukturer med en total cellulær lengde på ~ 10.000 piksler.
For å markere anvendelighet av metodene til sykdomsrelaterte stressorer ble oAβ tilsatt hCMEC / D3 og primærmus-BEC i to paradigmer. I forstyrrelsen av celle meshwork formasjon (Paradigm 1), er oAβ og celler plated på samme tid. I forstyrrelsen av preformed meshwork (Paradigm 2), er oAβ lagt tilRedd 4 timer etter plating av cellene (se figur 1A ). OAβ ved 100 nM fremkaller forstyrrelse av den meshwork-lignende formasjonen og degenerering av preformed meshwork ( Figur 3A , 3B ). For eksempel, ved bruk av hCMEC / D3-cellene i begge paradigmene, er kvantifisering av total celledekning / lengde 16-20% lavere med 100 nM oAβ 17 . Videre reduseres antall masker med 40% med 100 nM oAβ i begge paradigmene 17 . Dermed frembringer en sykdomsrelevant stressor en lignende skadelig effekt på humant og mus BEC-dekning.
En viktig fordel ved cellekultursystemet er evnen til å identifisere faktorer eller behandlinger som forhindrer sykdomsrelatert skade, som deretter kan gå videre til in vivo testing. Som et bevis på prinsippet eksperiment, påvirker effektene av de viktigste angiogene vekstfaktorene på å forhindre oAβ-indusert chaNges til fartøydekning ble vurdert 17 . EGF forhindret oAβ-indusert skade på hCMEC / D3-cellene. Basert på disse dataene ble EGF testet i et forebyggingsparadigm ved bruk av en transgen musemodell som rekapitulerer kritiske aspekter av AD-lignende patologi. EGF-behandling forhindret kognitive og BBB-underskudd, inkludert degenerering av kar 23 . Disse dataene støtter det prediktive potensialet for in vitro- systemet for in vivo- aktivitet. For tiden bruker vi alle tre utviklede paradigmer for screening: 1) mesh formasjon, 2) forebygging av celle meshwork forstyrrelse, og 3) samtidig behandling av meshwork forstyrrelse. Som fremhevet i figur 3 kan EGF beskytte mot oAβ-indusert skade i immortaliserte og primære mus-BEC-kulturer.
BBB består av BEC, pericytes og astrocytter som samlet bidrar til total cerebrovascUlar dekning. Derfor er en tilpasning av in vitro- systemet inkorporering av alle tre BBB-celletyper. Vårt trippelkulturanalyseparadigm inkorporerer hCMEC / D3-cellene, primære humane perikytter og primære humane astrocytter, som tilsettes i rekkefølge til kjellermembranmatrisen ( Figur 1B ). I triple culture assay-paradigmet danner hCMEC / D3-cellene et lignende maskeringsmønster som i de enkelte kulturer, men med pericytene og astrocytene festet til noder og forbinder grener ( figur 4 ). Tilsetningen av 100 nM oAβ inducerer maskeringsforstyrrelser (~ 10-15%) og en reduksjon av antall pericytter som kontakter BEC 17 . I korrelasjon med dataene som er avledet fra enkeltkulturanalyseparadigmene, forhindres oAβ-indusert skade ved EGF-behandling. Således er triple culture BBB-modellen velegnet for studier fokusert på interaktive effekter av astrocytter, pericYtes og BECs på fartøyets dynamikk.
Figur 1: Oversikt over nettverksdannelses- og forstyrrelsesanalyser. ( A ) Enkeltkulturanalyseparadigmer. Paradigm 1, meshwork formasjon. Celler, stressorer og behandlinger blir alle lagt til platen på 0 timers tidspunkt. Paradigm 2, forebygging av meshwork forstyrrelse. Celler plateres i nærvær av ønskede behandlinger, inkuberes i 4 timer, og en stressor blir tilsatt ved 4 h tidspunktet. Paradigm 3, samtidig behandling av meshwork forstyrrelse. Celler plateres og får lov til å danne meshwork-lignende strukturer i 4 timer før behandlinger og / eller stressorer tilsettes samtidig på 4 timer tidspunktet. Alle paradigmer slutter på 24 h tidspunktet, og cellene er fikset med 4% paraformaldehyd. ( B ) Trippelkulturanalyseparadigm. BEC (10.000 celler / brønn) er belagt i presEnce av ønskede behandlinger etter 0 timer. Ved 4 timers tidspunkt blir pericytene (2000 celler / brønn) forsiktig tilført platen. Ved 7 timer blir astrocytter (10.000 celler / brønn) tilsatt til platen, etterfulgt av tilsetning av relevante stressorer ved 11 timer. Celler blir deretter inkubert til 24 h tidspunktet og fikseres med 4% paraformaldehyd. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kvantitativ analyse. Alle bilder åpnes på Fiji ImageJ og batchbehandles ved hjelp av Angiogenesis Analyzer 22 . Kvantifisering av total lengde og antall masker benyttes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av tHans figur.
Figur 3: Meshwork avbrudd assays: representative bilder. Alle bilder er avledet fra eksperimenter som bruker Paradigm 2, meshwork forstyrrelse. ( A ) Representative bilder av hCMEC / D3-celler plettert og behandlet med vehikelkontroll (VC), EGF (100 nM), oAβ (100 nM) eller oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Bilder ved 10X forstørrelse, Skala bar = 100 μm. ( B ) Representative bilder av primære mus-BEC platerte og behandlet med VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) eller oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Bilder ved 10X forstørrelse, grønn = BEC, Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Trippelkulturanalyse: Representative bilder. ( A ) Representative bilder av hCMEC / D3-cellene, primære humane pericytter og primære humane astrocyter plettert og behandlet med VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) eller oAβ (100 nM) + EGF (100 nM) I henhold til det paradigme som er beskrevet i figur 1B . Bilder ved 10X forstørrelse, grønn = BEC, blå = pericytes og rød (pseudocolor) = astrocytter. Skalbjelke = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beskrevne fremgangsmåter kan benyttes for å adressere flere grunnleggende biologiske spørsmål rundt cerebrovaskulær dekning 24 . Spesifikt kan de identifisere hvilke reseptorer og signalveier som spiller en rolle i angiogenese, fartøyets dekning i kreftvev og perifere endotelceller som er relevante for hjernen. Eksempler inkluderer angiogene vekstfaktorreceptorer, nitrogenoksyd, mitogenaktivert proteinkinase-signalering og kalsiumsignalering 25 , 26 , 27 . HCMEC / D3 og primære BECs kan endres til genetiske knockdown-tilnærminger for å lette denne innsatsen 18 . Mekanisk innsikt kan oppnås fra dyrking av BEC isolert fra mus med fullstendig eller endotelcelle-spesifikk knockdown av nøkkelproteiner med de beskrevne metoder. Videre muliggjør trippelkulturanalysene en grundig analyse av astrocyt og pericyte influencE på hjerne endotelcellefunksjonen. For eksempel kan pericytter og astrocytter påvirke meshwork-lignende fartøydannelse gjennom fremstilling av oppløselige mediatorer ( f.eks. Angiopoietin, cytokiner) og også via strukturell støtte 24 .
Modelsystemet kan også brukes til sykdomsforskning. For eksempel kan systemet adressere hvorvidt sykdoms- og aldringsrelevante stressorer tilsatt eksogent fremme angiogenese og / eller meshwork-forstyrrelse. Stressorer kan være relevante for en bestemt lidelse, f.eks. OAβ, eller mer generalisert, for eksempel hydrogenperoksid, cytokiner. Trippelkulturparadiset legger til et ekstra lag av kompleksitet som kan forbedre forståelsen av kritiske, sykdomsrelevante mekanismer som påvirker BBB-dynamikken: avgrense hvorvidt sykdomsrelevante stressorer aktiverer astrocytter og pericytter for å forstyrre BEC-funksjonen. For både enkle og tredobbelte kulturanalyser, kan primære celler isoleres fraM musemodeller som etterligner forstyrrelser som er av interesse for ytterligere avgrensning av funksjonelle effekter.
Det er en rekke viktige hensyn for å tilpasse meshwork-lignende formasjon og forstyrrelsesanalyser til forskjellige celletyper. Den første er såddtettheten. For hver ny cellelinje optimaliserer et kritisk første trinn sjøtetthetene i kjellermembranmatrisen for både enkelt- og trippelkulturanalysene. Nettverksdannelsen er avhengig av celletall, da både for høy og for lav celletetthet resulterer i mangel på nettverksdannelse. Videre, selv for metodene og cellene beskrevet heri, er det forsiktig å utføre celletetthetssammenligninger for å ta hensyn til eventuelle laboratorievarianter i cellebehandling før det gjennomføres større skalaforsøk. Det andre hensynet er den tidsmessige sekvensen av nettverksdannelsen. Tidskursforsøk bør utføres for å identifisere når meshwork-lignende strukturer dannes og nedbrytes. Typisk er et robust mesh-lIkeformasjon observeres ved ~ 4 timer. Den tredje vurderingen er valget av medium før sådd og under forsøket. BEC, pericytes og astrocytter dyrkes i medium som inneholder FBS og en mengde vekstfaktorer optimalisert for cellevekst. Selv om det er foretrukket at sult og vekstfaktor sulter BEC'erne 24 timer før forsøket, kan dette for visse celletyper ikke være mulig. For eksempel kan primære celler med spesifikke reseptor-knockdowns kreve ytterligere faktorer for å lette veksten. Disse overvektene gjelder også under forsøket, og valg av medium er avhengig av det spesifikke spørsmålet som undersøkes. Når man imidlertid undersøker rollen som eksogent tilsatte stressorer og potensielle behandlinger, spesielt vekstfaktorer eller beslektede forbindelser, er bruk av serum og vekstfaktorfritt medium under forsøket ideelt. I tillegg kan det være mulig å redusere lengden av serum sult av BEC, men dette er avhengig av sigNaling sti under undersøkelse. En fjerde vurdering er tidspunktet for å legge til stressorer eller behandlinger. Når det gjelder valg av middels behandling, er timingen basert på det vitenskapelige spørsmålet. Maskingsformasjonsanalysen er mer analog med angiogenese, mens meshwork-forstyrrelsesanalysen kan være mer relevant for en moden BBB. I vår erfaring, når etablert, gir analysene konsistente data mellom eksperimenter. Konsistensproblemer skyldes ofte forskjellene mellom seedetyper mellom personell, og viktigere, hvis komponenter av mediet eller relevante reagenser ubevisst endres.
Det er begrensninger og områder med videreutvikling av metodene som er beskrevet. En styrke i denne prosedyren er at lave konsentrasjoner av stressor ( dvs. oAβ) kan benyttes for å indusere maskeringsforstyrrelser, dvs. nM sammenlignet med μM, som er mer fysiologisk relevante. Denne styrken kan imidlertid også være en begrensning. Faktisk høyere, bUt fortsatt giftfri, kan konsentrasjoner av oAβ være påkrevd for stoffskjermingsformål for å øke sensitiviteten, som vil gjelde for andre sykdomsrelaterte stressorer. En begrensning av metoden er at meshwork av celler bare er stabile i løpet av 24 timer i de beskrevne protokoller. Faktisk, etter 24 timer, begynner cellenettverkene å degenerere. Derfor legger vi til oAβ etter en relativt kort tid (4 timer) etter nettverksdannelsen, for å muliggjøre en total oAβ inkubasjonstid på 18 timer. Kanskje lavere celledansningsdensiteter kan muliggjøre lengre behandlingsprotokoller. En ytterligere potensiell begrensning er at in vitro- systemet kanskje ikke etterligner et stabilt nettverk av celler som ville bli observert i in vivo . Isolering av cellene fra gamle mus kan etterligne in vivo scenariet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Leon Tai er finansiert av University of Illinois Chicago oppstartsfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
