Nós descrevemos um método para medir a ativação das funções efetoras Fc-mediada por anticorpos que visam a hemaglutinina do vírus da gripe. Este ensaio também pode ser adaptado para avaliar a capacidade dos anticorpos monoclonais ou policlonais soros visando outras glicoproteínas de superfície virais para induzir imunidade mediada por Fc.
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Artigo de método
Um método para avaliar funções efetoras mediada por Fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os anticorpos desempenham um papel crucial no acoplamento as respostas imune inatas e adaptativas contra patógenos virais através dos seus domínios de ligação do antígeno e Fc-regiões. Aqui, descrevemos como medir a ativação do Fc funções efetoras por anticorpos monoclonais visando a hemaglutinina do vírus da gripe com o uso de uma linhagem de células Jurkat geneticamente expressando uma ativação tipo Fc 1-FcγR. usando esse método, o contribuição de interações específicas de Fc-FcγR conferidos por imunoglobulinas pode ser determinada usando um ensaio em vitro .
Introdução
Imunidade fornecida pela vacina contra a gripe sazonal tradicionalmente tenha sido avaliada pela hemaglutinação (HI) de inibição do ensaio1, que mede a presença de anticorpos que visam o sítio de ligação do receptor da hemaglutinina. Estes anticorpos HI-ativo podem conferir imunidade esterilizante, mas são geralmente estreitos em sua amplitude de proteção, oferecendo imunidade para apenas um seleto poucos estirpes do vírus gripe. O isolamento e caracterização de amplamente reativos anticorpos monoclonais que reconhecem a hemaglutinina (HA) sugerem que o desenvolvimento de uma vacina universal da gripe está ao alcance de3....
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Protocolo
Os experimentos pré-formado neste manuscrito foram feitos institucional código do seguir Icahn da faculdade de medicina de ética e regulamentação.
1. expressão de hemaglutinina do vírus da gripe através de transfeccao ou infecção
Transfecção:
- Células de rim humano embrionário (HEK 293T) placa em uma densidade de 2 x 104 células/poço em cultura de tecido branca trataram placa de 96 poços e deixem descansar por 4 horas em uma incubadora de 37 °C (com 5% CO2).
- Transfect células com 100 ng de DNA que codifica para a hemaglutinina viral e 0,2 ....
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Resultados
Demonstrámos que um talo específicos mAb, 6F12, mas não específicos cabeça um cabeça específicos mAb, PY102, era capaz de ativar células primárias de assassinas naturais por estrogenos CD107a e interferon γ19. Para modelar a capacidade de um anticorpo específico de talo de ativar pilhas NK humanas primárias, mostramos que um mAb talo-específicas, 6F12, robustamente pode ativar a célula Jurkat modificada, expressando o murino FcγRIV por ~ 14-fold. Por outro lado, o mAb específico cabeça, PY102 e o .......
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Discussão
O método descrito aqui permite que o usuário medir a capacidade de um anticorpo monoclonal de HA-específicas para envolver o FcγRIV murino. O antígeno alvo, hemaglutinina do vírus da gripe, é expressa na superfície das células após a infecção por vírus ou transfeccao de Plasmideo DNA. O ensaio é mais ameno com diferentes proteínas virais superfície-expresso em combinação com outros FcγRs (humanos ou murino). Além disso, nós usamos amostras de soros para avaliar a capacidade de anticorpos em um contexto policlonal para in.......
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Divulgações
Os autores declaram não há conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este projecto foi financiado em parte com fundos federais do Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas, National Institutes of Health, departamento de saúde e serviços humanos, sob CEIRS P01AI097092-04S1 (P.E.L.) do contrato.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células A549 | ATCC | CCL-185 | Células epiteliais basais alveolares humanas adenocarcinômicas |
| Células HEK 293T | ATCC | CRL-3216 | Células renais embrionárias humanas |
| Lipofectamina 2000 | Life Technologies | Reagente de | transfecção |
| 1X Opti-MEM Soro Reduzido Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| Placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos brancos | Corning, Inc. | 3917 | placas de ensaio |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Célula Jurkat expressando murino FcgRIV | Promega | M1201 | Kit fornece inclui células, sistema de ensaio Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI e baixo soro IgG |
| Célula Jurkat expressando humano FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit fornece inclui células, sistema de ensaio Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI e soro |
| baixo IgGO | Promega | G9901 | fornece inclui células, sistema de ensaio de Luciferase Bio-Glo, 1X RPMI e soro de baixa IgG |
| Luminômetro Leitor | placas de luminescência | BioTek | Synergy H1 |
| Sistema de ensaio de luciferase Bio-Glo Sistema de ensaio de luciferase | Promega | G7940 | Contém tampão de ensaio de luciferase e substrato de ensaio de luciferase |
| Células renais caninas Madin Darby | ATCC | CCL-34 | Células renais caninas |
Referências
- Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses. J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).
- Throsby, M., et al.
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Reimpressões e permissões
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