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Artigo de método

Um método para avaliar funções efetoras mediada por Fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe

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DOI:

10.3791/56256

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23 de fevereiro de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Graduate School of Biomedical Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Infectious Disease, J. Craig Venter Institute

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos um método para medir a ativação das funções efetoras Fc-mediada por anticorpos que visam a hemaglutinina do vírus da gripe. Este ensaio também pode ser adaptado para avaliar a capacidade dos anticorpos monoclonais ou policlonais soros visando outras glicoproteínas de superfície virais para induzir imunidade mediada por Fc.

Resumo

Os anticorpos desempenham um papel crucial no acoplamento as respostas imune inatas e adaptativas contra patógenos virais através dos seus domínios de ligação do antígeno e Fc-regiões. Aqui, descrevemos como medir a ativação do Fc funções efetoras por anticorpos monoclonais visando a hemaglutinina do vírus da gripe com o uso de uma linhagem de células Jurkat geneticamente expressando uma ativação tipo Fc 1-FcγR. usando esse método, o contribuição de interações específicas de Fc-FcγR conferidos por imunoglobulinas pode ser determinada usando um ensaio em vitro .

Introdução

Imunidade fornecida pela vacina contra a gripe sazonal tradicionalmente tenha sido avaliada pela hemaglutinação (HI) de inibição do ensaio1, que mede a presença de anticorpos que visam o sítio de ligação do receptor da hemaglutinina. Estes anticorpos HI-ativo podem conferir imunidade esterilizante, mas são geralmente estreitos em sua amplitude de proteção, oferecendo imunidade para apenas um seleto poucos estirpes do vírus gripe. O isolamento e caracterização de amplamente reativos anticorpos monoclonais que reconhecem a hemaglutinina (HA) sugerem que o desenvolvimento de uma vacina universal da gripe está ao alcance de3,2,4, 5 , 6 , 7 , 8. um dos objectivos principais de uma vacina universal da gripe é induzir uma resposta do anticorpo forte em direção as regiões conservadas do vírus da gripe9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. amplamente reativos anticorpos que reconhecem estes resumos conservados, composto de neutralizantes e não-neutralizando anticorpos17,18, foram mostrados para exigir Fc-FcγR interações para ideal proteção na vivo e destacar a contribuição da imunidade mediada por Fc para a resposta imune geral a gripe vírus19,20.

Correlações de proteção são cruciais na avaliação de imunidade à infecção. Essas métricas permitem que os cientistas e médicos estimar a eficácia das vacinas, o significado dos dados e o curso do tratamento. O único estabelecido correlato de proteção contra a infecção pelo vírus da gripe é o ensaio de inibição da hemaglutinação. Um título de 01:40 é associado com uma redução de 50% no risco de doença1,21 – e reflete a presença de anticorpos que inibem a aglutinação alvejando o receptor binding site localizado na cabeça globular do HA. No entanto, também deve ser notado que respostas de células T podem ser uma melhor correlação de proteção contra a infecção pelo vírus da gripe em idosos. Curiosamente, um relatório recente sugere que a atividade de inibição de neuraminidase pode ser um melhor preditor de imunidade à gripe22. Felizmente, típico em vitro ensaios tais como ensaios de inibição de neutralização ou neuraminidase podem medir os anticorpos de talo ou neuraminidase-específicos HA. A maioria destes ensaios convencionais em vitro , no entanto, só leva em conta a função da região de ligação do antígeno do anticorpo e não meça o papel da região de Fc. Além disso, a contribuição dos anticorpos não neutralizantes que proteger via Fc receptor noivado na vivo não são detectados17,18. Para medir a proteção conferida pelos anticorpos que induzem a imunidade mediada por Fc como citotoxicidade mediada de célula dependente de anticorpo (ADCC), é necessário um ensaio robusto em vitro .

O método descrito abaixo avalia a capacidade de murino anticorpos monoclonais para induzir funções Fc-mediada através da utilização de uma linhagem de células Jurkat geneticamente modificada expressando uma ativando murino digite 1 FcR, FcγRIV. Noivado de anticorpo da FcγR transduces esse fator nuclear de gatilhos de atividade luciferase mediada por células T ativadas de sinalização intracelular. O ensaio tem várias vantagens sobre as técnicas tradicionais que exigem isolamento e cultura de células efetoras primário e o uso da citometria de fluxo para detectar a ativação do efetor mediada por Fc funções19,23,24 ,25,26. Em primeiro lugar, o protocolo descrito aqui pode ser facilmente adaptado para incorporar diferentes alvos virais, FcγRs e anticorpos de diferentes espécies (humanos e murino). Em segundo lugar, o uso de um modificado células Jurkat linha expressando uma FcγR com um gene do repórter do luciferase sob um fator nuclear das células T ativadas (NFAT) permite a um ensaio de grande formato que pode ser facilmente analisado usando um leitor de placa medindo luminescência. Aqui, a tradicional ativação de células efetoras primário é substituída com a indução do NFAT-luciferase sobre noivado de anticorpo de um FcγR na superfície da célula Jurkat. Este ensaio de formato de placa de 96 poços permite a medição de até quatro diferentes amostras em triplica com sete diluições – um número de amostras que poderia ser complicado usando técnicas tradicionais. Existem pontos adicionais a serem considerados com este ensaio que pode afetar o projeto de experimentos e interpretação de dados. O alvo viral deve ser expressos na superfície da pilha em ordem para reconhecimento de anticorpos. Para atenuar isso, o antígeno alvo (por exemplo, uma proteína viral interna) pode ser revestido diretamente na superfície de uma placa. No entanto, isto não ainda foi rigorosamente testado. Além disso, a linhagem de células Jurkat modificada expressa apenas um tipo de ativação FcγR e não expressa qualquer FcγRs inibitório, enquanto linhas de célula primária expressam todos os receptores em um contexto fisiológico.

Utilizámos anteriormente neste ensaio para demonstrar que o epítopo especificidade em um contexto de polyclonal desempenha um papel crucial na regulação de funções efetoras mediada por Fc e que ideal ativação da resposta de mediada por células dependente de anticorpo requer dois pontos de contato27,28. Aqui, descrevemos um método que avalia a capacidade dos anticorpos monoclonais específicos do talo para engajar e ativar o murino ativando FcγRIV. Embora haja exceções29,30, um grande número de anticorpos reativos amplamente região da haste antigenicamente conservada a hemaglutinina de destino e, portanto, desempenhar um papel importante no desenvolvimento de uma gripe universal vacina.

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Protocolo

Os experimentos pré-formado neste manuscrito foram feitos institucional código do seguir Icahn da faculdade de medicina de ética e regulamentação.

1. expressão de hemaglutinina do vírus da gripe através de transfeccao ou infecção

Transfecção:

  1. Células de rim humano embrionário (HEK 293T) placa em uma densidade de 2 x 104 células/poço em cultura de tecido branca trataram placa de 96 poços e deixem descansar por 4 horas em uma incubadora de 37 °C (com 5% CO2).
  2. Transfect células com 100 ng de DNA que codifica para a hemaglutinina viral e 0,2 µ l de reagente de transfeccao por bem em um volume total de 50 μL.
    Nota: Ambos reagente do plasmídeo e transfectant são diluídos em 1 x Opti-mínimo essencial Media (MEM) reduzida média de soro.
  3. Incubar as placas em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2 para 18 h, depois de remover mídia do transfection.

2. infecção

  1. Células de rim canino A549 placa ou Madin Darby em uma densidade de 2 x 104 células/poço em cultura de tecido branca trataram placa de 96 poços e crescerem pelo menos 18 h numa incubadora 37 °C com 5% de CO2.
  2. Vírus diluído em 1 x MEM e infectar células em uma multiplicidade de infecção de 0,33 por 1h em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2, 1 ou 3. Volume total deve ser igual 100 μL.
    Nota: 10 x MEM é diluída com água para fazer um estoque de trabalho MEM para diluição de vírus mencionada acima de 1x.
  3. Após a infecção, remover o inóculo e adicionar 100 μL de 1 x MEM na placa na ausência de tripsina.
  4. Cresce células infectadas por 18 a 24 h em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2.

3. avaliação da ativação FcRg/NFAT-mediada de Luciferase atividade por anticorpos monoclonais ou Sera

  1. Primeiro, substitua a mídia de crescimento das células transfectadas ou infectadas com 25 µ l de mídia do ensaio (1 x RPMI 1640 suplementado com 4% (vol/vol) baixa IgG fetal bovino soros).
  2. Em uma placa de 96 poços separada, realize quatro diluições dos anticorpos de interesse começando em 30 μg/mL, utilizando o meio de ensaio. Realizar diluições em triplica e um layout de placa de exemplo está ilustrado na figura 1A. Certifique-se de incluir um controle que exclui o anticorpo (sem controle de anticorpo) bem como um controle de fundo (buffer de ensaio sozinho).
    Nota: para ambos os 'sem anticorpos' e controles de fundo, adicione 25 µ l de tampão de ensaio em vez de anticorpo.
  3. Transferi 25 μL dos anticorpos serialmente diluídos de passo 3.2 para poços correspondentes na placa de células transfectadas ou células infectadas.
  4. Incube a placa em uma incubadora de 37 °C (com 5% CO2) por 15 min.
  5. Adicione 25 μL da célula apropriada effector modificados Jurkat expressando murino FcgRIV ou FcgRIIIa humano (75.000 células/poço). Volume total para cada bem deve ser 75 µ l e a concentração inicial e final do anticorpo é a 10 µ g/mL (figura 1B).
    Nota: Para o controle de fundo, adicione 25 µ l de buffer de ensaio em vez de células efetoras. Para examinar a fagocitose de mediada por células dependente de anticorpo, uma célula modificada de Jurkat expressando a FcgRIIa humana pode ser usada.
  6. Incube a placa em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2 para 6 h.
  7. Degelo e tampão de substrato luciferase quente em uma água de 37 °C por cerca de 1h antes da utilização.
    Nota: Para fazer o tampão de substrato de luciferase, reconstitua o liofilizado luciferase ensaio substrato no buffer de ensaio fornecido. O tampão de substrato reconstituído pode ser armazenado a-30 °C até-10 °C por até seis semanas.
  8. Adicione 75 μL/poço do tampão de substrato de luciferase para todos os poços excepto o controle de fundo.
  9. Ler um luminómetro.
  10. Calcular a indução de dobra com a seguinte equação: dobre a indução = (valor de valor-Background induzida) / (nenhum valor de valor-fundo de mAb).

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Resultados

Demonstrámos que um talo específicos mAb, 6F12, mas não específicos cabeça um cabeça específicos mAb, PY102, era capaz de ativar células primárias de assassinas naturais por estrogenos CD107a e interferon γ19. Para modelar a capacidade de um anticorpo específico de talo de ativar pilhas NK humanas primárias, mostramos que um mAb talo-específicas, 6F12, robustamente pode ativar a célula Jurkat modificada, expressando o murino FcγRIV por ~ 14-fold. Por outro lado, o mAb específico cabeça, PY102 e o ...

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Discussão

O método descrito aqui permite que o usuário medir a capacidade de um anticorpo monoclonal de HA-específicas para envolver o FcγRIV murino. O antígeno alvo, hemaglutinina do vírus da gripe, é expressa na superfície das células após a infecção por vírus ou transfeccao de Plasmideo DNA. O ensaio é mais ameno com diferentes proteínas virais superfície-expresso em combinação com outros FcγRs (humanos ou murino). Além disso, nós usamos amostras de soros para avaliar a capacidade de anticorpos em um contexto policlonal para in...

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Divulgações

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este projecto foi financiado em parte com fundos federais do Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas, National Institutes of Health, departamento de saúde e serviços humanos, sob CEIRS P01AI097092-04S1 (P.E.L.) do contrato.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células A549ATCCCCL-185Células epiteliais basais alveolares humanas adenocarcinômicas
Células HEK 293TATCCCRL-3216Células renais embrionárias humanas
Lipofectamina 2000Life Technologies Reagente detransfecção
1X Opti-MEM Soro Reduzido MediumThermoFisher Scientific51985-034
Placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos brancosCorning, Inc. 3917placas de ensaio
10X MEMGibco11430-030
Célula Jurkat expressando murino FcgRIVPromegaM1201Kit fornece inclui células, sistema de ensaio Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI e baixo soro IgG
Célula Jurkat expressando humano FcgRIIIaPromegaG7010Kit fornece inclui células, sistema de ensaio Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI e soro
baixo IgGOPromegaG9901fornece inclui células, sistema de ensaio de Luciferase Bio-Glo, 1X RPMI e soro de baixa IgG
Luminômetro Leitorplacas de luminescênciaBioTekSynergy H1
Sistema de ensaio de luciferase Bio-Glo Sistema de ensaio de luciferasePromegaG7940Contém tampão de ensaio de luciferase e substrato de ensaio de luciferase
Células renais caninas Madin DarbyATCCCCL-34Células renais caninas
11668019 kit de FcgRIIa humano que expressa células Jurkat de

Referências

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