Summary
Il mantenimento della copertura della barriera emato-sangue è fondamentale per l'omeostasi del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive tecniche in vitro per delineare i processi fondamentali e patologici che modulano la copertura della barriera emato-sangue.
Abstract
La copertura del sangue-cervello (BBB) svolge un ruolo centrale nell'omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS). Il BBB è mantenuto dinamicamente da astrociti, periciti e cellule endoteliali cerebrali (BECs). Qui metodi dettagliati per valutare la copertura BBB utilizzando singole colture di BEC umani immortalizzati, singole colture di BEC primari del mouse e un modello di coltura triplicata umanizzata (BECs, astrociti e periciti) del BBB. Per evidenziare l'applicabilità dei dosaggi agli stati di malattia, descriviamo l'effetto dell'amyloid oligomerico (oAβ), che rappresenta un importante contributo alla progressione della malattia di Alzheimer (AD), sulla copertura BBB. Inoltre, utilizziamo il fattore di crescita epidermico (EGF) per illuminare il potenziale di screening delle droghe delle tecniche. I nostri risultati mostrano che singole e triple coltivate BECs formano strutture a maglia in condizioni basali e che oAβ interferisce con questa formazione di mesh e degenerizza le strutture preformate di maglie,Ma EGF blocca questa rottura. Quindi le tecniche descritte sono importanti per la dissezione di processi fondamentali e rilevanti per la malattia che modulano la copertura BBB.
Introduction
La barriera emato-cerebrale (BBB) dei capillari cerebrali è la più grande interfaccia del contatto ematico-to-cerebrale e svolge un ruolo centrale nell'omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS) 1 , 2 . I processi dinamici del BBB impediscono l'assorbimento di molecole indesiderate dal sangue, rimuovono i prodotti di scarto dal CNS, forniscono nutrienti essenziali e molecole di segnalazione al CNS e modulano la neuroinflammazione 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Il danno di BBB è prevalente durante l'invecchiamento e diversi disturbi neurodegenerativi tra cui la malattia di Alzheimer (AD), la sclerosi multipla e l'ictus 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Pertanto, la disfunzione di BBB può svolgere un ruolo chiave nei disturbi neurodegenerativi, anche come obiettivo terapeutico.
Il mantenimento della copertura dei recipienti è importante per le funzioni homeostatiche del BBB. Tuttavia, i dati in vivo e in vitro confligano sul fatto che i processi coinvolti nei disturbi neurodegenerativi causino una copertura BBB maggiore o minore 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , particolarmente in AD. Pertanto, vi è una forte logica per lo sviluppo di modelli in vitro utilizzando tipi di cellule per valutare e comprendere in modo più completo le dinamiche della copertura BBB. I capillari cerebrali sono composti da astrociti, periciti e cellule endoteliali cerebrali (BECs) 3 . In generale, le tecniche di coltura cellulare per la valutazione della funzione BBB sono i test di permeabilità eseguiti su cellule coltivate su inserti di filtri o valutando i livelli di proteine chiave BEC, sia dopo l'aggiunta di stress 14 , 15 , 16 . Sebbene importanti, questi dosaggi non riguardano la copertura cerebrovascolare.
Qui, i nostri precedenti metodi 17 sono dettagliati per valutare la copertura BEC e le strutture di tipo reticolo utilizzando singole colture di BEC umani immortalizzati, singole colture di BEC primari del mouse e una cultura tripla umanizzataModello (BEC, astrociti e periciti) del BBB. L'obiettivo era dimostrare l'effetto dannoso di oAβ, che è considerato un importante contributore alla progressione dell'AD, sulla copertura BEC. L'effetto protettivo del fattore di crescita epidermico (EGF) evidenzia il potenziale della tecnica come strumento di screening terapeutico. La tecnica presenta diverse applicazioni per la ricerca di base e applicata, tra cui: 1) definire il ruolo di percorsi specifici in materia di angiogenesi e copertura dei vasi, 2) valutare gli effetti delle malattie e dei fattori rilevanti sull'invecchiamento sull'angiogenesi e sulla vasca e 3) individuare le attività farmacologiche obiettivi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti seguono i protocolli del Comitato di istruzione e tutela degli animali istituzionali dell'Università dell'Illinois, Chicago.
1. Preparazione generale
NOTA: La linea cerebrale endoteliale (hCMEC / D3) è una linea umana immortalizzata ampiamente caratterizzata dalla linea BEC 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Coltivare le cellule hCMEC / D3 sulle colonie di coltura tissutale rivestite con collagene tipo I (pelle di vitello, diluizione 1:20 di soluzione 0,1% in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) contenente Ca 2+ e Mg 2+ ) nel basale Endothelial Growth Basal Medium (EBM-2) contenente 2-5% di siero fetale fetale (FBS), 10% acido ascorbico, 10% gentamicina solfato, 25% idrocortisone e 1/4 del volume totale degli integratori fattori di crescita forniti per 500 mL di supporti [ Vascolare endotelio gr(IGF-1) e fattore di crescita fibroblastica basale umano (bFGF), vedi tabella dei materiali ]. Il fattore di crescita (VEGF), il fattore di crescita epidermico (EGF)
NOTA: il medium EBM-2 con FBS ei fattori di crescita è indicato come "EBM-2 complete". EBM-2 senza FBS e integratori viene chiamato "EBM-2 basal". A piena confluenza, le cellule hCMEC / D3 sono ~ 1 x 10 5 cellule / cm 2 .
- Passaggio delle cellule hCMEC / D3 in un rapporto di 1: 5 prima incubando con HBSS per 3 min senza Ca 2+ e Mg 2+ seguito dal distacco con 5 mL di trysina / EDTA (0,25%) per 5 min. Neutralizzare la tripsina usando EBM-2 completa (neutralizzazione 1: 1) e centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C; Scartare il surnatante. Riposizionare il pellet in EBM-2 completo e ri-piastra a rapporto 1: 5.
- Coltivare le pericie umane primarie e gli astrociti secondo il protocollo del fornitore [ Tabella dei Materiali ]. culturE le pericelle nel mezzo basico perlicente con supplemento di crescita FBS e pericita.
- Coltivare gli astrociti umani nel terreno astrocitico contenente fattori di crescita astrocitico. Coltivare sia le pericie che gli astrociti in flaconi di coltura tissutale rivestiti con 3 ml di poli-L-lisina (PLL) per l'adesione cellulare e utilizzare le cellule tra i passaggi 2 e 5.
- Eutanizzare 7 topi e rimuovere gli steli del cervello e la cerebella con le pinze; Staccare i meningi con un accurato spostamento dei cervelli sulla garza. Tritare il tessuto cerebrale rimanente in un piatto di Petri in Medium Minimal Essential (MEM) con HEPES (5 mL per cervello) con una lama di rasoio sterile. Isolare i topi primari del BEC da topi di 2 mesi C57BL / 6J secondo il protocollo di riferimento 20 .
- Trasferire il tessuto cerebrale macinato in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e incubare il tessuto in un papain (833,33 μL per cervello) e DNase (41,7 μL per cervello)Soluzione, in un bagno d'acqua di 37 ° C per 1 ora, per digerire il tessuto.
- Tritare l'omogenato in sequenza con aghi da 19 e 21, mescolare con un rapporto 1: 1 con una soluzione al 22% di Bovine Serum Albumin (BSA) e centrifugare a 1360 xg per 10 minuti a 4 ° C.
- Resuspendere il pellet risultante in 1 mL di EBM-2 e centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C. Riposizionare nuovamente in 1 mL di EBM-2 completare e piastrare le cellule (1 mL / pozzetto) su piastre a 6 pozzetti rivestite con collagene (~ 1 cervello per pozzetto).
- Sostituire il supporto 24 h più tardi con EBM-2 completo contenente 4 μg / mL puromicina cloridrato; Sostituire con EBM-2 completo dopo 2 giorni. I BEC primari sono coltivati come per le cellule hCMEC / D3 e sono in piena confluenza a 1 x 10 5 cellule / cm 2 .
- Preparare 100 μM di oAβ, 24 h prima del dosaggio.
NOTA: l'oAβ è considerata la forma di malattia di A. Per l'oAβ, utilizzare le preparazioni ben caratterizzate descritte da DahlgreN et al. 21 . - Scongelare la soluzione di base della membrana basale a 4 ° C e trasferire l'aliquota in strisce sterili PCR (8 tubi) a 140 μl di membrana basale per tubo. Riaffilare ogni striscia e conservare a -20 ° C. Sciogliere una striscia a 96 pozzetti a 4 ° C, 24 h prima del dosaggio. Pre-raffreddare le punte della pipetta per evitare la solidificazione.
NOTA: Tutto il trattamento della matrice della membrana basale deve essere effettuato su ghiaccio per evitare una rapida solidificazione. Poiché 10 μL per pozzetto di membrana basale viene utilizzato il giorno del dosaggio, ogni striscia è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti. - Incubare completamente confluenti BEC in EBM-2 basale, 24 h prima del dosaggio.
NOTA: La motivazione è: EBM-2 completo contiene fattori integrati e FBS allo scopo di promuovere la crescita cellulare ottimale; Tuttavia, gli stessi percorsi molecolari che promuovono la crescita cellulare sono importanti anche per la copertura e la dinamica delle cellule endoteliali del cervello, sia in presenza che in abseNce di uno stressore. Noi quindi il siero e il supplemento affamano i BEC per ridurre l'effetto confondente dell'attivazione residua di percorsi cellulari di segnalazione. Da notare, le cellule sono brevemente (5 min) esposte a FBS durante la neutralizzazione delle cellule trypsinizzate prima del dosaggio. In contrasto con i BEC, le pericie e gli astrociti non sono affamati dal siero, a causa del fabbisogno di diversi fattori di crescita e della relativa instabilità di questi tipi di cellule in risposta alla fame di siero (laboratorio Tai, osservazioni inedite).
NOTA: il basale EBM-2 è utilizzato durante il saggio per la formazione di singoli e triplici colture a maglia e le prove di interruzione. Questo è fondamentale per prevenire la confusione di stress o di trattamento che dipendono dal segnale.
2. Analisi di formattazione e di rottura di maglia
- Saggi di coltura singola BEC:
NOTA: tre diversi paradigmi per le singole culture di BEC sono mostrati in Figura 1A - Al giorno del dosaggio, pipettare la matrice della membrana basale a 10 μL / pozzetto nel fondo delle piastre a 96 pozzetti e lasciare impostare per 1 ora a 37 ° C.
- Sospendere il colorante liofilizzato di monitoraggio delle cellule verdi (vedere tabella dei materiali ) in 10 μL di DMSO per generare una soluzione di 10 mM stock e diluire a 10 μM (1: 1000) nel basale EBM-2. Rimuovere i supporti dal pallone completamente confluente e sostituirlo con basalto EBM-2 contenente il colorante verde di monitoraggio delle cellule (5 mL per un pallone da 75 cm 2 ). Preloadere BECs con il colorante verde di rilevamento delle cellule, 20 minuti prima dell'inizio del dosaggio.
- Incubare le cellule per 20-30 minuti a 37 ° C, rimuovere il mezzo con il colorante di monitoraggio delle cellule e staccare le cellule come descritto nel punto 1.1. Neutralizzare i supporti con EBM-2 contenente il 10% di FBS e centrifugare a 240 xg per 5 minuti a 4 ° C. Resuspendere il pellet in 1 mL di basale EBM-2.
- Piattare i BEC nella piastra a 96 pozzetti a 10.000 cellule / pozzetto nel basale EBM-2 (punto 0 h in tutti i paradigmi).
NOTA: A seconda del paradigma utilizzato, i trattamenti, gli stress oi controlli del veicolo vengono aggiunti nei punti di tempo specificati. In tutti i paradigmi, il mezzo viene raccolto per l'analisi successiva ( es. Analisi ELISA) e le cellule vengono fissate a 24 h con paraformaldehide appena preparato al 4% in fosforo bufferato (PBS). Come approccio alternativo per determinare gli effetti di termine di oAβ sulla formazione di maglie, il protocollo potrebbe essere modificato per pre-incubare le fiasche di coltura confluente con oAβ e quindi eseguire i paradigmi di formazione di maglie (+/- oAβ).
NOTA: Il volume finale in ogni pozzetto per tutti i paradigmi è 70 μL. Tutti i trattamenti (oAβ, EGF, ecc. ) Vengono aggiunti ai loro rispettivi pozzetti ad una diluizione 1:20, ovvero 3,5 μL per trattamento. Per il paradigma 1, le cellule vengono aggiunte in una soluzione di sospensione cellulare a 63 μL / well. Adesso vengono aggiunti oAβ, trattamenti e controlli desiderati a 3,5 μL / pozzetto ciascuno, dando un totale di 70 μL. Per il paradigma 2 vengono aggiunti 63 μL di sospensione cellulare e 3,5 μL di trattamento ( es. 100 ng / ml di EGF) al punto 0 h. Dopo 4 ore di incubazione, si aggiunge 3,5 μL di uno stock oAβ (per esempio per 100 nM di concentrazione finale oAβ, 3,5 μL di 2 μM di stock oAβ). Per il paradigma 3 si aggiunge 63 μL di sospensione cellulare al punto 0 h e a 4 h, oAβ e si aggiungono i trattamenti desiderati a 3,5 μL / pozzetto ciascuno, dando un totale di 70 μL. Questi volumi possono essere regolati secondo i trattamenti. Ad esempio, se è richiesto un solo trattamento, il volume della sospensione cellulare può essere regolato a 66,5 μL (mantenendo 10.000 cellule / pozzetto) e il volume di trattamento può rimanere a 3,5 μL.
NOTA: Oltre ai test di coltura singola di BEC, abbiamo sviluppato( Figura 1B ) per determinare la risposta di BECs, periciti e astrociti all'interno di reti preformate a fattori di pertinenza rilevanti ( es. OAβ). I BEC vengono placcati in presenza di trattamenti desiderati a 0 h. A 4 h, periciti vengono aggiunti dolcemente alla lastra. A 7 h, gli astrociti vengono aggiunti alla piastra, seguita dall'aggiunta di uno stressore a 11 h. Le cellule vengono quindi incubate fino al punto di 24 ore.
NOTA: Per i saggi di cultura tripla, è importante considerare i tempi per garantire che tutte le cellule siano confluenti allo stesso tempo. Gli astrociti umani e le pericelle devono essere coltivate 1 settimana prima del dosaggio, mentre le cellule hCMEC / D3 devono essere placcate o passate 4-5 giorni prima della data del dosaggio. Inoltre, è importante utilizzare celle primarie a basso passaggio (2-5) per evitare deriva fenotipica.
- Aggiungere la soluzione di lavoro per la tintura della cella a verde alle cellule hCMEC / D3 20 minuti prima di iniziare il test. Piattare le cellule hCMEC / D3 a 10, 000 cellule / pozzetto in EBM-2 basale (0 ora di ora). I volumi usati sono 45 μL di sospensione cellulare e 3,5 μL di trattamento ( cioè concentrazioni di EGF finali di 50 ng / ml, 100 ng / ml, o 1000 ng / ml da scorte che sono 20 volte più concentrate).
- Dopo l'incubazione a 37 ° C di 3,5 h, aggiungere alla pericia primaria umana la soluzione di lavoro per la tintura dei cavi blu (azoto blu di 10 μM nel basale EBM-2). Al punto di tempo di 4 h (~ 30 min di incubazione con il colorante di monitoraggio delle cellule) aggiungere delicatamente 2'000 periciti / pozzetto alla piastra contenente hCMEC / D3 in un volume di 6 μL / pozzetto.
- Dopo un'ulteriore 2,5 ore di incubazione (totale 6,5 h da 0 ora di ora), aggiungere gli astrociti primari umani alla soluzione di lavoro per la tintura della cellula arancione (10 μM tracker cellulare arancione in basale EBM-2). Al punto di 7 h aggiungete delicatamente 10.000 astrociti / pozzetto alla lastra in 12 μL di volume. Pertanto, il rapporto cellulare complessivo per le cellule endoteliali: periciti: astrociti iS 5: 1: 5. Inoltre, il volume raggiunto a questo punto è di 66,5 μL.
- Aggiungere oAβ (3,5 μL di stock di 100 μM) 4 h più tardi (11 ore totali da 0 ora).
- Fissare le cellule 13 h più tardi in paraformaldeide al 4% in PBS.
Attenzione: indossare indumenti protettivi, guanti e occhiali durante la manipolazione di paraformaldeide.
3. Quantificazione
- Cattura immagini di fluorescenza dell'intero pozzetto della piastra a 96 pozzetti ad ingrandimento 1,6X con un tempo di esposizione a 2 s al 50% di potenza massima utilizzando un microscopio di dissezione.
NOTA: possono essere utilizzati microscopi equivalenti; Tuttavia, è fondamentale catturare l'intero pozzo per un'analisi completa. - Per l'analisi quantitativa, elaborare le immagini usando il plugin 22 dell'analizzatore di angiogenesis ImageJ per quantificare il numero di rami, il numero di maglie e la lunghezza totale della cella (questi letture vengono automaticamente tabulati dalla softwaRi) come descritto di seguito. Un protocollo visivo dettagliato di questo passaggio è fornito in Figura 2 .
- Apri fiji ImageJ cliccando sull'icona del software.
- Clicca sulle doppie frecce rosse in avanti alla fine della barra degli strumenti, quindi fai clic su "Angiogenesis Analyzer".
- Seleziona la cartella con i file di immagine, fai clic su "Apri".
- Quando viene visualizzata la casella "impostazioni per l'analisi", fare clic su "OK".
- Quando viene visualizzata la casella "elaborazione immagini", che indica il numero di immagini da elaborare, fare clic su "OK".
- Quando viene visualizzata la casella "finestra di avanzamento batch", che indica il tempo di elaborazione stimato. Durante questo periodo il programma quantifica le uscite tra cui il numero di rami, il numero di maglie e la lunghezza totale della cella.
NOTA: Una volta che tutte le immagini vengono quantificate, il file dei risultati verrà visualizzato nella cartella dell'immagine originale come un documento di foglio di calcolo. - SelezionareIl foglio di foglio di calcolo che contiene i risultati e confronta il numero di rami, maglie e lunghezza totale delle celle tra i gruppi.
NOTA: Nel saggio di coltura triplo ImageJ viene ulteriormente utilizzato per analizzare la copertura e il numero di pericite / astrociti. Le immagini sono soggette a un esperimento acustico e la funzione "analisi delle particelle" utilizzata per generare letture. Le cellule fisse e le strutture tubolari possono anche essere immagazzinate per Aβ 17 o altri marcatori.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In singole colture, entrambe le cellule hCMEC / D3 ( Figura 3A ) e il BEC primario del mouse ( Figura 3B ) formano strutture a maglie simili a tutto il pozzo. Le strutture sono caratterizzate da un reticolo di nodi interconnessi ( Figura 3 ). In tutti i paradigmi descritti ( Figura 1 ), le strutture simili a maglie reticolari sono simili dopo 24 ore nei gruppi di controllo, formando ~ 20 strutture a maglia con una lunghezza totale cellulare di ~ 10.000 pixel.
Per evidenziare l'applicabilità dei metodi a fattori correlati alle malattie, l'oAβ è stato aggiunto alla hCMEC / D3 e ai primari BECs del mouse in due paradigmi. Nella disgregazione della formazione di maglie a cellule (Paradigma 1), l'oAβ e le cellule vengono placcate contemporaneamente. Nella rottura del reticolo preformato (Paradigma 2), l'oAβ è aggiuntoEd 4 h dopo la placcatura delle cellule (vedi Figura 1A ). L'oAβ a 100 nM induce una disgregazione della formazione e della degenerazione del reticolo di maglia ( Figura 3A , 3B ). Ad esempio, utilizzando le cellule hCMEC / D3 in entrambi i paradigmi, la quantificazione della copertura totale della cellula / lunghezza è inferiore del 16-20% con 100 nM oAβ 17 . Inoltre, il numero di maglie è ridotto del 40% con 100 nM oAβ in entrambi i paradigmi 17 . Pertanto, un fattore di pertinenza della malattia induce un effetto dannoso simile sulla copertura umana e sui topi BEC.
Un vantaggio fondamentale del sistema di coltura cellulare è la capacità di identificare fattori o trattamenti che prevengono danni rilevanti per la malattia, che possono quindi passare ai test in vivo . Come prova del principio sperimentale, gli effetti dei principali fattori di crescita angiogenici sulla prevenzione della cha indotta da oAβSono stati valutati i dati relativi alla copertura delle navi 17 . Il FEG ha impedito danni indotti da oAβ alle cellule hCMEC / D3. Sulla base di questi dati, EGF è stato testato in un paradigma di prevenzione utilizzando un modello di topi transgenici che ricapitola gli aspetti critici della patologia AD-like. Il trattamento con EGF ha impedito i deficit cognitivi e BBB, compresa la degenerazione dei vasi 23 . Questi dati supportano il potenziale predittivo del sistema in vitro per l' attività in vivo . Attualmente, utilizziamo tutti e tre i paradigmi sviluppati per lo screening: 1) formazione di maglie, 2) prevenzione della rottura del tessuto cellulare e 3) trattamento simultaneo della rottura di maglie. Come evidenziato nella figura 3 , EGF può proteggere dai danni indotti da oAβ in colture immortali e primarie di topo BEC.
Il BBB è costituito da BEC, periciti e astrociti che contribuiscono collettivamente al cerebrovasc complessivoCopertura ular. Pertanto, un adattamento del sistema in vitro è l'incorporazione di tutti e tre i tipi di cellule BBB. Il nostro paradigma di dosaggio della coltura tripla comprende le cellule hCMEC / D3, le pericie umane primarie e gli astrociti umani primari, che vengono aggiunti sequenzialmente alla matrice della membrana basale ( Figura 1B ). Nel paradigma del saggio di coltura tripolare, le cellule hCMEC / D3 formano un reticolo simile a quello delle singole colture, ma con le pericie e gli astrociti attaccati ai nodi e ai rami di connessione ( Figura 4 ). L'aggiunta di 100 nM oAβ induce la disfunzione di rete (~ 10-15%) e una riduzione del numero di periciti che contattano i BEC 17 . In correlazione con i dati derivati dai paradigmi di analisi della coltura singola, il danno indotto da oAβ è impedito dal trattamento EGF. Pertanto, il modello BBB tripla coltura è adatto per gli studi incentrati sugli effetti interattivi degli astrociti, periciE BEC sulle dinamiche dei recipienti.
Figura 1: Panoramica dei test di formazione di meshwork e di interruzione. ( A ) I paradigmi di analisi della coltura singola. Paradigma 1, formazione di maglie. Le cellule, gli stress e i trattamenti sono tutti aggiunti alla lastra al punto di 0 h. Paradigma 2, prevenzione della rottura del lavoro di rete. Le cellule vengono placcate in presenza di trattamenti desiderati, incubati per 4 h e uno stressor viene aggiunto al punto di 4 h. Paradigma 3, trattamento simultaneo della rottura del meshwork. Le cellule sono placcate e consentite di formare strutture simili a maglia per 4 ore prima che i trattamenti e / o gli stressori siano aggiunti contemporaneamente al punto di 4 h. Tutti i paradigmi terminano al punto di 24 h, e le cellule sono fissate con 4% di paraformaldeide. ( B ) Paradigma del saggio di coltura tripla. BECs (10.000 cellule / pozzetto) sono placcati nel presDi trattamenti desiderati a 0 h. Al punto di 4 h le pericelle (2.000 cellule / pozzetto) vengono aggiunte delicatamente alla piastra. A 7 ore astrociti (10.000 cellule / pozzetto) vengono aggiunti alla piastra, seguita dall'aggiunta di stressori pertinenti a 11 h. Le cellule vengono quindi incubate fino al punto di 24 h e fissate con 4% di paraformaldeide. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi quantitativa. Tutte le immagini vengono aperte in Fiji ImageJ e elaborate in batch utilizzando l'Analizzatore Angiogenesis 22 . Sono utilizzati quantificazione della lunghezza totale e del numero di maglie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di tLa sua figura.
Figura 3: Analisi di disfunzione di maglie: immagini rappresentative. Tutte le immagini sono ricavate da esperimenti che utilizzano Paradigm 2, interruzione di meshwork. ( A ) Immagini rappresentative delle cellule hCMEC / D3 placcate e trattate con controllo del veicolo (VC), EGF (100 nM), oAβ (100 nM) o oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Immagini a ingrandimento 10X, barra di scala = 100 μm. ( B ) Immagini rappresentative del mouse primario BEC placcate e trattate con VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) o oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Immagini a ingrandimento 10X, verde = BECs, barra di scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Test di coltura tripla: immagini rappresentative. ( A ) Le immagini rappresentative delle cellule hCMEC / D3, periciti primarie umane e astrociti umani primari placcati e trattati con VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) o oAβ (100 nM) + EGF (100 nM) Secondo il paradigma descritto nella Figura 1B . Immagini a 10x ingrandimento, verde = BECs, blu = pericytes, e rosso (pseudocolore) = astrociti. Barra di scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I metodi descritti possono essere utilizzati per affrontare diverse questioni biologiche fondamentali che riguardano la copertura cerebrovascolare24. In particolare, essi possono identificare quali recettori e vie di segnalazione svolgono un ruolo in angiogenesi, la copertura dei recipienti nei tessuti del cancro e cellule endoteliali periferiche rilevanti per il cervello. Gli esempi includono i recettori del fattore di crescita angiogenico, l'ossido nitrico, la mitogen attivata dalla proteina chinasi e la segnalazione di calcio 25 , 26 , 27 . Gli hCMEC / D3 ei BEC primari sono modificabili agli approcci genetici di abbandono per facilitare questo sforzo 18 . L'intuizione meccanica può essere ottenuta dalla coltura di BEC isolati da topi con completa o endoteliale specifiche delle cellule specifiche di proteine chiave con i metodi descritti. Inoltre, i test a tre colture consentono un'analisi approfondita dell'influenza astrocitica e pericicaE sulla funzione delle cellule endoteliali del cervello. Ad esempio, le pericie e gli astrociti possono influenzare la formazione di nidiformi come la formazione di mediatori solubili ( ad es. Angiopoietina, citochine) e anche attraverso il supporto strutturale 24 .
Il sistema modello può essere applicato anche alla ricerca delle malattie. Ad esempio, il sistema può affrontare se gli stressi relativi alla malattia e all'invecchiamento aggiungono esogeniamente l'angiogenesi e / o la rottura del lavoro di rete. Gli stress possono essere rilevanti per un disturbo specifico, ad esempio oAβ, o più generalizzato, ad esempio perossido di idrogeno, citochine. Il paradigma della cultura tripla aggiunge un ulteriore livello di complessità che può migliorare la comprensione di meccanismi critici e rilevanti per la malattia che influenzano la dinamica di BBB: delineare se gli stressi relativi alla malattia attivino astrociti e periciti per disturbare la funzione BEC. Per i coltura singola e tripla coltura, le cellule primarie possono essere isolate da froM modelli di mouse che imitano disordini di interesse per delineare ulteriormente gli effetti funzionali.
Ci sono una serie di considerazioni importanti per l'adattamento dei test di formazione e di interruzione di tipo meshwork a tipi diversi di cellule. La prima è la densità di semina. Per ogni nuova linea cellulare, un primo passo critico sta ottimizzando la densità di semina nella matrice della membrana basale sia per i singoli che per i tripli di coltura. La formazione di maglie è dipendente dal numero di cellule, poiché sia troppo elevata che troppo bassa la densità delle cellule provoca una mancanza di formazione di maglie. Inoltre, anche per i metodi e le celle qui descritte, è prudente effettuare confronti di densità cellulare per tenere conto di eventuali variazioni di laboratorio nell'elaborazione delle cellule prima di condurre esperimenti su larga scala. La seconda considerazione è la sequenza temporale della formazione di maglie. Devono essere condotti esperimenti del corso di tempo per identificare quando si formano e degradano strutture di tipo "meshwork". Tipicamente un robusto mesh-lLa formazione ike viene osservata a ~ 4 h. La terza considerazione è la scelta del mezzo prima della semina e durante l'esperimento. BECs, periciti e astrociti vengono coltivati in mezzo che contiene FBS e una pletora di fattori di crescita ottimizzati per la crescita cellulare. Anche se è preferibile affinchè il fattore di siero e di crescita affligge i BEC 24 h prima dell'esperimento, per alcuni tipi di cellule questo non può essere fattibile. Ad esempio, le cellule primarie con reclami specifici del recettore potrebbero richiedere fattori aggiuntivi per facilitare la crescita. Queste considerazioni si applicano anche durante l'esperimento e la scelta del mezzo dipende dalla specifica domanda in esame. Tuttavia, quando si esamina il ruolo di fattori di stress esogeni e di potenziali trattamenti, in particolare fattori di crescita o composti connessi, l'utilizzo di mezzi serici e di fattore di crescita durante l'esperimento è l'ideale. Inoltre, può essere possibile ridurre la lunghezza della fame di siero dei BEC, ma ciò dipende dal sig.In corso di indagine. Una quarta considerazione è la tempistica di aggiungere stress o trattamenti. Per quanto riguarda la scelta del trattamento medico, i tempi si basano sulla questione scientifica. Il test di formazione di maglie è più analogo all'angiogenesi, mentre il test di interruzione del magnesio può essere più rilevante per un BBB maturo. Nella nostra esperienza, una volta stabilita, i dosaggi producono dati coerenti tra esperimenti. I problemi di coerenza sono spesso dovuti a discrepanze di densità di sopravvivenza tra il personale e, soprattutto, se i componenti del reagente medio o rilevante sono alterati inconsapevolmente.
Ci sono limitazioni e aree di ulteriore sviluppo dei metodi descritti. Una forza di questa procedura è che basse concentrazioni di stressore ( ossia oAβ) possono essere utilizzate per indurre la rottura di maglie, cioè nM rispetto a μM, che sono più fisiologicamente rilevanti. Tuttavia, questa forza può anche essere una limitazione. Infatti, più in alto, bNon ancora tossiche, possono essere necessarie concentrazioni di oAβ per scopi di screening dei farmaci per aumentare la sensibilità, che si applicherà ad altri fattori di rischio per le malattie. Una limitazione del metodo è che il lavoro a maglie delle cellule è stabile solo per 24 ore nei protocolli descritti. Infatti, dopo 24 ore, le cellule delle cellule iniziano a degenerarsi. Pertanto aggiungiamo oAβ dopo un tempo relativamente breve (4 h) dopo la formazione di maglie, per consentire un tempo totale di incubazione di oAβ di 18 h. Forse le densità di sementi inferiori delle cellule potrebbero consentire protocolli di trattamento più lunghi. Un'ulteriore limitazione potenziale è che il sistema in vitro non può imitare un funzionamento a maglie stabili di cellule come sarebbe stato osservato in vivo . L'isolamento delle cellule da topi invecchiati può simulare più da vicino lo scenario in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Leon Tai è finanziato da fondi d'avvio di Chicago University of Illinois.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
