Dissecação da Retina humana e RPE coroide para análise proteômica

Resumo

A retina humana é composta de regiões funcionalmente e molecularmente distintas, incluindo a fóvea, mácula e retina periférica. Aqui, descrevemos um método usando o soco de biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano para dissecar e coletar estas regiões distintas da retina para análise proteômica a jusante.

Resumo

A retina humana é composta da neuroretina sensorial e o epitélio pigmentado da retina subjacente (RPE), que é complexado com firmeza à camada vascular da coroide. Diferentes regiões da retina são anatomicamente e molecularmente distintas, facilitando as funções originais e demonstrando o diferencial susceptibilidade à doença. Análise proteômica de cada uma destas regiões e camadas pode fornecer insights vitais sobre o processo molecular de muitas doenças, incluindo Age-Related Degeneração Macular (AMD), diabetes mellitus e glaucoma. No entanto, separação de camadas e regiões da retina é essencial antes de análise proteômica quantitativa pode ser realizado. Aqui, descrevemos um método para dissecção e coleção de regiões da retina central, periféricas e maculares e subjacentes RPE coroide complexo, envolvendo regional soco biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano. Unidimensional de SDS-PAGE, bem como análise de proteomic a jusante, tais como líquida espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS), pode ser usado para identificar proteínas em cada camada da retina dissecada, revelando moleculares biomarcadores para doenças da retina.

Introdução

A retina, RPE e coroide são tecidos complexos que demonstram diferenças regionais importantes na expressão de proteínas, função fisiológica e patológica suscetibilidades^1,2. Por exemplo, doenças como a Degeneração Macular Age-Related (AMD), retinite pigmentosa e retinopatia serosa central cada demonstram característica localização dentro da fóvea, mácula ou retina periferia^{1,3, 4,6}. Aqui, apresentamos um método demonstrando como distinta da retina regiões podem ser degustadas de for....

Protocolo

este estudo foi aprovado pela Universidade de Iowa ' s Conselho de revisão institucional e adere aos princípios estabelecidos na declaração de Helsinque.

1. Foveal e Macular soco biópsia

1. aberto e borboleta olho humano, que consiste em 4 diferentes retalhos de tecido, conforme descrito em uma publicação anterior. ⁵
2. começando com um borboleta olho humano colocado em uma placa de Petri, centralize uma ferramenta de biópsia do perfurador de 4 mm sobre a fóvea, pressione para baixo e role suavemente até que uma incisão é feita ao redor da fóvea.
3. Em seguida, gerar uma incisão ao redor da....

Resultados

Tecido de RPE coroide e da retina podem ser processadas de várias maneiras, de acordo com uma investigação individual. Após a coleta, o pesquisador possuirá amostras da retina e RPE coroide tecido da região central, exterior mácula e retina periférica (Figura 1). Especificamente, o soco de região central incluirá a fóvea, o parafovea e uma pequena quantidade do perifovea adjacente. O soco macular inclui o restante da região perifoveal, bem como uma pequena qu.......

Discussão

Depois de tecido recolha, manipulação de amostra e tratamento são cruciais considerações¹⁴. Preservação em nitrogênio líquido é preferida por fixação química, como o último pode resultar em danos à estrutura da proteína, que pode distorcer a análise a jusante. Além disso, a preservação de nitrogênio líquido é preferencial para métodos que não envolvem o congelamento de amostras. Notavelmente, Ferrer et al mostraram diferenças significativas nos níveis de proteína entre amostras de cérebro.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ferramenta de biópsia por punção cutânea de 4 mm	Miltex	REF 33-34
Ferramenta de biópsia por punção cutânea de 8 mm	Miltex	REF 33-37
0.12 Pinça Colibri	Stephens Instruments	S5-1145
Tesoura Wescott	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Tubos de microfuga	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Nitrogênio Líquido	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]