Drogas baseadas em anticorpos revolucionaram o tratamento de doenças inflamatórias. Além de ter efeito direto sobre a alvos específicos, os anticorpos podem ativar macrófagos tornar-se anti-inflamatórios. Este protocolo descreve como anti-inflamatórios macrófago ativação pode ser avaliada in vitro, usando os macrófagos da medula óssea de rato e in vivo usando os macrófagos peritoneais.
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Artigo de método
Avaliação dos efeitos de drogas baseados em anticorpo murino da medula óssea e ativação de macrófagos peritoneais
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os macrófagos são células do sistema imunológico inatas fagocíticas, iniciar respostas imunes a agentes patogénicos e contribuir para a restituição de cura e de tecido. Os macrófagos são igualmente importantes em desligar respostas inflamatórias. Mostramos que os macrófagos estimulados com imunoglobulina intravenosa (IVIg) podem produzir grandes quantidades das citocinas anti-inflamatórias, interleucina 10 (IL-10) e baixos níveis de citocinas pró-inflamatórias em resposta a lipopolissacarídeo bacteriano ( LPS). IVIg é que um anticorpo polivalente, principalmente imunoglobulina Gs (IgGs), pool de plasma de mais de 1.000 doadores de sangue. É usado para complementar os anticorpos em pacientes com deficiências imunológicas ou suprimir a resposta imune em pacientes com doenças auto-imunes ou inflamatórias. Infliximab, um anticorpo de alfa (TNFa) terapêutica anti-tumor necrose fator, também foi mostrado para ativar os macrófagos a produzir IL-10 em resposta a estímulos inflamatórios. IVIg e outros produtos biológicos baseados em anticorpo podem ser testados para determinar seus efeitos na ativação de macrófagos. Este artigo descreve métodos para derivação, estimulação e avaliação de medula murino macrófagos ativados por anticorpos em vitro e macrófagos peritoneais murino, ativados com anticorpos em vivo. Finalmente, vamos mostrar o uso da mancha ocidental para determinar a contribuição da célula específica, sinalização de caminhos para a atividade do macrófago anti-inflamatórios. Esses protocolos podem ser usados com ratos geneticamente modificados, para determinar o efeito de um somáticas específicas na ativação de macrófagos anti-inflamatórios. Essas técnicas também podem ser usadas para avaliar se os produtos biológicos específicos podem agir alterando os macrófagos para um estado de ativação anti-inflamatórias IL-10-produzindo que reduz respostas inflamatórias em vivo. Isso pode fornecer informações sobre o papel da ativação de macrófagos na eficácia de produtos biológicos durante modelos de doenças em camundongos e fornecer informações sobre um novo mecanismo de potencial de ação nas pessoas. Por outro lado, isto pode advertir contra o uso de produtos biológicos de baseados em anticorpos específicos para tratar doenças infecciosas, particularmente se os macrófagos desempenham um papel importante na defesa do hospedeiro contra a infecção.
Introdução
Os macrófagos são células do sistema imunológico inatas, que desempenham várias funções na resposta imune à infecção ou lesão. Os macrófagos são responsáveis por iniciar uma resposta imune a danos de infecção ou tecido, parando a resposta inflamatória e promover a cura de resposta1. Exemplos dos três Estados-ativação melhor estudados macrófago são: 1) macrófagos tratados com interferon gama (relato) e bacteriano lipopolissacarídeo (LPS), designado M (relato + LPS), que contribuem para a resposta inflamatória; 2) macrófagos estimulados com interleucina 4 (IL-4), M(IL-4), que são associados com a resposta de cura; 3) macrófagos estimulados com co....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Colúmbia Britânica.
1. medula óssea macrófago derivação e ativação com anticorpos
- Realize eutanásia usando CO2 asfixia.
- Rato de lugar na câmara de indução. Eutanásia em rato com anestesia de isoflurano 5%, para 60-90 s, até o imóvel e respirando são profundo e devagar.
- Desligue o isoflurano anestesia e administrar 6-8 L/min de CO2 até rato parou de respirar. Deixe mouse com CO2 pelo menos mais 5 min. verificar que não existe um batimento cardíaco ou res....
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Resultados
Murino osso medula derivada de macrófagos podem ser cultivados de precursores de células hematopoiéticas em aspirados de medula óssea. Aspirados de medula óssea em pool de fêmures e tíbias de um rato C57BL/6 normalmente rendem 107 medula óssea derivada macrófagos, tornando-os uma fonte conveniente de macrófagos para experimentos. BMDMs podem ser usados para testar respostas de droga do anticorpo baseado quando desafiados com um estímulo inflamatório em vitro.
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Discussão
Estados de ativação de macrófagos desempenham um papel importante em ambos de homeostase e doença do tecido22. Os macrófagos podem ter distintas bem como sobreposição de Estados de ativação, dependendo de pistas em seu microambiente3. Eles têm papéis distintos em todas as fases da resposta inflamatória: defesa contra patógenos, ferida restituição cura e tecido, e também tem um estado de ativação anti-inflamatórios distintos que é importante para desligar a resposta inflamat.......
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Divulgações
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
L.K. é o destinatário do prêmio bolsa de estudo de pós-graduação da Universidade da Colúmbia Britânica comunhão 4-ano (4YF). LMS é o destinatário de uma associação canadense de Gastroenterologia / Crohn e colite Canadá / CIHR novo investigador salário prêmio e é um estudioso biomédicas da Fundação de Michael Smith para pesquisa em saúde. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do projeto da canadense serviços de sangue, em colaboração com o canadense institutos de pesquisa em saúde (conceder # CIHR2016-LS).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Iscove' s Dulbecco modificado » s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Fator estimulador de colônias de macrófagos murinos recombinantes (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicilina-estreptomicina | Life technologies | 15140148 | |
| Monotioglicerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X tampão de lise de glóbulos vermelhos | eBioscience | ||
| Tampão de dissociação celular | Life technologies | 13150016 | Lipopolissacarídeo EDTA (LPS) sem enzimas, à base de Hanks, |
| Sigma aldrich | L 4516 | De E. coli 0127:B8 | |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Recebido do BC Children's Hospital, Medicina Transfusional | |
| IVIg (líquido Gammagard) | Baxter Healthcare Corporation | Recebido do BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Recebido do BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (estéril), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| camundongo IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| camundongo IL-12 / 23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anticorpo anti-Erk1 / 2 | Tecnologia de sinalização celular | 9101 | |
| anticorpo anti-pp38 | Tecnologia de sinalização celular | 9211 | |
| anticorpo anti-GAPDH | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g agulha | BD biosciences | 305110 | |
| Seringa de 1 mL | BD biosciences | 309659 | |
| seringa de 10 mL | BD biosciences | 309604 | |
| tubo cônico de 15 mL | BD biosciences | 352096 | |
| tubo cônico de 50 mL | BD biosciences | 352070 | |
| tubo de microcentrífuga (1,7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 frasco tratado com cultura de tecidos | BD biosciences | 353136 | |
| Raspador de células | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | ponta fina, dissecante |
| Tesoura | VWR | 82027-582 | Delicada, 4 1/2" |
| Microscópio de campo claro | Motic | AE31 | Escala de contraste de fase invertida |
| Mettler | PE 3000 |
Referências
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(201....
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Reimpressões e permissões
