Padronização bioativas proteínas ou peptídeos em hidrogel usando fotoquímica para aplicações biológicas

O objetivo geral desta metodologia é criar padrões espaciais de proteínas bioativas imobilizadas que possam ser usados para estudar respostas celulares. Este método permite a recapitulação de sinais in vivo por meio de estratégias com biomateriais. Esta técnica possibilita a reprodução precisa de certos motivos de sinalização que não podem ser alcançados com métodos padrão de cultivo celular, como fatores de crescimento sequenciais, sinalização entre células e sinais bioquímicos específicos espacialmente.

Este protocolo é significativo em comparação com os métodos existentes, pois fornece um método simplificado para ajustar a rigidez do substrato e o padrão de proteínas. Embora este método possa aprimorar as tecnologias de engenharia de tecidos e medicina regenerativa, ele também pode ser aplicado para estudar outros sistemas, como o desenvolvimento tecidual e o destino das células-tronco. Para começar, prepare soluções estoque para o componente principal do hidrogel, diacrilato de polietileno glicol, o iniciador fotográfico, fenil-lítio-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato, e a proteína da matriz extracelular, fibronectina, em condições estéreis, conforme descrito no protocolo textual complementar.

Filtre esterilize cada solução utilizando um filtro de seringa de 0,22 mícron antes de usar ou armazenar as alíquotas individuais. Em seguida, envolva a solução de PEG-DA com papel alumínio para protegê-la da luz. Envolva a solução estoque do iniciador fotossensível com papel alumínio para protegê-la da luz e armazene a solução preparada a quatro graus Celsius por até vários meses.

Se a solução estoque de fibronectina estiver congelada, deixe a alíquota estéril descongelar em gelo por várias horas ou a quatro graus Celsius durante a noite. Comece autoclavando uma folha de poliéster para cada molde de gel. Em seguida, mergulhe duas lâminas de vidro e três espaçadores plásticos para cada molde de gel em etanol 70% por pelo menos duas horas.

Adicionalmente, mergulhe cinco clipes de papel para cada molde de gel em etanol 70% durante 10 minutos. Coloque as lâminas de vidro, espaçadores e clipes de papel sobre uma folha pequena de autoclave na cabine de cultura celular para que sequem ao ar por várias horas. Em seguida, prepare os moldes de hidrogel posicionando espaçadores de plástico com espessura de 0,5 milímetro ao redor da borda de uma lâmina de vidro.

Coloque a segunda lâmina de vidro por cima e, em seguida, fixe os espaçadores firmemente um ao lado do outro com clipes de papel. Por fim, esterilize a superfície do molde colocando-o na câmara de fluxo laminar e ligando a luz ultravioleta por 30 minutos antes do uso. Na metade do processo de esterilização, vire o molde para garantir que ambas as superfícies sejam expostas.

Crie as soluções precursores do gel conforme descrito na tabela um do protocolo de texto acompanhante. Em seguida, misture os volumes de PEG-DA, fibronectina e fotoiniciador para criar o hidrogel. Pipete a solução vigorosamente para garantir uma solução homogênea, mas evite formar bolhas.

Pipete cuidadosamente a solução precursora do gel entre os dois lâminas de vidro do molde de gel. Em seguida, coloque o molde sob uma luz UV e exponha por um a dois minutos para formar o hidrogel. Após a gelificação, remova as grampos e retire suavemente a lâmina de vidro superior aplicando pressão oposta aos dois espaçadores laterais.

Em seguida, utilize um punch de biópsia de tamanho apropriado para recortar as amostras de hidrogel. Recorte múltiplos hidrogéis do retângulo de gel para servir como réplicas e amostras controle. Esterilize a máscara fotográfica mergulhando-a em etanol 70% por 10 minutos.

Em seguida, deixe a máscara fotográfica secar ao ar em uma cabine de cultura celular. Depois, pipete de um a dois microlitros por centímetro quadrado de uma solução de proteína tiolada sobre a superfície de cada hidrogel recortado para o confinamento superficial. É importante espalhar a solução de proteína uniformemente sobre a superfície do hidrogel para garantir a imobilização homogênea da proteína.

Coloque cuidadosamente a máscara fotográfica sobre a superfície do hidrogel. Pressione suavemente a máscara para remover quaisquer bolhas que se formem entre a máscara e a superfície do hidrogel. Em seguida, posicione o hidrogel sob a luz UV e exponha-o a uma segunda rodada de luz UV por 30 a 60 segundos.

Lave os hidrogéis com PBS para remover quaisquer espécies não reagidas e coloque cada hidrogel na placa de poços de modo que a superfície com o padrão fique voltada para cima. Em seguida, lave os géis durante a noite em PBS a quatro graus Celsius. Remova o PBS dos poços, então, adicione 250 microlitros de EGM2 basal em cada poço e incube os géis por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius.

Durante a incubação, digerir com tripsina uma placa de HUVECs quase confluente até obter uma suspensão de células individuais, utilizando técnicas padrão. Em seguida, centrifugar a suspensão celular e remover cuidadosamente o sobrenadante. Re-suspender o pellet celular em EGM2 basal sem fatores de crescimento adicionados e adicionar parte da suspensão celular a um hemocitômetro.

Conte as células para determinar a concentração. Em seguida, centrifugue a placa contendo os hidrogéis a 300 x G durante três minutos, para garantir que os hidrogéis estejam localizados no fundo do poço e não estejam flutuando. É fundamental que os hidrogéis não flutuem dentro dos poços.

Hidrogéis flutuantes limitarão o sucesso no semeadura celular e causarão problemas com a imagem dos hidrogéis. Pipete lentamente 75.000 células por centímetro quadrado no centro de cada superfície de hidrogel, de modo a não perturbar os géis. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius.

Por vários dias, remova periodicamente o recipiente para observar a migração celular em resposta ao padrão proteico. Troque 50% do meio a cada dois ou três dias. Ao formar os hidrogéis, várias concentrações do precursor PEG-diacrilato podem ser usadas para obter a rigidez desejada do substrato.

Aqui mostrado, a solução de PEG-DA a 20% correlaciona-se com a rigidez de mais de 100 quilopascals. Também é importante considerar tanto a concentração do fotoiniciador quanto o tempo de exposição à UV, pois o aumento em qualquer uma dessas variáveis reduzirá a bioatividade das moléculas ligadas, representada aqui pela bioatividade da lisozima. Minimizar a exposição à UV durante a formação do hidrogel é essencial para manter grupos funcionais acrilato livres para reações subsequentes de imobilização de proteínas.

Hidrogéis expostos à luz UV por mais de dois minutos são incapazes de criar padrões de proteínas imobilizadas mostrados em vermelho. Além disso, à medida que a exposição à luz UV no padrão de proteínas aumenta, mais proteínas reagem com a superfície. Quando preparados corretamente, as células podem ser cultivadas sobre esses substratos de hidrogel padronizados para manipular seu comportamento.

Aqui, as células endoteliais foram semeadas uniformemente sobre a superfície de hidrogéis de PEG com padrão de VEGF. Dois dias após a semeadura, observou-se que as células endoteliais migraram em direção às regiões espaciais do hidrogel que continham a VEGF imobilizada. Após o desenvolvimento deste protocolo, os pesquisadores podem utilizá-lo para imobilizar qualquer proteína ou peptídeo, a fim de explorar novas plataformas bioativas para sistemas celulares in vitro.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de minimizar a concentração do fotoiniciador e o tempo de exposição à luz UV para manter a bioatividade das moléculas imobilizadas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como padronizar proteínas e peptídeos bioativos em hidrogéis de PEG, semear células uniformemente nos hidrogéis e observar a resposta celular subsequente.