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Artigo de método

Avaliação dos efeitos de drogas baseados em anticorpo murino da medula óssea e ativação de macrófagos peritoneais

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DOI:

10.3791/56689

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26 de dezembro de 2017

 , 
1British Columbia Children's Hospital Research Institute, University of British Columbia

Neste artigo

Resumo

Drogas baseadas em anticorpos revolucionaram o tratamento de doenças inflamatórias. Além de ter efeito direto sobre a alvos específicos, os anticorpos podem ativar macrófagos tornar-se anti-inflamatórios. Este protocolo descreve como anti-inflamatórios macrófago ativação pode ser avaliada in vitro, usando os macrófagos da medula óssea de rato e in vivo usando os macrófagos peritoneais.

Resumo

Os macrófagos são células do sistema imunológico inatas fagocíticas, iniciar respostas imunes a agentes patogénicos e contribuir para a restituição de cura e de tecido. Os macrófagos são igualmente importantes em desligar respostas inflamatórias. Mostramos que os macrófagos estimulados com imunoglobulina intravenosa (IVIg) podem produzir grandes quantidades das citocinas anti-inflamatórias, interleucina 10 (IL-10) e baixos níveis de citocinas pró-inflamatórias em resposta a lipopolissacarídeo bacteriano ( LPS). IVIg é que um anticorpo polivalente, principalmente imunoglobulina Gs (IgGs), pool de plasma de mais de 1.000 doadores de sangue. É usado para complementar os anticorpos em pacientes com deficiências imunológicas ou suprimir a resposta imune em pacientes com doenças auto-imunes ou inflamatórias. Infliximab, um anticorpo de alfa (TNFa) terapêutica anti-tumor necrose fator, também foi mostrado para ativar os macrófagos a produzir IL-10 em resposta a estímulos inflamatórios. IVIg e outros produtos biológicos baseados em anticorpo podem ser testados para determinar seus efeitos na ativação de macrófagos. Este artigo descreve métodos para derivação, estimulação e avaliação de medula murino macrófagos ativados por anticorpos em vitro e macrófagos peritoneais murino, ativados com anticorpos em vivo. Finalmente, vamos mostrar o uso da mancha ocidental para determinar a contribuição da célula específica, sinalização de caminhos para a atividade do macrófago anti-inflamatórios. Esses protocolos podem ser usados com ratos geneticamente modificados, para determinar o efeito de um somáticas específicas na ativação de macrófagos anti-inflamatórios. Essas técnicas também podem ser usadas para avaliar se os produtos biológicos específicos podem agir alterando os macrófagos para um estado de ativação anti-inflamatórias IL-10-produzindo que reduz respostas inflamatórias em vivo. Isso pode fornecer informações sobre o papel da ativação de macrófagos na eficácia de produtos biológicos durante modelos de doenças em camundongos e fornecer informações sobre um novo mecanismo de potencial de ação nas pessoas. Por outro lado, isto pode advertir contra o uso de produtos biológicos de baseados em anticorpos específicos para tratar doenças infecciosas, particularmente se os macrófagos desempenham um papel importante na defesa do hospedeiro contra a infecção.

Introdução

Os macrófagos são células do sistema imunológico inatas, que desempenham várias funções na resposta imune à infecção ou lesão. Os macrófagos são responsáveis por iniciar uma resposta imune a danos de infecção ou tecido, parando a resposta inflamatória e promover a cura de resposta1. Exemplos dos três Estados-ativação melhor estudados macrófago são: 1) macrófagos tratados com interferon gama (relato) e bacteriano lipopolissacarídeo (LPS), designado M (relato + LPS), que contribuem para a resposta inflamatória; 2) macrófagos estimulados com interleucina 4 (IL-4), M(IL-4), que são associados com a resposta de cura; 3) macrófagos estimulados com complexos imunes (IC) e LPS, M (IC + LPS), que têm a capacidade de desligar a resposta inflamatória2,3. M (IC + LPS) são distinto dos macrófagos de cicatrização de feridas M(IL-4) e não expressam a arginase enzima (Arg-1) ou FIZZ14. O melhor marcador para estes macrófagos anti-inflamatórios é a produção de citocinas5. Os macrófagos têm várias funções na manutenção da saúde, mas também contribuam para doenças inflamatórias e câncer3. Por causa disso, os macrófagos são um chave alvo terapêutico para o tratamento de uma ampla variedade de doenças. É importante investigar os efeitos dos anticorpos sobre seu estado de ativação para desenvolver tratamentos baseados em macrófagos para doença.

O foco deste artigo é sobre o uso de murino medula óssea derivada de macrófagos (BMDMs) e macrófagos peritoneais para testar o efeito de drogas de anticorpo em respostas inflamatórias em vitro e em vivo. Recentemente, tem havido vários estudos mostrando os efeitos dos anticorpos na ativação de macrófagos a6,7,8. Macrófagos ativados conjuntamente com complexos imunes, que são anticorpos complexos com um antígeno e LPS, um estímulo inflamatório normalmente, produzem níveis muito elevados de citocinas anti-inflamatórias, IL-10 e níveis muito baixos das citocinas pró-inflamatórias, Interleucina 12 (IL-12)9. Além disso, infliximab, um anticorpo monoclonal contra TNFa, verificou-se a trabalhar, em parte, através da indução de anti-inflamatórios macrófagos através de seu fragmento cristalizável (Fc) região7. Informamos que IVIg + LPS induzem ativação de macrófagos anti-inflamatório que é semelhante a M (IC + LPS), onde os macrófagos co estimulados produzem grandes quantidades de IL-10 e quantidades baixas da subunidade de citocina pró-inflamatória interleucina 12 ou 23 p40 ( Il-12/23p40), interleucina-6 (IL-6) e TNF8. IVIg é um fármaco composto por Anticorpos policlonais, principalmente IgG, que tem sido em pool de sangue de mais de 1.000 doadores10. Ele é usado para tratar uma ampla variedade de doenças imunológicas, tais como Púrpura Trombocitopênica Idiopática e polineuropatia desmielinizante crônica, mas seu mecanismo de ação não é completamente compreendido,11. Os efeitos das drogas do anticorpo com base na ativação de macrófagos podem ser avaliados usando os métodos descritos neste documento.

Os efeitos de produtos biológicos específicos na ativação de macrófagos podem ser testados em BMDMs e macrófagos peritoneais. Usar essas fontes macrófago permite avaliação de células primárias. Testes preliminares de anticorpos em culturas primárias de células requer menos tempo e investimento monetário do que outros modelos de doença demorado e caro. Injetar uma droga em um rato saudável na vivoe isolando as células e analisando-os ex vivo, pode-se determinar se os estudos são garantidos para avaliar se o tratamento com produtos biológicos afeta a ativação de macrófagos em modelos de doenças.

Com alguns estudos que testam o efeito das terapias biológicas na ativação de macrófagos in vitro e em vivo diretamente, nossas técnicas fornecem uma vantagem sobre técnicas alternativas. As técnicas atuais envolvem testes efeitos de drogas biológicas na célula mista populações em vitro, tais como o efeito de infliximab em uma reação linfocitária mista (MLR) ou IVIg em macrófagos humanos em células mononucleares do sangue periférico, onde o efeito Não pode ser atribuída a um tipo de célula específica7,12. Usar BMDMs e macrófagos peritoneais é vantajoso sobre usando linhas de células, como células RAW264.7, que não produzem a citocinas pró-inflamatórias, IL-12, em resposta a LPS8,13. Testar o efeito de uma droga baseada em anticorpos no macrófago respostas ex vivo tem vantagens porque o cytokine respostas podem ser atribuídas diretamente aos macrófagos, ao invés de inferir respostas macrófago medindo os níveis séricos de citocinas14 . BMDMs e macrófagos peritoneais podem ser derivados e isolados de ratos geneticamente modificados para determinar o papel específico de uma proteína na ativação de macrófagos anti-inflamatórios. Por exemplo, nós usamos Il10 deficiente(- / -) BMDMs para demonstrar que IVIg-induzido redução da produção de citocinas pró-inflamatórias é parcialmente dependente da IL-108. Mecanismo de uma droga de ação pode ser investigado usando mancha ocidental, onde o papel de proteínas específicas e sinalização de eventos pode ser determinado. Reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) podem ser executada em BMDMs ou macrófagos peritoneais para mostrar os padrões de expressão gênica que resultam da ativação de anticorpos. Modelos de doenças em camundongos podem fornecer informações sobre a potencial eficácia de terapias biológicas anticorpo-baseado em modelos para as doenças inflamatórias intestinais doenças, artrite reumatoide e câncer15,16, 17. no entanto, as técnicas descritas aqui irão fornecer informações sobre o mecanismo de ação destes produtos biológicos, determinando se eles induzem a atividade do macrófago anti-inflamatórios.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Colúmbia Britânica.

1. medula óssea macrófago derivação e ativação com anticorpos

  1. Realize eutanásia usando CO2 asfixia.
    1. Rato de lugar na câmara de indução. Eutanásia em rato com anestesia de isoflurano 5%, para 60-90 s, até o imóvel e respirando são profundo e devagar.
    2. Desligue o isoflurano anestesia e administrar 6-8 L/min de CO2 até rato parou de respirar. Deixe mouse com CO2 pelo menos mais 5 min. verificar que não existe um batimento cardíaco ou respiração. Execute um deslocamento cervical para garantir a morte.
      Nota: 8-12 semanas os ratos velhos fornecem o mais alto rendimento de macrófagos.
  2. Pulverizar as pernas do mouse com etanol a 70% e fixá-los com braços e pernas esticadas na posição supina sobre uma placa de espuma. Com tesoura e pinça para segurar a pele, fazer um corte superficial (0,2 cm) para remover a pele e o pelo da superfície de cada uma das patas.
    Nota: Execute este procedimento e todas as manipulações de cultura de tecidos em uma capa de estéril.
  3. Apare o músculo para tornar visível a tíbias e fêmures. Remova as tíbias e fêmures, cortando o osso e os músculos logo abaixo da articulação do quadril e acima dos tornozelos. Guarnição tanto músculo fora possível.
  4. Spray de ossos com etanol a 70% e esperar 1 min para que ele evaporar e, em seguida, coloque-os na chapa bem 6 do médio de descarga de osso (modificado de Iscove médio de Dulbecco (IMDM), 10% de soro fetal bovino (FBS)).
  5. Apare as pontas dos ossos por um corte 0,1 cm do osso do tornozelo e parte superior do fêmur, para que fique exposta a cavidade óssea. Certifique-se que a medula é visível e uma agulha de 26 calibre pode ser colocada na cavidade óssea.
  6. Corte os ossos e músculos para separar as tíbias e fêmures das articulações de joelho. Inserir uma agulha de 26 calibre ligada a uma seringa de 10 mL na cavidade. Descarga da medula óssea em um tubo cônico de 50 mL com 5 mL de descarga média do osso. Irrigue duas tíbias e dois fêmures, de um rato, em cada tubo de 50 mL.
  7. Pipete subindo e descendo várias vezes ou vórtice da medula a uma velocidade lenta para dispersar delicadamente aglomerados. Sequências de caracteres de medula devem ser divididas em partículas pequenas (menos de 0,5 mm) de medula óssea. Encha o tubo cónico de 50 mL com osso flush médio. Pipeta conteúdo do tubo cônico em cultura de tecido2 75cm tratados de balão e incuba a 37 ° C, 5% de CO2 por 1h.
    Nota: Maduros macrófagos e células mesenquimais se tornarão aderentes no balão e ser descartadas, enquanto os progenitores hematopoiéticos desejados permanecem em suspensão.
  8. Pipete médio com progenitores hematopoiéticos em um tubo cónico de 50 mL. Centrifugar o tubo a 300 x g em temperatura ambiente por 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o em 5 mL de meio de cultura de fator (MCSF) da colônia de macrófagos (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL penicilina/estreptomicina e 150 μM monothioglycerol (MTG)).
  9. Contar as células usando um hemocytometer18. Adicione meio para Ressuspender as células a uma concentração de 0,5 x 106 células/mL, 1,5 x 107 células/balão em 30 mL de meio e pipetar para cima e para baixo suavemente. Pipete 30 mL da suspensão para um frasco de cultura de tecidos Tratado2 75 cm nova.
  10. No dia 4 e 7 cultura inicial na etapa 1.9, verifique se as células aderentes e ligeiramente ramificada usando um microscópio de campo claro de contraste de fase invertida. Descarte o meio contendo as células não-aderentes. Lavar as células com IMDM uma vez e adicione 30 mL de meio de cultura MCSF.
  11. Quando as células são maduras por dia 10 (> 95% positivo para F4/80 e Mac-1), verifique novamente que as células são aderentes e ligeiramente.
  12. Células para estímulos da placa, retire o frasco do meio de cultura e adicionar 8 mL de tampão de dissociação de célula livre, baseada em EDTA de enzima (Tabela de materiais). Incube as celulas por 5 min a 37 ° C, 5% de CO2.
  13. Raspe suavemente, as células com uma pequena quantidade de pressão, com uma espátula de célula estéril. Verifique no microscópio que células tem retirado a superfície do balão. Pipete células dissociadas em um tubo cónico de 50 mL. Lavar o balão 3 vezes com 5 mL de IMDM e piscina a solução de lavagem com as células que foram colhidas. Centrifugar as células a 300 x g, à temperatura ambiente por 5 min.
  14. Ressuspender as células em 3 mL de meio de cultura MCSF por tubo cónico de 50 mL. Contagem de células viáveis usando um hemocytometer18. Ressuspender as células em uma concentração de 1 x 106 células/mL e placa 100 μL de suspensão de célula (1 x 105 células/poço) por bem de uma cultura de tecido de 96 poços tratada, placa de fundo plano.
    Nota: Os ossos de um rato irão gerar células suficientes para 100 poços. Se desejado, 1 mL de células pode ser revestido em uma placa de 6 (cultura de tecidos tratados, plano inferior). Um maior número de células (1 x 106 ) pode ser útil para análises de borrão ocidental.
  15. Uma vez aderentes, estimule duplicados ou triplicados poços cada com 10 ng/mL de LPS em IMDM, 30 mg/mL de IVIg, ou IVIg + LPS. Doses de LPS ou IVIg podem ser titulados para otimizar as respostas. Deixe duplicados ou triplicados poços como unstimulated controles. Incube-los durante 24 h (37 ° C, 5% CO2).
    Nota: Células re-chapeadas devem aderir aos poços de cultura de tecidos dentro de 1h.
  16. Coletar sobrenadantes de células de cada poço em tubos de microcentrifuga individuais 1,7 mL e remover qualquer matéria particulada girando a 10.000 x g por 5 min.
  17. Remover a célula de sobrenadante e evitar perturbar a pelota. Coloque a célula esclareceu sobrenadante em um tubo estéril microcentrifuga.
    Nota: Sobrenadantes de células podem ser analisadas por citocinas, IL-10 e subunidade de citocinas, IL-12 / 23p 40, por ensaio imunoenzimático (ELISA) imediatamente ou armazenados no longo prazo-80 ° C. Segui o protocolo de ELISA do kit comercialmente disponível (Tabela de materiais). Outras citocinas pró-inflamatórias podem ser analisadas, tais como IL-6 e TNF, como eles também são reduzidos pelo tratamento co com IVIg + estimulação LPS em comparação com estimulação com LPS sozinhos. Após a estimulação, células aderentes podem ser preparadas por técnicas tais como a mancha ocidental ou quantitativa do polymerase reação em cadeia (Q-PCR) 19,20.

2. desafiando os ratos In Vivo com IVIg e colheita de macrófagos peritoneais

  1. Pese cada rato.
Calcule o volume de IVIg (concentração de ações de 100 mg/mL) necessária para fornecer uma dose final de 2,5 g/kg de peso corporal para cada rato.
Nota: por exemplo, para um rato de 20 g, 500 µ l de IVIg é necessário.
  • Desenhar a quantidade necessária de IVIg para uma seringa estéril 1 mL munida de uma estéril 26 medidor de agulha. Para os ratos de controle que não receberá IVIg, administre um volume de dose equivalente de solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS), pH 7,4 em vez de IVIg.
  • Nuca o mouse com uma mão agarrando sua pele na parte de trás do pescoço com o polegar e o dedo indicador e segurando sua cauda e patas com os dedos restantes. Incline seu corpo para o solo.
  • Coloque a agulha num ângulo de 30-40° em relação ao abdômen do rato, no quadrante inferior direito, bisel para cima e insira a 1,5 cm da agulha. Injete o IVIg ou PBS intraperitonealmente. Espere 1h.
  • Eutanásia em ratos com anestesia de isoflurano 5% seguida por 6-8 L/min de CO2 asfixia (ver passos 1.1.1 - 1.1.2), ou de acordo com as diretrizes éticas da instituição.
  • Pin o mouse para uma placa de espuma, com membros espalhados. Pulverize as peças com etanol a 70%.
    Nota: Execute o procedimento em uma capa de estéril.
  • Fazer um corte superficial na pele (0,2 cm) com uma tesoura ao longo da linha mediana do mouse, para evitar cortar a cavidade peritoneal. Puxe a pele abdominal de barriga do mouse usando a pinça, para que o revestimento da parede intacta peritoneal é visível.
  • Encha uma seringa de 5 mL com 5 mL de PBS estéril (pH 7,4). Inserir um 25 ou 27 medidor de agulha na parte superior da cavidade do lado direito em direção ao centro do mouse com o bisel da agulha ou a esquerda acima.
    Nota: Coloque a agulha cuidadosamente no mouse para que você não injectar PBS para os órgãos, mas em vez disso, para o espaço peritoneal.
  • Empurra o líquido na cavidade peritoneal. Puxe a agulha para fora da cavidade e massagem do peritônio por 10 s para desalojar todas as células. Insira a agulha na parte superior da cavidade e evitar os órgãos. Recolher e colocar o fluido de lavagem recuperado em um tubo cônico de 15 mL no gelo.
    Nota: Para cada 5 mL de fluido injetado, aproximadamente 3,75 mL será recuperado.
  • Repita a injeção e recuperação (etapas 2,8-2,9) 3 mais vezes (volume total de injeção de 20 mL), para recuperar 15 mL de líquido de lavagem no total. Colete lavagem de cada rato em um tubo cônico de 15ml separado.
    Nota: Após a última injeção, pode ser mais fácil extrair o líquido dos lados distante esquerdos e direito do mouse, onde líquido acumulado. Os órgãos causará menor interferência com a agulha nessa posição.
  • Girar as células para baixo a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 500 µ l de meio de chapeamento (IMDM, 10% FBS e 100 U/mL penicilina/estreptomicina) por rato liberado. Contagem de macrófagos viáveis usando um hemocytometer18.
    Nota: Os macrófagos será ligeiramente maiores do que as outras células peritoneais. Rendimento típico é de 5 x 105 - 1 x 106 macrófagos/rato usando um mouse de C57BL/6 tipo selvagem.
    Opcional: Se um grande número de células vermelhas do sangue está presente no centrifugado, execute uma etapa de Lise para removê-los, usando a Lise 1 x células vermelhas do sangue, de acordo com as instruções do fabricante.
  • Ressuspender as células em chapeamento médio em macrófagos de 1 x 10 6/mL e 100 μL por poço em uma placa de cultura de tecido tratada de fundo plano 96 poços da placa.
    Nota: Pode ser necessário para o pool de células de mais de um mouse para um experimento se usando triplicata poços ou estimulantes tituladas. Por exemplo, se um rato tinha 5 x 105 macrófagos, 500 μL de chapeamento médio seria necessária. Haveria células suficientes para 5 poços, ou 1 experimento em duplicado, com uma dose de LPS.
  • Incubar as células para 1 h a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que os macrófagos se tornar aderente. As células aderentes são os macrófagos peritoneais. Remova sobrenadantes de células e células não-aderentes. Lavar os poços duas vezes com 200 μL IMDM (pré aquecido a 37 ° C), esperar 10 s e lentamente incline o prato. Substitua o meio de chapeamento. Incube as células a 37 ° C, 5% de CO2 por 30 min antes da estimulação.
  • Estimular os macrófagos com 10 ng/mL de LPS em IMDM, ou deixar unstimulated, como um controle. Incubar durante 24 h, recolher e clarificar os sobrenadantes de célula (ver passos 1.16-1,17) para análise de citocinas IL-10 por ELISA. Segui o protocolo de ELISA do kit comercialmente disponível (Tabela de materiais).
    Nota: Após a estimulação, células aderentes podem ser preparadas por técnicas como borrão ocidental ou PCR.

    • 3. desafiando os ratos in Vivo com IVIg + LPS e colheita de macrófagos peritoneais

    1. Pese cada rato. Calcule o volume de IVIg (concentração de ações de 100 mg/mL) necessária para fornecer uma dose final de 2,5 g/kg de peso corporal. Calcule a quantidade de LPS (concentração de 100 μg/mL estoque na IMDM) necessária para fornecer uma dose final de 0,2 μg/g de massa corporal.
      Nota: por exemplo, para um rato de 20 g, 500 µ l de solução-mãe de IVIg e 40 μL de uma solução de 100 μg/mL de LPS é necessários.
    2. Desenhe a quantidade necessária de IVIg e LPS em uma seringa de 1ml estéril, equipado com um estéril 26 medidor de agulha. Para os ratos de controle que não receberá IVIg, substitua uma quantidade equivalente de IVIg com pH de PBS estéril 7,4.
    3. Nuca o mouse com uma mão agarrando sua pele na parte de trás do pescoço com o polegar e o dedo indicador e segurando sua cauda e patas com os dedos restantes. Incline seu corpo para o solo.
    4. Lugar a agulha em um ângulo de 30-40° em relação ao abdômen do rato, no quadrante inferior direito, chanfrado e inserir a 1,5 cm. Injete o IVIg + LPS, ou PBS + LPS, intraperitonealmente, como na etapa 2.4.
    5. Depois de 1h, colheita de macrófagos peritoneais executando etapas 2.5-2.10.
    6. Girar as células para baixo a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Retire 1 mL de líquido de lavagem recuperados e usar para IL-10 e IL-12/23-p 40 análises por ELISA de acordo com as instruções do fabricante ou congelar a-80 ° C para futuras análises.
      Nota: Para garantir a exata comparação entre tratamentos para análise de citocinas fluido de lavagem, execute flushs 5ml da cavidade peritoneal 4 vezes para um volume final de 15 mL. Nem todos os fluidos serão recuperados de cada descarga.
    7. Como na etapa 2.11, resuspenda e contar os macrófagos viáveis.
      Nota: Os macrófagos será ligeiramente maiores do que as outras células peritoneais.
    Rendimento típico é de 5 x 105 - 1 x 106 macrófagos/rato usando um mouse de C57BL/6 tipo selvagem.
    Opcional: Se um grande número de células vermelhas do sangue está presente no centrifugado, execute uma etapa de lise de acordo com as instruções do fabricante para removê-los, como na etapa 2.11.
  • Como na etapa 2.12, re-suspenda as células no chapeamento médio.
    Nota: Pode ser necessário para as células do pool de mais de um mouse para um experimento. Por exemplo, se um rato tinha 5 x 105 macrófagos, 500 μL de chapeamento médio seria necessária.
  • Como em 2.13, incubar as células para 1 h a 37 ° C 5% de CO2 para permitir que os macrófagos se tornar aderente.
  • Coletar e clarificar meio condicionado, conforme etapas 1.14-1,15, de todas as células peritoneais.
    Nota: As amostras podem ser usadas imediatamente ou congeladas e armazenadas a-80 ° C para análise de citocinas por ELISA.
  • Executar etapa 2.11, mas incubar células para unstimulated 24 h. Coletar e clarificar os sobrenadantes de células, como por etapas 1.16-1.17, para análise de citocinas por ELISA.
    Nota: As células podem ser preparadas para técnicas como borrão ocidental ou PCR, como em etapas 1.16-1.17 e 2.14.

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    Resultados

    Murino osso medula derivada de macrófagos podem ser cultivados de precursores de células hematopoiéticas em aspirados de medula óssea. Aspirados de medula óssea em pool de fêmures e tíbias de um rato C57BL/6 normalmente rendem 107 medula óssea derivada macrófagos, tornando-os uma fonte conveniente de macrófagos para experimentos. BMDMs podem ser usados para testar respostas de droga do anticorpo baseado quando desafiados com um estímulo inflamatório em vitro.

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    Discussão

    Estados de ativação de macrófagos desempenham um papel importante em ambos de homeostase e doença do tecido22. Os macrófagos podem ter distintas bem como sobreposição de Estados de ativação, dependendo de pistas em seu microambiente3. Eles têm papéis distintos em todas as fases da resposta inflamatória: defesa contra patógenos, ferida restituição cura e tecido, e também tem um estado de ativação anti-inflamatórios distintos que é importante para desligar a resposta inflamat...

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    Divulgações

    Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

    Agradecimentos

    L.K. é o destinatário do prêmio bolsa de estudo de pós-graduação da Universidade da Colúmbia Britânica comunhão 4-ano (4YF). LMS é o destinatário de uma associação canadense de Gastroenterologia / Crohn e colite Canadá / CIHR novo investigador salário prêmio e é um estudioso biomédicas da Fundação de Michael Smith para pesquisa em saúde. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do projeto da canadense serviços de sangue, em colaboração com o canadense institutos de pesquisa em saúde (conceder # CIHR2016-LS).

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    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Iscove' s Dulbecco modificado » s medium (IMDM)Life technologies12440053
    Fetal Bovine Serum (FBS)Life technologies12483-020
    Fator estimulador de colônias de macrófagos murinos recombinantes (MCSF)Stemcell technologies78059
    Penicilina-estreptomicinaLife technologies15140148
    Monotioglicerol (MTG)Sigma88640
    1X tampão de lise de glóbulos vermelhoseBioscience
    Tampão de dissociação celularLife technologies13150016Lipopolissacarídeo EDTA (LPS) sem enzimas, à base de Hanks,
    Sigma aldrichL 4516De E. coli 0127:B8
    IVIg (Gammunex)GrifolsRecebido do BC Children's Hospital, Medicina Transfusional
    IVIg (líquido Gammagard)Baxter Healthcare CorporationRecebido do BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
    IVIg (Octagam)OctapharmaRecebido do BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
    Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (estéril), pH 7.4Life technologies10010023
    camundongo IL-10 ELISABD biosciences555252
    camundongo IL-12 / 23p40 ELISABD biosciences555165
    anticorpo anti-Erk1 / 2Tecnologia de sinalização celular9101
    anticorpo anti-pp38Tecnologia de sinalização celular9211
    anticorpo anti-GAPDHFitzgerald industries10R-G109A
    26 g agulhaBD biosciences305110
    Seringa de 1 mLBD biosciences309659
    seringa de 10 mLBD biosciences309604
    tubo cônico de 15 mLBD biosciences352096
    tubo cônico de 50 mLBD biosciences352070
    tubo de microcentrífuga (1,7 mL)DiamedSPE155-N
    75 cm2 frasco tratado com cultura de tecidosBD biosciences353136
    Raspador de célulasBD biosciences353085
    ForceptsVWR82027-386ponta fina, dissecante 
    TesouraVWR82027-582Delicada, 4 1/2"
    Microscópio de campo claroMoticAE31Escala de contraste de fase invertida
     Mettler PE 3000

    Referências

    1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
    2. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
    3. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
    4. Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
    5. Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
    6. Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
    7. Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
    8. Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
    9. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
    10. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
    11. Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777(2013).
    12. Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
    13. Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
    14. Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
    15. Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
    16. Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
    17. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
    18. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
    19. Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160(2014).
    20. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
    21. Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
    22. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
    23. Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
    24. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
    25. Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
    26. Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
    27. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
    28. Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
    29. Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
    30. Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
    31. Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).

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