Este manuscrito descreve o uso de repórteres fluorogenic geneticamente codificado em um aplicativo de imagem latente da viver-pilha para o exame de estresse oxidativo induzido por xenobiótico. Esta abordagem experimental oferece inigualável resolução spatiotemporal, sensibilidade e especificidade, evitando muitas das deficiências dos métodos convencionais utilizados para a detecção de estresse oxidativo toxicológico.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem
Neste artigo
Resumo
Resumo
Enquanto o estresse oxidativo é um mecanismo comumente citado toxicológico, métodos convencionais para estudá-lo sofrem uma série de deficiências, incluindo a destruição da amostra, introdução de artefatos potenciais e uma falta de especificidade para a reativa espécie em questão. Assim, há uma necessidade atual no campo da toxicologia de métodos não-destrutivos, sensíveis e específicos que pode ser usado para observar e quantificar as perturbações redox intracelular, mais comumente referidas como estresse oxidativo. Aqui, apresentamos um método para o uso de dois sensores fluorogenic geneticamente codificado, roGFP2 e HyPer, para ser usado em estudos de imagiologia viver-pilha para observar respostas oxidativas induzida por xenobiótico. roGFP2 se equilibra com potencial de redox da glutationa (EGSH), enquanto HyPer detecta diretamente o peróxido de hidrogênio (H2O2). Ambos os sensores podem ser expressa em vários tipos de célula através de transfeccao ou transdução e podem ser direcionados para compartimentos celulares específicos. O mais importante, viver-pilha microscopia usando estes sensores oferece alta resolução espacial e temporal que não é possível usar os métodos convencionais. Mudanças na intensidade da fluorescência monitorados em 510 nm serve como a leitura para ambos os sensores fluorogenic geneticamente codificado quando sequencialmente animado por 404 nm e 488 nm de luz. Esta propriedade faz com que ambos os sensores ratiometric, eliminando artefatos comuns da microscopia e corrigir as diferenças na expressão de sensor entre as células. Esta metodologia pode ser aplicada através de uma variedade de plataformas fluorométrica capazes de emissões emocionantes e coleta em comprimentos de onda prescritos, tornando-o adequado para uso com sistemas de imagem confocal, microscopia de campo amplo convencional e placa leitores. Ambos os sensores fluorogenic geneticamente codificado utilizaram-se em uma variedade de tipos de células e estudos toxicológicos para monitorar celular EGSH e a H2O2 geração em tempo real. Descritas aqui, é um método padronizado que é amplamente adaptável em plataformas fluorométrica de aplicação do roGFP2 e HyPer nas avaliações toxicológicas de viver-pilha de estresse oxidativo e tipos de células.
Introdução
O termo "estresse oxidativo" é frequentemente citado como um mecanismo em toxicologia, mas raramente é este termo descrito especificamente. Estresse oxidativo pode se referir a vários processos intracelulares, incluindo a geração de espécies reativas de oxigênio, danos causados pelos radicais livres, a oxidação de moléculas antioxidantes, e mesmo a ativação de sinalização específicas cascatas. Uma ampla gama de contaminantes ambientais1,2 e3,de agentes farmacêuticos4 foram documentadas para induzir o estresse oxidativo por qualquer ação direta do compo....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. preparação das células
Nota: Este procedimento descreve a transdução Lentivirus de uma linhagem de células imortalizado (BEAS-2B; ATCC, Manassas, VA) para expressar o repórter desejado (roGFP2 ou HyPer). Outras linhas/tipos de células e/ou métodos de transferência de genes, incluindo transfeccao, podem ser utilizados desde que resultam em um nível de expressão do repórter adequada para visualizar um número suficiente de sensor-expressando células por campo de visão (tipicamente 5-10 células). Se usando métodos do transfection, o procedimento deve ser realizado no prato que em última análise, será usado para o método de análise (por exemplo....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O uso de roGFP2 e HyPer em detectar alterações EGSH e intracelular H2O2 tem sido bem descrito anteriormente25,36,42,43 e é demonstrado aqui. Imagens confocal de células expressando roGFP2 na linha de base e seguir adição de H2O2 e TDT são mostradas na Figura 2. Dados de imagens .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O uso de roGFP2 e HyPer na detecção de alterações em intracelular EGSH e H2O2, respectivamente, foi bem descrito em anteriores estudos fisiológicos e toxicológicos 25,35,36 ,39,40,41,42,43. O protocolo descrito aqui relata .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
A pesquisa descrita neste artigo foi revista pelo nacional de saúde e laboratório de pesquisa de efeitos ambientais, agência de proteção ambiental dos Estados Unidos e aprovada para publicação. O conteúdo deste artigo não deve ser interpretado para representar a política da Agência, nem faz menção de nomes comerciais ou produtos comerciais constituem endosso ou recomendação para o uso.
Agradecimentos
Os autores gostaria de agradecer Katelyn Lavrich para obter assistência com delineamento experimental e edições de manuscrito.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| RoGFP2 Plasmídeo | Universidade de Oregon | N/A | Generoso presente de S.J. Remington |
| HyPer Plasmídeo | Evrogen | FP941 | |
| Peróxido de Hidrogênio | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Ditiotreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Fenantrenequinona | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Preto Pratos de Parede com Fundo de Vidro | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B linha celular | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements Software de imagem AR | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Sistema de imagem confocal | Nikon | N/A |
Referências
- Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
- Kobzik, L.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
