Vi beskriver en HPLC-baseret metode til bestemmelse af N-acetylneuraminsyre og N-glycolylenuraminsyre i muselever og mælk.
CMAH (cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsyrehydroxylase) er ansvarlig for oxidationen af cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsyrer i pattedyr. Imidlertid kan mennesker ikke oxidere cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsyre til cytidinmonophosphat-N-glycolylneuraminsyre på grund af en primær exon deletion af CMAH genet. For at forstå virkningerne og konsekvenserne af manglen på CMAH-aktivitet mere detaljeret er en Cmah- knock-out-model i mus en stor interesse for grundlæggende og anvendt forskning. Analysemetoden til bestemmelse af fænotypen af denne musemodel er her beskrevet detaljeret og er baseret på påvisningen af både N-acetylneuraminsyre og N-glycolylenuraminsyre i leveren og mælken af vildtype- og Cmah- knock-out-mus. Endogene sialinsyrer frigives og derivatiseres med o-phenylendiamin for at danne fluorogene derivater, der efterfølgende kan analyseres ved HPLC. Den præsenterede protokol kan væreOgså ansøgt om analyse af mælke- og vævsprøver fra forskellige andre oprindelser og kan være til nytte for at undersøge nærings- og sundhedsvirkningerne af N-glycolylneuraminsyre.
N-acetylneuraminsyre (Neu5Ac) og N-glycolylneuraminsyre (Neu5Gc) er de mest almindelige sialinsyrer i de fleste pattedyr 1 . Selvom det er i stand til at syntetisere Neu5Ac endogent, er mennesker ikke i stand til at producere Neu5Gc på grund af en primær exon deletion på CMAH genet kodende for en CMP-Neu5Ac hydroxylase 2 , 3 . Dogbaserede fødevarer kan være kostkilder til Neu5Gc 4 , 5 , 6 , der fører til produktion af anti-Neu5Gc-antistoffer og derfor udløse et immunrespons mod Neu5Gc 7 . Denne diæt effekt af Neu5Gc formodes at bidrage til kronisk inflammation og forskellige andre sygdomme 8 , 9 , 10 . For fuldt ud at forstå virkningerne af Neu5Gc i hUmans, er en dyremodel til systematisk undersøgelse af virkningerne af fødevarebårne sialinsyrer meget ønskelig. Selv om protokoller baseret på polymerasekædereaktion (PCR) til analyse af knock-out-mus er veletablerede og en bekvem måde til den genotype vurdering, kræver den funktionelle analyse af fænotype på metabolisk niveau mere specifikke analysemetoder. Fænotypen af en Cmah- knock-out-musemodel kan vurderes ved at isolere og analysere sammensætningen af sialinsyrer i lever- eller mælkeprøver. Der er tidligere rapporteret om forskellige metoder til påvisning af sialinsyrer i dyrevæv. Reaktion af sialinsyrer med resorcinol 11 eller thiobarbitursyre 12 resulterer i dannelsen af et kromoforisk produkt og kan simpelthen analyseres ved hjælp af en platereaderbaseret opsætning, men kun den samlede sialiske Syreindhold kan bestemmes. Alternativt blev analysen af sialinsyrer også beskrevet under anvendelse af gaskromatografi13 , MALDI-ToF-massespektrometri 14 eller amperometriske metoder 15 . De mest anvendte sialinsyreanalysemetoder er imidlertid baseret på hydrolytisk frigivelse efterfulgt af fluorescensderivatisering og efterfølgende højtryksvæskekromatografi 16 , 17 , 18 .
Den heri præsenterede protokol tillader den fænotypiske vurdering af homozygote Cmah- knock-out-mus ved analyse og kvantificering af de relative mængder af Neu5Gc af mælke- og leverprøver. Analysen blev udført under anvendelse af en standard HPLC opsætning med fluorescensdetektion. Det mest kritiske trin i denne fremgangsmåde er fremstillingen af anionbytterkolonnerne og udførelse af anionbytningskromatografi; At afsætte harpiksen ordentligt og at samle de rigtige vaske- og elueringsfraktioner t…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af Natural Science Foundation of China (tildelingsnumre 31471703, A0201300537 og 31671854 til JV og LL) og 100 Foreign Talents Plan (tildelingsnummer JSB2014012 til JV).
Chemicals: | |||
N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
Tools/Materials: | |||
3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200-400 mesh |
Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
HPLC Analysis: | |||
High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250×4.6 mm |
LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |