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Artigo de método

Avaliação das propriedades das células endoteliais utilizando cultura de células 3D e sangue não anticoagulado anticoagulantes e anti-inflamatório

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DOI:

10.3791/56227

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5 de setembro de 2017

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1Department of Clinical Research, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern, 3Immunology Research Centre, St. Vincent's Hospital Melbourne, 4Institute of Pathology, University of Bern, 5Institute of Molecular Animal Breeding and Biotechnology, Ludwig-Maximilian University

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um modelo in vitro que permite o estudo e a análise de coagulação em inteiro, sangue não anticoagulado. Anticoagulação no sistema depende do efeito anticoagulante natural das células endoteliais saudáveis e ativação de células endoteliais resultará na coagulação.

Resumo

In vivo, as células endoteliais são cruciais para a anticoagulação natural de sangue em circulação. Consequentemente, ativação de células endoteliais leva a coagulação do sangue. Este fenômeno é observado em muitas situações clínicas, como a transplantação de órgãos, na presença de pré-formado anticorpos antidoadores, incluindo Xenoenxerto, bem como na lesão de isquemia/reperfusão. A fim de reduzir a experimentação animal de acordo com as 3R padrões (redução, substituição e refinamento), em vitro modelos para estudar o efeito da célula endotelial, ativação na coagulação do sangue seria altamente desejável. No entanto, os sistemas comuns do leito de cultura de células endoteliais fornecem uma relação superfície-volume 1-5 cm2 do endotélio por mL de sangue, que não é suficiente para anticoagulação natural, endotelial mediada. Cultivo de células endoteliais em grânulos de microcarrier pode aumentar a proporção de superfície e o volume de 40-160 cm2/mL. Esta proporção de aumentada é suficiente para garantir a anticoagulação "natural" de sangue, para que o uso de anticoagulantes pode ser evitado. Aqui um em vitro microcarrier sistema é descrito para estudar os efeitos da modificação genética das células endoteliais dos suínos na coagulação do sangue humano de todo, não-anticoagulado. No ensaio descrito, principais células endoteliais aórtica porcinos, ou tipo selvagem (WT) ou transgénicos para humanos CD46 e trombomodulina, foram cultivadas em grânulos microcarrier e então exposto ao sangue humano recentemente colhida não-anticoagulado. Este modelo permite a medição e quantificação da liberação de citocinas, bem como ativação marcadores de complemento e da coagulação no plasma sanguíneo. Além disso, proteínas de complemento e da coagulação em grânulos endotelializados imagem de células endoteliais ativadas e deposição de imunoglobulinas, foram realizadas por microscopia confocal. Este ensaio também pode ser usado para testar medicamentos que servem para prevenir a coagulação e, assim, a ativação de células endoteliais. Em cima de seu potencial para reduzir o número de animais utilizados para tais investigações, o ensaio descrito é consistentemente reprodutível e fácil de executar.

Introdução

O endotélio vascular é composto por uma monocamada de células endoteliais (CE), que linha o lúmen dos vasos sanguíneos. Em um estado fisiológico, quiescente CE são responsáveis para a manutenção de um ambiente anti-inflamatória e anticoagulante. 1 isso é mediado pela expressão de anticoagulante e anti-inflamatório proteínas na superfície do CE. Por exemplo, ativação de CE causada por isquemia/reperfusão lesão ou rejeição vascular (xeno-) transplantado resultados de órgãos em uma mudança da superfície endotelial de um anticoagulante e anti-inflamatório estado a um pro-coagulantes e pro-inflamatórios Estado. 1

Para estudar a interação entre os endotélio e coagulação fatores, em vitro modelos que imitam como fascinante e complexa quanto possível a situação no vivo são altamente desejáveis. Uma limitação comum que caracteriza convencional em vitro ensaios de coagulação é o uso do sangue total anticoagulado que faz a análise dos efeitos mediados por coagulação árdua e recalcificação mesmo de sangue citratado não pode se reproduzir. resultados obtidos com sangue fresco não-anticoagulado. 2 além disso, em sistemas de cultura de células de leito tradicional é impossível para explorar as propriedades anticoagulantes do endotélio como uma superfície de células endoteliais suficiente por volume de sangue não pode ser alcançada. O modelo apresentado aqui supera estas limitações por cultivo CE na superfície dos grânulos esféricos microcarrier, para que uma relação de superfície-para-sangue de CE de > 16cm2/mL pode ser alcançado, que é semelhante à situação em pequenas arteríolas ou veias, e que foi descrito para ser suficientes para permitir anticoagulação "natural" do sangue pela superfície de CE. 3 , 4 o sangue total pode ser usado sem anticoagulantes adicionados neste cenário. Amostras de sangue podem ser coletadas durante o experimento e citocinas, fatores de coagulação e marcadores de ativação do complemento solúvel podem ser detectados e quantificados. Além disso, microcarrier CE-revestido grânulos podem ser analisados para deposição de complemento e imunoglobulina, bem como a expressão de marcadores de ativação de CE por microscopia confocal. Outra interessante aplicação inclui os testes de drogas que deveriam para prevenir a coagulação e, assim, a ativação de células endoteliais. 5 apesar deste modelo não pode substituir completamente a experimentação animal, oferece um método para testar hipóteses funcionais específicas ex vivo usando células e, assim, reduzir o número de animais utilizados em pesquisa básica na isquemia/reperfusão transplante de lesão ou (xeno).

O modelo descrito foi usado para imitar um Xenoenxerto definindo em quais células endoteliais aórtica porcinos (PAEC) são cultivadas em grânulos microcarrier e incubadas com inteiros, não-anticoagulado sangue humano. Diferente transgênico PAEC, carregando vários genes humanos tais como CD46 para a regulação do sistema complemento e/ou trombomodulina (hTBM) para a regulação do sistema de coagulação, analisaram-se por suas propriedades anticoagulantes. Sistemas de coagulação, complemento e ativação de células endoteliais são rigidamente controlados e interligados. 6 portanto, é importante compreender como as diferentes células transgênicas se comportar após a exposição ao sangue humano, no que respeita à expressão da molécula de adesão e liberação de citocinas, derramamento do glicocálix e perda de proteínas anticoagulantes. 7

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Protocolo

alemão Landrace suínos (tipo selvagem transgénico e criado em uma fazenda local criado no Instituto de reprodução do Animal Molecular e biotecnologia, Universidade Ludwig-Maximilian, de Munique, Alemanha), pesando entre 30 kg a 40 kg, foram utilizados em Este estudo. Todos os animais estavam alojados em condições padrão com água e comida ad lib. Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com o ato de animais do Reino Unido (procedimentos científicos) e o guia de NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório, bem como a lei de proteção animal suíço. Todos os estudos animais respeitadas as orientações de chegada. A Comissão de experimentação animal do serviço veterinário cantonal (cantão de Berna, na Suíça) aprovou todos os procedimentos de animais, permissão não. BE70/14. Protocolos experimentais foram refinados de acordo com os princípios 3R e estado-da-arte anestesia e tratamento da dor foram usados para minimizar o número de animais e reduzir a exposição dos animais ao estresse e dor durante as experiências.

sangue de indivíduos saudáveis foi retirado por punção venosa de sistema fechado de acordo com orientações suíço de competência e ética do Hospital da Universidade de Berna. A frase " sangue anticoagulado não " significa que o sangue não tem sido tratado com qualquer anticoagulante.

as seguintes etapas são executadas sob condições estéreis. Familiaridade com técnica estéril de cultura de célula básica é necessária.

1. isolamento de PAEC

Nota: segmentos da aorta torácica de 6 a 10 cm foram obtidos de eutanásia de porcos Landrace alemão de 3 a 6 meses de idade (usado para outras experiências na vivo) e imediatamente transferidos para um frasco de vidro de 500 mL contendo meio de transporte (DMEM + 1% penicilina/estreptomicina).

  1. Pre-revestir uma placa de 6 com fibronectina 12,5 µ g/mL em PBS 1 x e colocá-lo em uma incubadora a 37 ° C por 1 h.
  2. Pré-aquecer o PBS estéril 1 x e célula cultura médio (DMEM).
  3. Tirar a aorta porcina de meio de transporte.
  4. Coloque a aorta em uma placa de poliestireno.
  5. Flush com PBS morna suavemente antemão.
  6. Cortar a aorta longitudinalmente e corrigi-lo com agulhas.
  7. Adicionar o meio de cultura celular quente na superfície interna da embarcação.
  8. Aspire o meio de cultura celular de fibronectina e adicionar o meio de cultura de células frescas (DMEM suplementado com 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina e 0,4% de crescimento de célula endotelial médio suplemento Mix).
  9. Embeber um cotonete em meio de cultura celular. Esfregue o broto de algodão no topo da superfície interna da embarcação suavemente e lentamente na mesma direção.
  10. Esfregar as células em um poço da placa de 6 rodada por rodada.
  11. Fazer o mesmo para o resto dos poços.
  12. Ver as células sob o microscópio e coloque a placa de 6-poços em incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2.
  13. Mudar o meio no segundo dia e alterá-lo novamente a cada 2-3 dias.
  14. Quando as células vão ser confluentes, trypsinize células e semente-los num balão T75 (PAEC P1).

2. Caracterização do PAEC

  1. pre-revestir uma chamberslide de 8 poços com fibronectina 12,5 µ g/mL em PBS 1 x e colocá-lo em uma incubadora a 37 ° C por 1 h.
  2. Sementes de 5 x 10 4 células/poço e incubar durante uma noite na incubadora a 37 ° C.
  3. Lavar as células duas vezes com PBS + + (PBS suplementado com CaCl 2 e MgCl 2), 300 μL/poço.
  4. Corrigir células com paraformaldeído 3,7% durante 10 minutos à temperatura ambiente, 200 μL/poço.
  5. Lavar as células 3 vezes com PBS + +, 300 μL/poço.
  6. Adicionar 300 µ l de PBS 1 x-3_% BSA (tampão de bloqueio) e deixe 30 min à temperatura ambiente.
  7. Aplicam-se os anticorpos primários (anti-VE-caderina, anti-CD31, anti-vWF) diluídos em detergente 1x-1%BSA-0.05% de PBS, 160 μL/poço e incube por 1h à temperatura ambiente.
  8. Lavar 3 vezes com PBS + + (200 μL/poço).
  9. Aplicar anticorpos secundários e DAPI diluído em detergente 1x-1%BSA-0.05% de PBS, 160 μL/poço e incube por 1h à temperatura ambiente.
  10. Lavar 3 vezes com PBS + + (200 μL/poço).
  11. Montar slides com meio de montagem com base de glicerol e verifique se a expressão de marcadores de células endoteliais sob um microscópio de fluorescência.
    Nota: Cultura porcina aórtica as células endoteliais num balão de T175 (DMEM baixa glicose médio + 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina e 0,4% de crescimento de célula endotelial médio suplemento Mix) até 90% de confluência é alcançado. (semeadura 6 células de densidade 1 x 10, 90% confluência correspondem aproximadamente a 5 x 10 6 células).

3. Revestimento de grânulos de Microcarrier

  1. misturar 7 mL de grânulos microcarrier com 42 mL de solução de colágeno em um tubo de 50 mL (100 μg/mL, diluído em uma solução de ácido acético 0,2%) e incube por 1h à temperatura ambiente.
  2. Lave grânulos duas vezes com 25 mL de pH PBS 7.4 (adicionar 25 mL de PBS, misture bem com a pipeta e esperar até que os grânulos são estabeleceram então descartar o sobrenadante e repetição) e uma vez com 25 mL de meio DMEM.
  3. Cobrir os grânulos no tubo de 50 mL com 10mL de meio 199 suplementado com 10% de FBS, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 0,4% de crescimento de célula endotelial médio suplemento Mix e 25 μL de heparina (5000 UI/mL) e permitir que a equilibração por 10 min antes de nova utilização.

4. Coleta de células

  1. remover o meio de cultura celular de no frasco T175 PAEC e adicionar 5 mL de pH PBS 7.4.
  2. Remover PBS do recipiente T175.
  3. Adicionar 5 mL de EDTA Trypsin-0.05% e incubar durante 3-4 minutos a 37 ° C.
  4. Coletar as células por lavagem do frasco com 15 mL de meio de cultura celular e transferir a suspensão em um tubo de 50 mL.
  5. Centrífuga células a 1.200 x g por 8 min à temperatura ambiente, remover o excesso de meio e resuspenda o pellet em 5 mL de meio de cultura celular.

5. Semeadura de células para o balão de agitador

  1. Adicionar 20 mL de meio de cultura celular para a suspensão de eritrócitos e ressuspender.
  2. Adicionar 20 mL meio de cultura celular (sem células) no balão de 500 mL agitador magnético.
  3. Adicionar as células para os grânulos microcarrier lavado da etapa 3.3 e misturar cuidadosamente com uma pipeta de 25 mL serológica.
  4. Transferir a mistura de grânulos/célula aferido o girador magnético.
  5. Lavar o tubo de 50 mL com 10 mL de meio de cultura celular para coletar as células restantes.
  6. Adicionar um adicional 85 mL de meio de cultura celular para o balão de girador e coloque-o na incubadora durante a noite a 37 ° C, um agitador (100 x g, intervalo de mistura: 3 min cada 45 min).
  7. Adicionar 50 mL de meio de cultura celular (total de volume de 200 mL) e continue mexendo para adicional 24h a 37 ° C em um shaker (x 100 g, intervalo de mistura: 3 min cada 45 min).
  8. Meio RPMI incolor de Add (suplementado com 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 0,4% de crescimento de célula endotelial médio suplemento Mix e 25 μL de heparina) até 320 mL de volume total é alcançado.
  9. Substituir a medium cada 48 h: remover 100 mL de meio velho e adicionar 100 mL de RPMI incolor complementado fresco.
    10. As células de cultura de
  10. por 5 a 7 dias. O tempo depende do estado de confluência dos grânulos revestidos célula.
< classe p = "jove_title "> 6. Verificação de confluência

  1. recolher 200 μL de grânulos revestidos célula usando uma pipeta e transferi-los para um tubo de polipropileno.
  2. Lave os grânulos 3 vezes com 600 µ l de PBS 1 x (adicionar PBS, incline o tubo e misture delicadamente para evitar o desprendimento das células, esperar os grânulos para sossegar, descartar a PBS e repita).
  3. Corrigir os grânulos por 10 min, adicionando-se 200 µ l de ácido parapicric.
  4. Lavar 3 vezes com 600 µ l de PBS 1 x.
  5. Adicionar DAPI diluído em PBS 1 x e incubar durante 10 min.
  6. Transferência as contas sobre uma lâmina de vidro e uma lamela utilizando o meio de montagem de glicerol com base em.
  7. Visualizar as contas sob um microscópio confocal.

7. Procedimento experimental

  1. remover as contas de celular-revestido do recipiente agitador magnético (procedimentos não tem que ser feito sob condições estéreis) com uma pipeta de 10 mL serológica e transferi-los para tubos de polipropileno de fundo redondo 12 mL.
  2. Deixe os grânulos assentar (em torno de 1-2 min) e remover o excesso de meio.
  3. Adicionar mais contas para os tubos até cada tubo contém exatamente 2 mL de grânulos.
  4. Adicionar 5 mL RPMI clara a cada tubo e misture com cuidado usando uma pipeta sorológica de 10 mL.
  5. Deixe os grânulos assentar e remover o excesso de meio.
  6. Repetir o procedimento de lavagem mais uma vez com RPMI e retire todo o excesso de meio.

8. Incubação com sangue anticoagulado Non

  1. lentamente e com cuidado (utilizando jato nem Vacu) tirar sangue de um voluntário saudável e recolhê-la em tubos de polipropileno neutro de 9 mL (sem anticoagulante).
  2. Lentamente transferir 8 mL de sangue com uma pipeta sorológica de 10 mL para cada um dos tubos de polipropileno, contendo 2 mL de grânulos revestidos de célula (o volume total será de 10ml). Sempre Evite o manuseio de sangue ou grânulos para evitar a ativação prematura do CE. O procedimento leva 1-2 min.
  3. Incline cuidadosamente a mistura de sangue/pérola para assegurar uma mistura igual e sele a tampa com filme de parafina.
  4. Coloque os tubos em uma tabela de inclina horizontal (com suaves inclina apenas para configurações) dentro de uma incubadora de 37 ° C e recorde tempos de coagulação.
    1. Em intervalos de tempo definido, por exemplo, depois de 10, 20, 30, 50, 70, 90 min, remover pelo menos 1,5 a 2 mL da mistura de sangue-grânulo para análise de soro ou plasma.
      Nota: para 6 pontos de tempo sugerimos tendo mais de 3 repetições dentro de um grupo de células, como a colheita de sangue será feita em diferentes tubos.
    2. Para coleta de soro, deixar o sangue a coagular. Para coletar o plasma, adicionar o EDTA ou citrato para tubos de 2 mL antes de adicionar a amostras de sangue.
    3. Armazenar os tubos em gelo, centrifugar a 2.500 x g durante 10 minutos a 4 ° C e armazenar o soro/plasma a 80 ° C até o uso.
      Nota: Detalhes sobre os materiais são fornecidos na Tabela de materiais

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Resultados

Após 7-10 dias de cultura no recipiente de girador (Figura 1), as células eram confluentes, cobrindo toda a superfície dos grânulos microcarrier (Figura 2). Verificação do estado Confluencia é um passo importante porque um monolayer não confluente da CE sobre o microbeads conduzirá a uma diminuição acentuada no tempo de coagulação, dada a microcarrier superfície dos grânulos é fortemente pró-coagulante (tempo de coagulação: 4 ± 1...

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Discussão

O modelo apresentado aqui é apropriado para coagulação relacionados com estudos, permitindo a análise de diferentes aspectos da coagulação e sua interação com a CE. 8 em pesquisa de Xenoenxerto, é um sistema útil para testar as propriedades anticoagulantes de diferentes ECs suínos geneticamente modificados após incubação com sangue humano 9.

Os passos mais importantes do protocolo são aqueles garantindo cobertura de celular completa (confluência)...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi suportado pela Fundação Suíça de ciência nacional (SNSF, Grant No. 320030_156193). Os autores agradecer Dr. Benoît Werlen para fornecer os grânulos de microcarrier de Biosilon. Agradecemos também Prof Hans Peter Kohler e Prof André Haeberli pela ajuda com a criação do modelo de grânulo de microcarrier.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PAECisolado da aorta do porco em nossos
grânulos do microcarrier do laboratório (Biosilon)Thermo Fisher Scientific160-250
colagênio I, bovinoGibcoA10644-01
DMEMGibco21885-025
meio 199SigmaM7528
RPMIGibco32404-014
Tubos neutrosSarstedt02.1726.001
Tubos de polipropilenoSimportT406-2A
Frascos agitadoresTecnomara
Agitador biológicoBrouwerMCS-104S
Rato anti CD31R& D SystemsMAB33871Diluição 1:100
Cabra anti-rato IgG-Cy3Jackson Immuno Research112-166-003Diluição 1:500
Cabra anti VE-caderinaSanta Cruzsc-6458Diluição 1:100
Coelho anti vWFDAKOA0082Diluição 1:100
Dk anti Gt IgG – Sondas Moleculares Alexa 488A11055Diluição 1:500
Cabra anti Coelho - FITCSouthern Biotech4050-02Diluição 1:500
DAPISigma32670-25MG-FDiluição 1 µ g/mL
0,05% Tripsina-EDTAGibco25300-054
FBSGibco10270-106Concentração: 10% em meio de cultura de células
AdaptadorSarstedt14.1205
Microscópio confocalCarl ZeissLSM 710
Software de análise de imagemImagem JDisponível gratuitamente em: https://imagej.net
Suplemento de Meio de Crescimento de Células EndoteliaisMixPromoCellC-392162 mL em 500 mL de DMEM
Penicilina EstreptomicinaGibco15140-122Concentração: 1% em meio de cultura de células
L-GlutaminaGibco25030-024Concentração: 1% em meio de cultura de células
Heparinun natricumDrossa Pharm AGConcentração de estoque: 5000 UI/ mL
Lâminas de câmaraBioswisstec AG30108
CaCl2 x 2H2OMerck2382.0500
MgCl2 x6 H2OMerck1.5833.1000
Tween 20Axon Lab AG9005-64-5
Albumina de soro bovino (BSA)SigmaA7030
Meio de montagem em gel de glicergelDakoC0563

Referências

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
  2. Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
  4. Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
  5. Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
  6. Cowan, P. J., d'Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
  8. Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).

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Reimpressões e permissões

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