Padronização bioativas proteínas ou peptídeos em hidrogel usando fotoquímica para aplicações biológicas

O objetivo geral desta metodologia é criar padrões de proteínas espaciais bioativas imobilizadas que sejam usadas para estudar as respostas celulares. Este método permite a recapitulação de sinais in vivo usando estratégias de biomateriais. Essa técnica permite a imitação precisa de certos motivos de sinalização que não podem ser alcançados usando métodos de cultura padrão, como fatores de crescimento sequenciais, sinalização de células celulares e pistas bioquímicas espaciais específicas.

Este protocolo é significativo para os métodos existentes, pois fornece um método simplista para ajustar a rigidez do substrato e o padrão de proteína. Embora esse método possa promover as tecnologias de engenharia de tecidos e medicina regenerativa, ele também pode ser aplicado para estudar outros sistemas, como desenvolvimento de tecidos e destino de células-tronco. Para começar, prepare soluções de estoque para o principal componente do hidrogel, diacrilato de polietilenoglicol, o fotoiniciador, fenil-2 de lítio, 4, 6-trimetilbenzoilfosfinato e a proteína ECM, fibronectina, sob condições estéreis, conforme descrito no protocolo de texto anexo.

Filtre e esterilize cada solução usando um filtro de seringa de 0,22 mícron antes de usar ou armazenar as alíquotas individuais. Em seguida, embrulhe a solução PEG-DA com papel alumínio para protegê-la da luz. Embrulhe a solução de estoque do fotoiniciador em papel alumínio para protegê-la da luz e armazene a solução preparada a quatro graus Celsius por vários meses.

Se a solução estoque de fibronectina estiver congelada, deixe a alíquota estéril descongelar no gelo por várias horas ou em quatro graus Celsius durante a noite. Comece autoclavando uma folha de poliéster para cada molde de gel. Em seguida, mergulhe duas lâminas de vidro em três espaçadores de plástico para cada molde de gel em etanol a 70% por pelo menos duas horas.

Além disso, mergulhe cinco clipes de aglutinante para cada molde de gel em etanol a 70% por 10 minutos. Coloque as lâminas de vidro, espaçadores e clipes de fichário em uma pequena folha de autoclave na capa de cultura de células para permitir que sequem ao ar por várias horas. Em seguida, prepare os moldes de hidrogel colocando os espaçadores de plástico de 0,5 milímetro de espessura ao redor da borda de uma lâmina de vidro.

Coloque a segunda lâmina de vidro por cima e, em seguida, prenda os espaçadores firmemente um ao lado do outro com clipes de fichário. Por fim, esterilize o molde na superfície colocando-o no capô e acendendo a luz ultravioleta por 30 minutos antes do uso. No meio do processo de esterilização, vire o molde para ser mais fácil para expor ambas as superfícies.

Crie as soluções precursoras de gel conforme descrito na tabela um do protocolo de texto que acompanha. Em seguida, misture os volumes PEG-DA, fibronectina e fotoiniciador para criar o hidrogel. Pipete a solução vigorosamente para garantir uma solução homogênea, mas evite criar bolhas.

Pipete cuidadosamente a solução precursora de gel entre as duas lâminas de vidro do molde de gel. Em seguida, coloque o molde sob uma luz ultravioleta e exponha-o por um a dois minutos para formar o hidrogel. Depois de gelificado, retire os clipes de fichário e remova suavemente a corrediça de vidro superior aplicando pressão oposta aos dois espaçadores laterais.

Em seguida, usando um punção de biópsia de tamanho apropriado para cortar as amostras de hidrogel. Perfure vários hidrogéis do retângulo de gel para servir como réplicas e amostras de controle. Esterilize a máscara fotográfica mergulhando-a em etanol a 70% por 10 minutos.

Em seguida, deixe a máscara fotográfica secar ao ar em uma capa de cultura de células. Em seguida, pipete de um a dois microlitros por centímetro quadrado de uma solução de proteína tiolada para a superfície de cada hidrogel cortado para padronização da superfície. É importante espalhar a solução proteica pela superfície do hidrogel uniformemente para garantir uma imobilização uniforme da proteína.

Coloque cuidadosamente a máscara fotográfica na superfície do hidrogel. Pressione suavemente a máscara para remover quaisquer bolhas que se formem entre a máscara e a superfície do hidrogel. Em seguida, coloque o hidrogel sob a luz UV e exponha-o a uma segunda rodada de luz UV por 30 a 60 segundos.

Lave os hidrogéis com PBS para remover quaisquer espécies que não tenham reagido e coloque cada hidrogel dentro da placa do poço de forma que a superfície do padrão fique voltada para cima. Em seguida, lave os géis durante a noite em PBS a quatro graus Celsius. Remova o PBS dos poços e, em seguida, adicione 250 microlitros de EGM2 basal em cada poço e incube os géis por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius.

Durante a incubação, a tripsina digere uma placa de HUVECs quase confluentes em uma única suspensão celular usando técnicas padrão. Em seguida, gire a suspensão celular e remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular e o EGM2 basal sem adição de fatores de crescimento e adicione um pouco da suspensão celular a um hemocitômetro.

Conte as células para determinar a concentração. Em seguida, gire para baixo a placa contendo hidrogéis a 300 x G por três minutos, para garantir que os hidrogéis estejam localizados no fundo do poço e não flutuem. É fundamental que os hidrogéis não flutuem dentro dos poços.

Os hidrogéis flutuantes limitarão o sucesso na semeadura celular e causarão problemas com a imagem do hidrogel. Pipete lentamente 75.000 células por centímetro quadrado no centro de cada superfície de hidrogel para não perturbar os géis. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius.

Por vários dias, remova periodicamente o prato para observar a migração celular em resposta ao padrão de proteína. Troque 50% da mídia a cada dois ou três dias. Ao formar os hidrogéis, várias concentrações de precursor de PEG-diacrilato podem ser usadas para produzir a rigidez desejada do substrato.

Mostrado aqui, a solução de 20% PEG-DA se correlaciona com a rigidez de mais de 100 quilopascais. Também é importante considerar a concentração do fotoiniciador e o tempo de exposição aos raios UV, pois um aumento em qualquer uma das variáveis diminuirá a bioatividade das moléculas ligadas, representada aqui pela bioatividade do lisossomo. Minimizar a exposição aos raios UV durante a formação do hidrogel é fundamental para manter os grupos funcionais de acrilato livre para reações subsequentes de imobilização de proteínas.

Os hidrogéis expostos à luz ultravioleta por mais de dois minutos são incapazes de criar padrões de proteínas imobilizadas mostrados em vermelho. Além disso, à medida que a exposição UV ao padrão de proteína aumenta, mais proteínas reagem à superfície. Quando preparadas corretamente, as células podem ser cultivadas nesses substratos de hidrogel padronizados para manipular seu comportamento.

Aqui, as células endoteliais foram semeadas uniformemente na superfície de hidrogéis de PEG padrão VEGF. Dois dias após a semeadura, observou-se que as células endoteliais migraram em direção às regiões espaciais do hidrogel que continham o VEGF imobilizado. Após o desenvolvimento deste protocolo, os pesquisadores podem usá-lo para imobilizar qualquer proteína ou peptídeo, a fim de explorar novas plataformas bioativas para sistemas celulares in vitro.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de minimizar a concentração do fotoiniciador e o tempo de exposição aos raios UV para manter a bioatividade das moléculas imobilizadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como padronizar proteínas e peptídeos bioativos em hidrogéis PEG, células de sementes uniformemente em hidrogéis e observar a resposta celular consequente.