Avaliação das propriedades das células endoteliais utilizando cultura de células 3D e sangue não anticoagulado anticoagulantes e anti-inflamatório

Riccardo Sfriso; Anjan Bongoni; Yara Banz; Nikolai Klymiuk; Eckhard Wolf; Robert Rieben

doi:10.3791/56227

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Avaliação das propriedades das células endoteliais utilizando cultura de células 3D e sangue não anticoagulado anticoagulantes e anti-inflamatório

8K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/56227

⸱

5 de setembro de 2017

Riccardo Sfriso¹^,² , Anjan Bongoni³ , Yara Banz⁴ , Nikolai Klymiuk⁵ , Eckhard Wolf⁵ , Robert Rieben¹

¹Department of Clinical Research, University of Bern, ²Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern, ³Immunology Research Centre, St. Vincent's Hospital Melbourne, ⁴Institute of Pathology, University of Bern, ⁵Institute of Molecular Animal Breeding and Biotechnology, Ludwig-Maximilian University

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um modelo in vitro que permite o estudo e a análise de coagulação em inteiro, sangue não anticoagulado. Anticoagulação no sistema depende do efeito anticoagulante natural das células endoteliais saudáveis e ativação de células endoteliais resultará na coagulação.

Resumo

In vivo, as células endoteliais são cruciais para a anticoagulação natural de sangue em circulação. Consequentemente, ativação de células endoteliais leva a coagulação do sangue. Este fenômeno é observado em muitas situações clínicas, como a transplantação de órgãos, na presença de pré-formado anticorpos antidoadores, incluindo Xenoenxerto, bem como na lesão de isquemia/reperfusão. A fim de reduzir a experimentação animal de acordo com as 3R padrões (redução, substituição e refinamento), em vitro modelos para estudar o efeito da célula endotelial, ativação na coagulação do sangue seria altamente desejável. No entanto, os sistemas comuns do leito de cultura de células endoteliais fornecem uma relação superfície-volume 1-5 cm² do endotélio por mL de sangue, que não é suficiente para anticoagulação natural, endotelial mediada. Cultivo de células endoteliais em grânulos de microcarrier pode aumentar a proporção de superfície e o volume de 40-160 cm²/mL. Esta proporção de aumentada é suficiente para garantir a anticoagulação "natural" de sangue, para que o uso de anticoagulantes pode ser evitado. Aqui um em vitro microcarrier sistema é descrito para estudar os efeitos da modificação genética das células endoteliais dos suínos na coagulação do sangue humano de todo, não-anticoagulado. No ensaio descrito, principais células endoteliais aórtica porcinos, ou tipo selvagem (WT) ou transgénicos para humanos CD46 e trombomodulina, foram cultivadas em grânulos microcarrier e então exposto ao sangue humano recentemente colhida não-anticoagulado. Este modelo permite a medição e quantificação da liberação de citocinas, bem como ativação marcadores de complemento e da coagulação no plasma sanguíneo. Além disso, proteínas de complemento e da coagulação em grânulos endotelializados imagem de células endoteliais ativadas e deposição de imunoglobulinas, foram realizadas por microscopia confocal. Este ensaio também pode ser usado para testar medicamentos que servem para prevenir a coagulação e, assim, a ativação de células endoteliais. Em cima de seu potencial para reduzir o número de animais utilizados para tais investigações, o ensaio descrito é consistentemente reprodutível e fácil de executar.

Introdução

O endotélio vascular é composto por uma monocamada de células endoteliais (CE), que linha o lúmen dos vasos sanguíneos. Em um estado fisiológico, quiescente CE são responsáveis para a manutenção de um ambiente anti-inflamatória e anticoagulante. ¹ isso é mediado pela expressão de anticoagulante e anti-inflamatório proteínas na superfície do CE. Por exemplo, ativação de CE causada por isquemia/reperfusão lesão ou rejeição vascular (xeno-) transplantado resultados de órgãos em uma mudança da superfície endotelial de um anticoagulante e anti-inflamatório estado a um pro-coagulantes e pro-inflamatórios Estado. ¹