Sequenciamento de genoma inteiro de Candida glabrata para deteção de marcadores de antifúngicos resistência às drogas

Chayanika Biswas; Sharon C-A. Chen; Catriona Halliday; Elena Martinez; Rebecca J. Rockett; Qinning Wang; Verlaine J. Timms; Rajat Dhakal; Rosemarie Sadsad; Karina J. Kennedy; Geoffrey Playford; Deborah J. Marriott; Monica A. Slavin; Tania C. Sorrell; Vitali Sintchenko

doi:10.3791/56714

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Artigo de método

Sequenciamento de genoma inteiro de Candida glabrata para deteção de marcadores de antifúngicos resistência às drogas

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DOI:

10.3791/56714

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28 de dezembro de 2017

Chayanika Biswas^*¹ , Sharon C-A. Chen^*¹^,²^,³ , Catriona Halliday¹^,² , Elena Martinez¹ , Rebecca J. Rockett¹ , Qinning Wang¹ , Verlaine J. Timms¹ , Rajat Dhakal¹ , Rosemarie Sadsad¹ , Karina J. Kennedy⁴ , Geoffrey Playford⁴^,⁵ , Deborah J. Marriott⁶ , Monica A. Slavin⁷ , Tania C. Sorrell¹^,³ , Vitali Sintchenko¹^,²^,³

¹Centre for Infectious Diseases and Microbiology-Public Health, Westmead Hospital, ²Centre for Infectious Diseases and Microbiology Laboratory Services, ICPMR, ³Marie Bashir Institute for Infectious Diseases and Biosecurity, The University of Sydney, ⁴Department of Microbiology and Infectious Diseases, Canberra Hospital and Health Services, Australian National University Medical School, ⁵Infection Management Services, Australian National University Medical School, ⁶Department of Microbiology and Infectious Diseases, St. Vincent's Hospital, ⁷Department of Infectious Diseases, Peter MacCallum Cancer Centre

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo implementado sequenciamento do genoma inteiro para análise de mutações em genes que conferem resistência a drogas antifúngicas no Candida glabrata. Isolados de c. glabrata resistentes à echinocandins, azóis e 5-flucitosina, foram sequenciados para ilustrar a metodologia. Perfis de susceptibilidade dos isolados correlacionaram com a presença ou ausência de padrões específicos de mutação nos genes.

Resumo

Candida glabrata pode rapidamente adquirir mutações que resultam em resistência às drogas, especialmente de azóis e echinocandins. Identificação de mutações genéticas é essencial, como resistência detectada em vitro muitas vezes pode ser correlacionado com o fracasso clínico. Nós examinamos a viabilidade do uso de sequenciamento do genoma inteiro (WGS) para análise de todo o genoma de resistência a drogas antifúngicas no c. glabrata. O objectivo era torecognize facilitadores e barreiras na implementação do GTS e mede a sua eficácia. Este paper descreve os pontos de verificação de chave de controle de qualidade e componentes essenciais da metodologia WGS para investigar marcadores genéticos associados com reduzida susceptibilidade aos agentes antifúngicos. Também estima-se que a precisão da análise de dados e turn-around-time de testes.

Suscetibilidade fenotípica de 12 clínicos e uma cepa ATCC de c. glabrata foi determinada através de testes de susceptibilidade. Estes incluídos três isolam pares, de três pacientes, que se desenvolveu a ascensão em concentrações inibitórias mínimas de drogas. Em dois pares, o segundo isolar cada par desenvolvido resistência a echinocandins. O segundo isolado do terceiro par desenvolveu resistência ao 5-flucitosina. O restante composto por sensíveis e resistentes azólicos isolados. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) nos genes ligados à resistência echinocandin, AZOL e 5-flucitosina foram confirmados em isolados resistentes através de WGS utilizando o sequenciamento de geração seguinte. Non-sinônimo SNPs em resistência antifúngica genes tais como FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 e FCY2 foram identificados. Em geral, uma média de 98% das leituras WGS dos isolados de c. glabrata , mapeados para o genoma de referência com uma cobertura de cerca 75-fold leitura de profundidade. O tempo de retorno e custo eram comparáveis aos Sanger sequenciamento.

Em conclusão, WGS de c. glabrata era viável em revelar clinicamente significativas mutações envolvida na resistência à classes de diferentes drogas antifúngicas, sem a necessidade de múltiplas reações de PCR/DNA arranjar em sequência. Isto representa um passo positivo para estabelecer capacidade de WGS no laboratório clínico para a deteção simultânea de substituições confere resistência antifúngico.

Introdução

Candida glabrata é um patógeno encontrado cada vez mais importância como uma espécie que apresenta resistência as azóis bem mais recentemente, como o echinocandins¹^,²^,³. Ao contrário do diploide c. albicans, o genoma haploide de c. glabrata pode permitir adquirir mutações e desenvolver resistência a múltiplas drogas mais facilmente. Co resistência para ambas as classes de drogas também tem sido relatado⁴. Portanto, avaliação precoce de susceptibilidade e detecção de resistência a drogas em c. glabrata são cruciais pa....