Macrófago extracelulares armadilhas são uma entidade recentemente descrita. Este artigo se concentrará em métodos de microscopia confocal e como eles são visualizadas in vitro e em vivo de amostras do pulmão.
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Artigo de método
Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um método primário usado para definir a presença de neutrófilos armadilhas extracelulares (redes) é a microscopia confocal. Modificamos a microscopia confocal estabelecidos métodos para visualizar armadilhas extracellular do macrófago (METs). Estas armadilhas extracelulares são definidas pela presença de cromatina extracelular com expressão co de outros componentes como proteases do grânulo, citrulinado histonas e peptidyl arginase deiminase (PAD). A expressão dos METs geralmente é medida após a exposição a um estímulo e em comparação com amostras não-estimuladas. As amostras também estão incluídas para plano de fundo e do isotipo controle. As células são analisadas usando software de análise de imagem bem definida. Microscopia confocal pode ser usada para definir a presença de metástases tanto in vitro e em vivo no tecido pulmonar.
Introdução
Neutrófilos armadilhas extracelulares (redes), foi primeiramente descrito pelo Brinkmann et al 1 eles são predominantemente produzidos em resposta à infecção (especialmente para as bactérias) e têm um papel importante na defesa de anfitrião1,2. Eles também têm sido descritos para ocorrer em resposta a doenças não-infecciosas, incluindo vasculite e Lúpus eritematoso sistémico (SLE); e ao mitógeno phorbol 12-myrisate 13-acetato (PMA)2,3. Recentemente foi reconhecido que outros tipos de células podem também produzir armadi....
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Protocolo
este protocolo segue experiências aprovadas em: (1) os seres humanos pelo Comitê de ética de Monash Medical centro e (2) animais pelo Comitê de ética da Universidade de Melbourne.
1. macrófagos do lavado broncoalveolar (BAL)
- BAL de uso para obter os macrófagos pulmonares em: (1) humanos sujeitos por broncoscopia 6 e (2) ratos usando aspiração intratraqueal 13 .
Nota: Aquisição de macrófagos em geral, causa uma ativação dessas células. Os macrófagos são obtidos de pacientes que requerem uma broncoscopia para investigar um problema médico potencial e nem todos os temas podem....
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Resultados
Os METs podem ser visualizados de amostras de BAL, no tecido pulmonar e nas seções mais grossas de pulmão com imagens em 3D. Um exemplo de METs visualizado em uma amostra de BAL é mostrado na Figura 1. A morfologia do METs irá variar de acordo com seu estágio de maturação. A primeira característica detectável na microscopia é o movimento do núcleo à borda da célula. Isto é seguido por cromatina extracelular com outros mediadores co expressas, tais como H3Cit .......
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Discussão
O método descrito nesta revisão é baseado em que usado para definir a presença de redes14. Os macrófagos são, de longe, o tipo de célula dominante em amostras de BAL... e este método de coleta é particularmente adequado para o estudo dos METs. Se células vermelhas do sangue estiverem presentes no BAL, estas células devem ser lysed usando cloreto de amônio. O procedimento de BAL geralmente irá ativar os macrófagos e, portanto, espera-se que haverá METs presentes em amostras não-estimuladas. Os macr.......
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Divulgações
Os autores têm sem divulgações para fazer em relação a este trabalho.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por doações da Monash University, National Health e Medical Research Council e o pulmão de Monash e Instituto do sono. Os autores gostaria de agradecer o pessoal da imunologia clínica na saúde de Monash, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass e Camden Lo de Monash Micro Imaging (MMI) para obter ajuda com a microscopia confocal da imagem latente, e os autores reconhecem as instalações do MMI da Universidade de Monash. Os autores reconhecem a instalações e assistência científica e técnica da plataforma de histologia de Monash.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Amostras humanas: Anticorpos primários | |||
| Coelho anti-humano H3Cit (Citrulina R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Coelho anti-humano MMP12 | Novus Biológico | NB110-57214 | concentração 1:100 não quantificável |
| Rato anti-humano MMP9 | Novus Biológico | AB119906 | 1:200 ascite, sem concentração dado |
| Coelho anti-humano PADI2 / PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug / ml |
| Rato anti-humano PADI4 / PAD4 | Abcam | AB128086 | 10,1 ug / ml |
| Ovelha anti-humana NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug / ml |
| Nome< / strong> | Empresa< / strong> | Número de catálogo< / strong>< | strong>Comentários |
| Amostras de camundongos: Anticorpos primários | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Coelho anti-mouse H3Cit (Citrulina R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rato anti-rato F4/80 | Internamente (hibridoma) | Em casa | 20 ug/ml |
| Ovelhas anti-humano Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-humano &tímido; e tímido; e tímido; e tímido; PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10,1 ug/ml |
| Super-frost mais corrediças | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolongar ouro | Sondas moleculares | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Cloreto de amônio | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Anticorpos secundários | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Anti-rato para galinhas AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Anti-ovelha para burros AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Anti-rato para galinhas AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Anti-ovelha para burros AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Controle de | |||
| Coelho IgG | Em casa | ||
| Coelho IgG | Em casa | ||
| Rato IgG1 | BD Biociência | 550878 | |
| Coelho IgG | Em casa | ||
| Rato IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Ovelha IgG | Em casa | ||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Programas de software | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| Para a intensidade média dos fluoróforos, um aplicativo de escritório padrão como o Microsoft Excel pode ser usado | |||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Microscópios | |||
| C1 Microscópio de varredura confocal | |||
| FV1200 Microscópio de varredura confocal | Olympus | ||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Fontes de tecido | |||
| Amostras de LBA humana da sala de broncoscopia do Monash Medical Center | |||
| Amostras de BAL de camundongos e tecido pulmonar do Departamento de Farmacologia da Universidade de Melbourne. | |||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Soro fetal de bezerro | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo< | strong>Comentários |
| Outros reagentes | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| fixador de paraformaldeído/periodato/lisina (PLP) | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xileno | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Cetamina | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Formalina natural | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Parafina | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvente 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Lamínulas 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Nome | Empresa< | strong>Número de Catálogo< | strong>Comentários |
| Camundongos | |||
| c57 preto 6 | Monash plataforma de pesquisa animal (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
Referências
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012). <....
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Reimpressões e permissões
